Descriviamo un metodo per misurare l'attivazione di funzioni effettrici Fc-mediata dagli anticorpi che hanno come destinazione l'emagglutinina del virus dell'influenza. Questo dosaggio può essere adattato anche per valutare la capacità di anticorpi monoclonali o policlonali sieri altre glicoproteine di superficie virale di targeting di indurre immunità Fc.
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Articolo metodologico
Un metodo per valutare le funzioni effettrici Fc-mediata indotte dagli anticorpi specifici di Hemagglutinin di riossidazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli anticorpi svolgono un ruolo cruciale nell'accoppiamento la risposta immunitaria innata e adattativa contro gli agenti patogeni virali attraverso i loro domini di legame dell'antigene e Fc-regioni. Qui, descriviamo come misurare l'attivazione di Fc funzioni effettrici dagli anticorpi monoclonali targeting l'emoagglutinina di virus dell'influenza con l'uso di una linea di cellule Jurkat geneticamente esprimendo un'attivazione digitare 1 Fc-FcγR. utilizzando questo metodo, la contributo delle specifiche interazioni Fc-FcγR conferito dalle immunoglobuline può essere determinata usando un'analisi in vitro .
Introduzione
Immunità prevista dal vaccino influenzale stagionale tradizionalmente è stata valutata dal emoagglutinazione inibizione (HI) analisi1, che misura la presenza di anticorpi che il sito di legame del recettore del hemagglutinin di destinazione. Questi anticorpi HI-attivo possono conferire immunità sterilizzante, ma sono generalmente stretti nella loro ampiezza di protezione, fornire l'immunità per solo un selezionare alcuni ceppi del virus dell'influenza. L'isolamento e la caratterizzazione di largamente reattivi anticorpi monoclonali che riconoscono l'emoagglutinina (HA) suggerire che lo sviluppo di un vaccino antinfluenzale universale è a portat....
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Protocollo
Gli esperimenti preformati in questo manoscritto sono stati fatti il codice istituzionale seguente Icahn School of Medicine di etica e regolamenti.
1. espressione di Influenza Virus Hemagglutinin tramite transfezione o infezione
Transfezione:
- Cellule embrionali umane del rene (HEK 293T) piastra ad una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto in una cultura di tessuto bianca trattati piastra a 96 pozzetti e lasciate riposare per 4 h in un incubatore a 37 °C (con 5% CO2).
- Transfect cellule con 100 ng di DNA codificante per emoagglutinina virale ....
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Risultati
Abbiamo dimostrato che un gambo specifiche mAb, 6F12, ma non testa testa-specifiche mAb, PY102, era in grado di attivare le cellule natural killer di primarie aumentando CD107a e interferone γ19. Per modellare la capacità di un anticorpo specifico del gambo di attivare le cellule NK umane primarie, ci mostrano che un mAb specifici del gambo, 6F12, robustamente può attivare la cella di Jurkat modificata esprimendo la murino FcγRIV da ~ 14-fold. D'altra parte, il mAb di testa-specifico, PY102 e il c.......
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Discussione
Il metodo qui descritto consente di misurare la capacità di un anticorpo monoclonale specifico HA per coinvolgere il FcγRIV murino. L'antigene bersaglio, emoagglutinina di virus influenzale, è espresso sulla superficie delle cellule dopo l'infezione da virus o transfezione del DNA del plasmide. Il dosaggio ulteriormente è favorevole all'utilizzo di diverse proteine virali di superficie espressa in combinazione con altri FcγRs (esseri umani o murino). Inoltre, abbiamo utilizzato campioni di siero per valutare la capacità .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali dal National Institute of Allergy e malattie infettive, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sotto CEIRS contratto P01AI097092-04S1 (p.e.l.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Celle A549 | ATCC | CCL-185 | Cellule epiteliali basali alveolari umane adenocimiche |
| Cellule HEK 293T | ATCC | CRL-3216 | Cellule renali embrionali umane |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668019 | Reagente di trasfezione |
| 1X Opti-MEM Siero ridotto Medium ThermoFisher | Scientific | 51985-034 | |
| Piastra a 96 pozzetti trattata con coltura di tessuti bianchi | Corning, Inc. | 3917 | Piastre per saggi |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Jurkat che esprime cellule murine FcgRIV | Promega | M1201 | Il kit include cellule, il sistema di analisi Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e basso siero IgG |
| Jurkat che esprime cellule umane FcgRIIIa | Promega | G7010 | fornisce include cellule, sistema di saggio Bio-Glo Luciferase, 1X RPMI e siero |
| a basso contenuto di IgGIl kit Jurkat che esprime cellule umane FcgRIIa | Promega | G9901 | include cellule, sistema di analisi della luciferasi Bio-Glo, 1X RPMI e siero a basso contenuto di IgG |
| Luminometro Lettore | BioTek | Synergy H1 Lettore di | piastre di luminescenza |
| analisi della luciferasi Bio-Glo Promega | G7940 | Contiene tampone per il saggio della luciferasi e substrato del test della luciferasi | |
| Cellule | renali canine Madin DarbyATCC | CCL-34 | Cellule renali canine |
Riferimenti
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al.
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Ristampe e permessi
Tag
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