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Articolo metodologico

Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione

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DOI:

10.3791/56256

⸱

23 febbraio 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Department of Infectious Disease, J. Craig Venter Institute

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l'emagglutinina del virus dell'influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.

Abstract

Gli anticorpi svolgono un ruolo cruciale nell'accoppiamento la risposta immunitaria innata e adattativa contro gli agenti patogeni virali attraverso i loro domini di legame dell'antigene e Fc-regioni. Qui, descriviamo come misurare l'attivazione di Fc funzioni effettrici dagli anticorpi monoclonali targeting l'emoagglutinina di virus dell'influenza con l'uso di una linea di cellule Jurkat geneticamente esprimendo un'attivazione digitare 1 Fc-FcγR. utilizzando questo metodo, la contributo delle specifiche interazioni Fc-FcγR conferito dalle immunoglobuline può essere determinata usando un'analisi in vitro .

Introduzione

Immunità prevista dal vaccino influenzale stagionale tradizionalmente è stata valutata dal emoagglutinazione inibizione (HI) analisi1, che misura la presenza di anticorpi che il sito di legame del recettore del hemagglutinin di destinazione. Questi anticorpi HI-attivo possono conferire immunità sterilizzante, ma sono generalmente stretti nella loro ampiezza di protezione, fornire l'immunità per solo un selezionare alcuni ceppi del virus dell'influenza. L'isolamento e la caratterizzazione di largamente reattivi anticorpi monoclonali che riconoscono l'emoagglutinina (HA) suggerire che lo sviluppo di un vaccino antinfluenzale universale è a portata di mano2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. uno degli obiettivi principali di un vaccino antinfluenzale universale è quello di indurre una risposta anticorpale forte verso le regioni conservate del virus influenzale9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. in linea di massima gli anticorpi reattivi che riconoscono questi epitopi conservati, composto di neutralizzazione e non neutralizzando gli anticorpi17,18, hanno dimostrati di richiedono interazioni Fc-FcγR per ottimale protezione in vivo ed evidenziare il contributo di immunità Fc per la complessiva risposta immunitaria al virus influenzale19,20.

Componenti di protezione sono fondamentali per valutare l'immunità all'infezione. Questi indicatori consentono a scienziati e clinici valutare l'efficacia dei vaccini, il significato dei dati e il corso del trattamento. Il solo correlazione stabilito di protezione contro l'infezione da virus influenzale è l'analisi di inibizione di emagglutinazione. Un titolo di 01:40 è associato con una riduzione del 50% del rischio di malattia1,21 – e riflette la presenza di anticorpi che inibiscono agglutinazione prendendo di mira il recettore vincolante sito situato sulla testa globulare della HA. Tuttavia, dovrebbe anche essere notato che le risposte delle cellule T possono essere una componente migliore di protezione contro l'infezione da virus influenzale negli anziani. Interessante, un recente rapporto suggerisce che l'attività di inibizione della neuraminidasi può essere un migliore indicatore di immunità all'influenza22. Fortunatamente, tipico in vitro dosaggi come analisi di inibizione di neutralizzazione o neuraminidasi possono misurare anticorpi specifici del gambo o neuraminidasi HA. La maggior parte di questi saggi convenzionali in vitro , tuttavia, solo prendere in considerazione la funzione della regione di associazione dell'antigene dell'anticorpo e non misurano il ruolo della regione Fc. Inoltre, il contributo degli anticorpi non neutralizzanti che proteggere tramite Fc recettore fidanzamento in vivo non sono rilevati17,18. Al fine di misurare la protezione garantita dagli anticorpi che inducono immunità Fc quali citotossicità di anticorpo dipendente cellulo-mediata (ADCC), è necessaria un'analisi robusta in vitro .

Il metodo descritto di seguito valuta la capacità di anticorpi monoclonali murini di indurre funzioni Fc-mediata attraverso l'uso di una linea di cellule Jurkat geneticamente esprimendo un'attivazione murino digitare 1 FcR, FcγRIV. Impegno di anticorpo del FcγR trasduce quel fattore nucleare di trigger di attività luciferasica attivato T-cellule-mediata di segnalazione intracellulare. Il saggio ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali che richiedono isolamento e coltura di cellule effettrici primarie e l'uso di citometria a flusso per rilevare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata19,,23,24 ,25,26. In primo luogo, il protocollo descritto qui può essere facilmente adattato per incorporare diversi bersagli virali, FcγRs e anticorpi appartenenti a specie diverse (umane e murine). In secondo luogo, l'uso di una modifica per la cella di Jurkat linea esprimendo un FcγR con un gene reporter luciferasi sotto un fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) consente per un saggio di grande formato che possa essere facilmente analizzato utilizzando un lettore di luminescenza di misura. Qui, l'attivazione tradizionale di cellule effettrici primario viene sostituito con l'induzione di NFAT-luciferasi all'impegno dell'anticorpo di un FcγR sulla superficie della cellula Jurkat. Questo test di formato piastra a 96 pozzetti consente la misurazione di fino a quattro diversi campioni in triplici copie con sette diluizioni – un numero di campioni che potrebbe essere ingombrante usando le tecniche tradizionali. Ci sono ulteriori punti da considerare con questo test che può influenzare la progettazione di esperimenti e l'interpretazione dei dati. Il bersaglio virale deve essere espresso sulla superficie delle cellule in ordine per riconoscimento anticorpale. Per ovviare a questo inconveniente, l'antigene bersaglio (ad es. una proteina virale interna) può essere rivestito direttamente sulla superficie di una piastra. Tuttavia, questo non è ancora stato rigorosamente testato. Inoltre, la modifica per la linea cellulare Jurkat esprime un solo tipo di attivazione FcγR e non esprime alcun FcγRs inibitorio, mentre linee cellulari primarie esprimono tutti i recettori in un contesto fisiologico.

Precedentemente abbiamo usato questo test per dimostrare che l'epitopo specificità in un contesto policlonale svolge un ruolo cruciale nella regolazione di funzioni effettrici Fc-mediata e che l'attivazione ottimale della risposta cellulo-mediata anticorpo-dipendente richiede due punti di Contattare27,28. Qui, descriviamo un metodo che valuta la capacità degli anticorpi monoclonali specifici del gambo per coinvolgere e attivare murino attivazione FcγRIV. Anche se ci sono eccezioni29,30, un gran numero di anticorpi reattivi largamente la regione gambo antigenicamente conservata del hemagglutinin di destinazione e quindi gioca un ruolo importante nello sviluppo di una influenza universale vaccino.

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Protocollo

Gli esperimenti preformati in questo manoscritto sono stati fatti il codice istituzionale seguente Icahn School of Medicine di etica e regolamenti.

1. espressione di Influenza Virus Hemagglutinin tramite transfezione o infezione

Transfezione:

  1. Cellule embrionali umane del rene (HEK 293T) piastra ad una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto in una cultura di tessuto bianca trattati piastra a 96 pozzetti e lasciate riposare per 4 h in un incubatore a 37 °C (con 5% CO2).
  2. Transfect cellule con 100 ng di DNA codificante per emoagglutinina virale e 0,2 μL di reagente di transfezione per pozzetto in un volume totale di 50 μL.
    Nota: Entrambi plasmide e trasfettante reagente sono diluiti in 1 x Opti-minimo essenziale Media (MEM) ridotto del siero medio.
  3. Dopo incubazione piastre in un incubatore a 37 °C con 5% CO2 per 18 h, rimuovere i supporti di transfezione.

2. infezione

  1. Cellule di rene canino piastra A549 o Madin Darby ad una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto in una cultura di tessuto bianca trattati piastra a 96 pozzetti e crescono per almeno 18 h in incubatore a 37 °C con 5% CO2.
  2. Virus diluito in 1 x MEM e infettare le cellule ad una molteplicità di infezione di 0,33 per 1h in un incubatore a 37 °C con 5% di CO2, 1 o 3. Volume totale deve essere uguale a 100 μL.
    Nota: x 10 MEM è diluito con acqua per fare un 1 x stock lavoro MEM diluizioni di virus citati sopra.
  3. Dopo l'infezione, rimuovere l'inoculo e aggiungere 100 μL di 1 x MEM nella piastra in assenza di tripsina.
  4. Crescere le cellule infettate per 18-24 h in un incubatore a 37 °C con 5% CO2.

3. valutando l'attivazione FcRg/NFAT-mediata di attività luciferasica di anticorpi monoclonali o sieri

  1. In primo luogo, è possibile sostituire mezzi di sviluppo delle cellule trasfettate o infetti con 25 µ l di media di dosaggio (1 x RPMI 1640 supplementato con 4% (vol/vol) basso IgG fetale bovino sieri).
  2. In una piastra a 96 pozzetti separata, eseguire diluizioni quadruplo degli anticorpi di interesse a partire a 30 μg/mL utilizzando il supporto di analisi. Effettuare diluizioni in triplici copie ed un esempio di disposizione di piastra è illustrata in Figura 1A. Assicurati di includere un controllo che esclude anticorpo (nessun controllo dell'anticorpo) così come un controllo di sfondo (tampone del saggio da solo).
    Nota: per entrambi il 'nessun anticorpo' e controlli di sfondo, aggiungere 25 µ l di tampone di dosaggio invece di anticorpo.
  3. Trasferimento 25 μL di anticorpi diluiti in serie da passo 3.2 a rispettivi pozzetti su piatto di cellule trasfettate o cellule infettate.
  4. Incubare la piastra in un incubatore a 37 °C (con 5% CO2) per 15 min.
  5. Aggiungere 25 μL della cella appropriata dell'effettore modificate Jurkat esprimendo murino FcgRIV o FcgRIIIa umano (75.000 di cellule/pozzetto). Volume totale per ogni bene dovrebbe essere 75 µ l e la concentrazione iniziale e finale dell'anticorpo è a 10 µ g/mL (Figura 1B).
    Nota: Per il controllo di sfondo, aggiungere 25 µ l di tampone di dosaggio invece di cellule effettrici. Per esaminare la fagocitosi cellulo-mediata anticorpo-dipendente, può essere utilizzato un cellulare Jurkat modificate esprimendo la FcgRIIa umana.
  6. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2 per 6 h.
  7. Disgelo e tampone substrato caldo luciferasi in un'acqua di 37 °C per circa 1 h prima dell'uso.
    Nota: Per rendere il tampone del substrato di luciferasi, ricostituire il liofilizzato luciferase assay substrato nel tampone fornito. Tampone substrato ricostituito può essere conservato a-30 °C a-10 °C fino a sei settimane.
  8. Aggiungere 75 μL/pozzetto di tampone substrato luciferasi in tutti i pozzetti tranne per il controllo di sfondo.
  9. Continua a leggere un luminometro.
  10. Calcolare l'induzione di piega con la seguente equazione: piegare induzione = (valore di valore-sfondo indotto) / (nessun valore di valore-sfondo di mAb).

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Risultati

Abbiamo dimostrato che un gambo specifiche mAb, 6F12, ma non testa testa-specifiche mAb, PY102, era in grado di attivare le cellule natural killer di primarie aumentando CD107a e interferone γ19. Per modellare la capacità di un anticorpo specifico del gambo di attivare le cellule NK umane primarie, ci mostrano che un mAb specifici del gambo, 6F12, robustamente può attivare la cella di Jurkat modificata esprimendo la murino FcγRIV da ~ 14-fold. D'altra parte, il mAb di testa-specifico, PY102 e il c...

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Discussione

Il metodo qui descritto consente di misurare la capacità di un anticorpo monoclonale specifico HA per coinvolgere il FcγRIV murino. L'antigene bersaglio, emoagglutinina di virus influenzale, è espresso sulla superficie delle cellule dopo l'infezione da virus o transfezione del DNA del plasmide. Il dosaggio ulteriormente è favorevole all'utilizzo di diverse proteine virali di superficie espressa in combinazione con altri FcγRs (esseri umani o murino). Inoltre, abbiamo utilizzato campioni di siero per valutare la capacità ...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali dal National Institute of Allergy e malattie infettive, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sotto CEIRS contratto P01AI097092-04S1 (p.e.l.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Celle A549ATCCCCL-185Cellule epiteliali basali alveolari umane adenocimiche
Cellule HEK 293TATCCCRL-3216Cellule renali embrionali umane
Lipofectamina 2000Life Technologies 11668019Reagente di trasfezione
1X Opti-MEM Siero ridotto Medium ThermoFisherScientific51985-034
Piastra a 96 pozzetti trattata con coltura di tessuti bianchiCorning, Inc.3917Piastre per saggi
10X MEMGibco11430-030
Jurkat che esprime cellule murine FcgRIVPromegaM1201Il kit include cellule, il sistema di analisi Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e basso siero IgG
Jurkat che esprime cellule umane FcgRIIIaPromegaG7010fornisce include cellule, sistema di saggio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e siero
a basso contenuto di IgGIl kit Jurkat che esprime cellule umane FcgRIIaPromegaG9901include cellule, sistema di analisi della luciferasi Bio-Glo, 1X RPMI e siero a basso contenuto di IgG
Luminometro LettoreBioTekSynergy H1 Lettore dipiastre di luminescenza
analisi della luciferasi Bio-Glo PromegaG7940Contiene tampone per il saggio della luciferasi e substrato del test della luciferasi
Cellulerenali canine Madin DarbyATCCCCL-34Cellule renali canine
multimodale Sistema di

Riferimenti

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