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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出

Published: September 29, 2017 doi: 10.3791/56373
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 3, 1
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories
* These authors contributed equally

Summary

ここでは、単純な高速かつ効率的なプリオンの増幅技術、リアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) メソッドを記述するプロトコルを提案する.

Abstract

RT QuIC 法は、機密性の高い体外無細胞プリオン増幅試金シードの折りたたみと変換のためテンプレートとしてプリオン種子を用いた組換えプリオン蛋白質 (PrP) 基板の集計は主に基づいています。RT QuIC はリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に類似しているスループットの高い手法です。アミロイド線維の成長の検出は、Thioflavin T は、ᵦ シート豊富なタンパク質との特異的相互作用時に蛍光を発する色素に基づいています。したがって、アミロイド線維形成をリアルタイムで検出することができます。糞便抽出物の慢性消耗病 (CWD) プリオンを検出するための信頼性の高い非侵襲的なスクリーニング テストの開発を試みた。ここでは、我々 は具体的には PrPSc CWD の糞便内活動を播種感染シカ科を明らかにする RT QuIC 法を適応しています。当初、我々 は準備糞便抽出物の播種活動だった糞便材料の潜在的なアッセイの阻害によって RT-QuIC で比較的低かった。糞便抽出物の播種活動を改善し、潜在的なアッセイの阻害剤を削除は、洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーに糞便を均質化。また、ナトリウム リンタングステン酸と遠心力を使用して蛋白質の沈殿物に基づいて PrPScを集中する方法をサンプルを提出しました。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板交換を検出の感度を改善するためにプロトコルに含まれてによって調べた。したがって、我々 は RT QuIC、CWD の非侵襲的診断のための実用的なツールをすることができますでの前臨床・臨床のシカ科の糞便内活動を播種 CWD プリオンの高感度検出のためのプロトコルを確立しました。

Introduction

プリオン病または伝染性海綿状脳症 (TSE) は、牛海綿状脳症 (BSE) 牛、スクレイピー羊とヤギ、無駄に慢性的な人間のクロイツ フェルト ・ ヤコブ病 (CJD) を含む神経変性疾患シカ科1,2病 (CWD)。Tse は、特徴的な海綿状外観と脳のニューロンの損失によって特徴付けられます。「タンパク質のみ」の仮説によれば、プリオンは主に PrPSc (スクレイピーの ' Sc') 3、PrPCホストでエンコードされたプリオン蛋白変性アイソ フォーム成る。PrPScは PrPCのバインドし、他の PrPC分子に変換するシードとして機能できる ᵦ シート4,5,6の濃縮形態への変換に起因します。新しく生成された PrPSc分子は小さいオリゴマー、感染核の高い数値で結果に分解成長ポリマー 7、8に組み込まれます。PrPSc集計しやすいプロテアーゼ9,10に部分的に耐性があります。

CWD に影響を与える野生と養殖のエルク (Cervus canadensis)、ミュールジカ (ジューテリウム ドルノゴビ)、オジロジカ (WTD;ジューテリウムで子鹿) (Alces alces) ムースやトナカイ (となかい座 tarandus tarandus) 11,12,13。それはシカの相互作用と感染14,15の環境の永続性によって支持される水平伝播と最も伝染のプリオン病と見なされます。その他プリオン PrPSc蓄積と感染が脳に限られているとは異なり CWD にこれらにも、末梢組織や体液など唾液、尿、糞便16,17,18。

免疫組織化学は、CWD PrPSc分布と海綿状病変19,20を検出する診断のゴールド スタンダードと見なされます。ELISA よりまれに、西部のしみ CWD 診断に使われまた。したがって、現在のプリオン病の診断は主に事後組織でプリオンを検出に基づいています。CWD の殺診断は、扁桃腺や直腸肛門粘膜関連リンパ組織 (RAMALT) バイオプシー;ただし、このプロシージャは侵襲性があり、動物の捕獲が必要です。したがって、尿や糞便などの簡単にアクセスできる検体の使用は、CWD プリオン検出のための実用的な方法でしょう。しかし、これら糞尿港プリオン現在診断法の検出限界値以下の濃度が比較的低い。その結果より高感度・高スループットの診断ツールが必要です。変換システムの in vitroタンパク質フォールディング繰返し増幅など分析 (PMCA) 21、アミロイド播種法とリアルタイムで揺れる誘起変換 (RT QuIC) 試金22,23,24はプリオン変換プロセス体外を模倣する PrPScの自己増殖する能力を悪用し、それによりごく微量検出レベル25 に PrPScの存在を増幅する非常に強力なツール ,26。RT QuIC 法はただし、変換製品の β シートの二次構造の濃縮が thioflavin T (Th T) をバインドできる具体的事実を活用します。したがって、組み換え PrP (rPrP) シードの変換時に、バインド Th T と、検出できるリアルタイムで Th T 時間をかけて相対的な蛍光ユニット (RFU) として表現の蛍光を測定することによってアミロイド線維に生えています。監視、RFU は相対的な播種活動と遅れ位相など定量的パラメーターを評価する使用できます。遅れ位相は、どの rPrP Th T 蛍光の検出限界値以下は反応の早い段階で変換のしきい値に到達するために必要な時間 (h) を表します。明らかラグの段階では、十分なアミロイド核 (核/伸び) の形成に付随の終わりは、Th T 蛍光閾値レベルを超えているし、ポジティブになるときに発生します。アミロイド線維は実際の時間と初期の PrPScやサンプルに含まれているシードの活動で検出できるの成長はより多くの種を生成するセグメンテーションによって増幅されます。これらの種は順番、アミロイド線維の成長の急速な指数段階を誘発します。

この試金は低 1 として検出することができるので PrPSc 24fg、感度の高い資格様々 な末梢組織、排泄物や他の PrPScを検出することにより、事前事後分析や非侵襲的診断を達成するためにこのテクニック感染性の低レベルをかくまっている標本の種類。RT QuIC 再現性、実用性、速さ (50 h 未満)、生物検定と比較して低コストで他のアッセイの利点を間違いなく提供します。PMCA; で使用される超音波処理など技術的な複雑さを回避します。また、各ウェルのエアロゾル汚染の危険性を最小にするテープ ・ シールのマイクロ プレートでそれを行います。複数井戸のフォーマット実験では同じ最大 96 サンプルの解析が可能。 にします。偽陽性の問題を再発と生体外の試金の変換 rPrP の自発的な転換に対抗するには、RT QuIC でしきい値 (カットオフ) の実装に便利です。確かに、ネガティブ コントロール (否定的なサンプル +5 SD 27の平均 RFU) の結果に基づき、基準を設定するから正と負のサンプル間の差別を行うことができます。各サンプルの 4 つの複製の使用はこうして複製の少なくとも 50%、肯定的な信号を示すとき肯定的なサンプルの定義に助けることができる、すなわちカットオフ28を渡ります。例えば以前の研究ではハムスター rPrP 発見されたヒトの PrPvCJDの相同の基板と比較してより敏感な基板にシードし、羊スクレイピー シード反応、RT-QuIC でシードと基板との間の相同性は必要ありません。29. ハムスター羊キメラ rPrP も人間 rPrP 30人間バリアント CJD プリオンを検出するよりもより適して基板に示唆されました。したがって、rPrP 基板上の異なる種からの使用は、この試金で非常に一般的です。この試金は散発的な CJD 31,32,33, gen などのいくつかのプリオン病に正常に適用されています。エティックのプリオン疾患34BSE 35,36,37、スクレイピー 23,36,40,4139,CWD 38、、、 42。用いた研究処理髄液、全血、唾液、尿 RT QuIC で種子が40,4139,PrPSc 38、、、を検出するすべての成功したも42アミロイド線維形成阻害剤を含む血漿などのサンプルで検出能力を育成する Orrú et al.。(2011)Scの PrP の免疫沈降 (IP) ステップと RT quic 社によるアミロイド線維形成阻害剤を削除するための戦略を開発、「quic 社強化」の試金 (eQuIC) の名前。さらに、基板交換の手順は、感度を向上させるために反応時間 〜 24 時間後採用されました。最終的には、として低 1 として PrPScの ag eQuIC 30によって検知されました。

糞便抽出物を浄化し、糞便中に可能なアッセイの阻害剤を削除、するために糞便経口感染実験にエルクから前臨床、臨床段階で収集された洗剤とプロテアーゼ阻害剤を含むバッファーで均質化されました。糞便抽出物は、ナトリウム リンタングステン酸アルゼンチンタンゴダンスプロフェッショナル降水による蛋白質の沈殿物を利用したサンプルの PrPScを集中する異なる方法論をさらに堤出されました。最初 Safarらによって記述された NaPTA 沈殿法43, を使用して、テスト サンプルに PrPScを集中します。PrPCよりもむしろ PrPScの優遇の沈殿物のサンプルの結果と NaPTA のインキュベーション。ただし、分子メカニズムはまだ明らかではありません。このステップはまたを含む、いくつかのケースで観察される rPrP の自発的な変換を防ぐことを助けた。最後に、糞便抽出物は、最適化された RT-QuIC 基板としてマウス rPrP (aa 23-231) を使用して、プロトコルに基板交換を含む検出の感度を改善するために、テストされました。

ここでの結果は、この改良法 CWD プリオンの非常に低い集中を検出することができますなり、検出と糞便 NaPTA 降水量と基板交換せずプロトコルと比較して特異性の感度を示します。このメソッドは、可能性のある他の組織や体液に適用することができます、野生と飼育下のシカ科の CWD 監視のための偉大な使用することができます。

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Protocol

1 です RT QuIC 糞便材料を用いた

糞便 10 mL に 1 g の糞便材料を追加することによって
    1. 作る エキス シカの糞準備 の糞便磨砕液抽出バッファー (20 mM リン酸ナトリウム, pH 7.1 では、130 mM の NaCl、。0.05 %1 x 1 mM PMSF、トゥイーン 20 完了プロテアーゼ阻害剤、EDTA 無料) 最終濃度 10% (w/v) を与える。均質化のバッファーを利用する前に準備して-20 で格納できます ° C
    2. Homogenize 糞便ペレット (1 g) とチューブ (例えば、gentleMACS M 管) の製造業者から事前に設定プログラムで室温で 1 分のための蛋白質の分解を使用してバッファー (10 mL)。糞便のサンプルは、完全にバッファーに均質になるまで 2 〜 3 回この手順を繰り返します
      3. 。
    3. パラフィルムで管を密封し、室温で 1 時間放置のロッキング プラットフォームまたはロータリー シェーカーに配置します
      4. 。
    4. 室温で 5 分間 18,000 × g でチューブを遠心します
      5. 。
    5. 収集タンパク質を含む培養上清を抽出し、それらを 1.5 mL チューブ因数。因数は、さらにアプリケーション-80 ° C で保存できます
      6. 。
  2. 濃度の PrP Sc 糞便抽出
    注: 蛋白質の沈殿物のステップの追加による RT QuIC、検出感度を向上、糞抽出 CWD プリオンを集中するためにプロトコル。
    1. NaPTA 沈殿法
    2. N-ラウリルメタクリ油脂肪酸サルコシン (sarkosyl) 糞便蛋白質の 1 ml の 10% (w/v) の追加の 250 μ L を最終濃度 2% (v/v) の sarkosyl を与える抽出します
      3. 。
    3. シール管パラフィルムでサンプルを含む、37 ° c、thermomixer で 1,400 rpm で一定振動下で 30 分間インキュベートします
      4. 。
    4. リンタングステン酸ナトリウム、pH 7.4、最終濃度が 0.3% (w/v) リンタングステン酸試料中の塩化マグネシウムの 170 mM の 10% (w/v) を含む原液と糞便のタンパク質抽出物と sarkosyl のミックスを調整します
      5. 。
    5. 400 rpm で一定の揺れで 2 h の 37 ° C でサンプルをインキュベートします
      6. 。
    6. 遠心分離機の 14 ° c サンプル 15,800 x g に 30 分は培養上清を慎重に削除します
      7. 。
    7. 洗浄バッファーでそれらを再ペレットを洗浄 (10 mM pH 7.5、100 mM の NaCl、トリス-の Cl 0.5% トリトン X 100、10 ミリメートルの EDTA、0.5% ナトリウム 0.1% とデオキシ コール酸 (w/v)、sarkosyl (w/v)).
    8. 遠心分離機の 14 ° c サンプル 15,800 x g に 15 分は培養上清を慎重に削除します
      9. 。
    9. は、100 μ L でペレットを再懸濁します (1/10 糞便中の蛋白質の元のボリュームの抽出) RT QuIC 希釈バッファーの
      。 メモ: RT QuIC 希釈バッファー (20 mM リン酸ナトリウム, pH 6.9、130 mM の NaCl、0.1 %sds (w/v) および 1 つ X N2 の補足) は、利用前に用意しています。10 mL の容量は注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターで濾過、-20 ° C で使用されるまで保存されます
      10. 。
    10. RT QuIC アッセイに活用までの-20 ° C で扱われる NaPTA サンプルを格納します
      11. 。
  3. RT QuIC 法
    1. 新鮮な 10 mM Th T 原液 (二重蒸留 H 2 O の ml の 10 Th T の 0.032 g) を準備します
      2. 。
    2. 1:10 Th T ダブルで原液を蒸留 H 2 O を最終濃度 1 mm 目 T 0.2 μ m acrodisc 注射器を通してそれを注射器を用いたフィルター フィルターの希釈を行う
      3. 。
    3. マウス組み換え PrP (rPrP、aa 23-231) 基板 (RT QuIC 反応あたり 10 μ g/mL) を氷に-80 ° C で保存を解凍
    4. ロード 500 μ 100 kDa のサイズの除外フィルター チューブに一度に rPrP 基板と 14,000 x g で (1 つのチューブ/フィルター使用可能最大 2 倍) 室温で 5 分間遠心します
      5. 。
    5. 滅菌 1.5 mL チューブに溶出した基板を転送し、使用するまで 4 ° C でそれを維持します
      6. 。
    6. -20 に格納されている解凍 RT QuIC 希釈バッファー ° C
    7. RT QuIC の種 (糞便タンパク質抽出物) を希釈希釈バッファー:
      原液のサンプル: 糞便タンパク質抽出原液を使用する
      希釈 2 x 10 -1
      希釈 2 x 10 -2
      希釈 2 x 10 -3
    8. RT QuIC 反応混合物の貯蔵液の準備:
      リン酸緩衝生理食塩水 (PBS): 5 X
      NaCl: 2 M 在庫ダブル蒸留 H 2 o. で塩化ナトリウム
      EDTA: 100 mM のダブルで準備 EDTA 原液を蒸留 H 2 o.
    9. (ステップ 1.3.8) のすべてのソリューションの利用前に注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターを介して各ソリューションを個別にフィルター、滅菌常温で置かなければ
      10. 。
    10. は、すべての反応に十分な混合物を持っていることを確認するこのボリュームの 10% プラス使用するサンプル (サンプルあたり 98 μ L サンプルごとの反応量と 4 つレプリケートされます) の数に応じて RT QuIC 反応混合物の容量を準備します。 RT QuIC の反応混合物を準備する
      1. 使用 15 mL チューブ (20 mM リン酸ナトリウム, pH 6.9, 1 mM EDTA、10 μ M の 300 mM NaCl、Th T、10 μ G/ml rPrP 基板、および二重蒸留水反応 rPrP 最終濃度を調整する) 株式の sol を使用utions.
      2. は、フィルター先端のピペットを使用して上下ピペッティングでよくすべてのソリューションを混ぜます。渦の使用を可能な限り避ける
        3. 。
      3. 50 mL 使い捨てピペッティング シリンジに混合物を注ぐ
        4. 。
      4. マルチ チャンネル ピペットを使用して光 96 ウェル底面プレートの各ウェルに RT QuIC 反応混合物の 98 μ L を読み込みます
        5. 。
    11. 各 RT QuIC 反応 2 μ 原液または 10 倍に希釈した糞便タンパク質抽出物を加えます。4 つのレプリケートで各サンプルをテストします
      。 注: 各実験 CWD 陰性と確認された CWD 陽性動物から糞便サンプル (2 x 10 -3 から原液まで) のシリアル希薄として使われる正と負のコントロールそれぞれ
      12. 。
    12. プレート リーダー繰り返しサイクル 1 分二重軌道振動 (700 rpm) と潜伏中休憩 1 分で 25 時間 42 ° C で培養する前にシーリング テープでプレートをシールします
      13. 。
    13. 蛍光測定設定を定義:
      励起: 450 nm
      排出量: 480 nm
      下を読むと、点滅の数: 20
      手動ゲイン: 1000 (マシンによって異なります)
      積分時間: 20 μ s
    14. 25 h の終わりにプレート リーダーからプレートを取り外します
    15. 井戸間の潜在的な汚染を避けるために 3 分間 3,000 x g でプレート スピンダウンします
      16. 。
    16. プレートからシールを削除します
      17. 。
    17. 新鮮な基板と新鮮な蛍光を含む RT QuIC の反応混合物の 90 μ L Th T を染めるは、セクション 1.3.6 に 1.3.1 で説明を追加することによって新しい 96 ウェル プレートを準備します
      18. 。
    18. 新しく準備された 96 の最初のプレートの各ウェルから転送 10 μ L をウェル プレートします
      19. 。
    19. は新しいプレートをシールし、ステップ 1.3.13 で説明されている手順に従って追加の 50 h の RT QuIC アッセイを続行します。50 h のこの追加の手順は、75 h の全反応時間になる
      注: バイオ セーフティ キャビネットの下で RT QuIC アッセイのすべての手順を実行します
      20. 。
    20. は、データを収集します。
    21. 読み取り、ドキュメントも 15 分毎回 T 蛍光信号
      1. データ解析ソフトウェアとスプレッドシートに転送を用いた, 反応の平均の総サイクル数のデータを収集します
        2. 。
      2. は、データの平均値をプロットします。RT QuIC (h) の反応時間に対応する x 軸と y 軸が相対的な蛍光単位 (RFU) に対応します。各曲線は知られていたサンプルの希釈に対応します
        3. 。
      3. 各試験において陰性対照の最高の平均値を計算することでしきい値を画定プラス 5 の標準偏差電流に従って公開文献 41
        。 メモ:定義済みのしきい値を交差するすべての複製は、正と見なされます。敷居をまたぐ 4 つ複製のうち少なくとも 2 つ場合サンプルは、肯定的な見なされます
        4. 。

2。組み換えプリオンタンパク質 (rPrP) の精製

  1. 細菌の在庫と rPrP の式の成長
    注: エシェリヒア属大腸菌 (E. 大腸菌) ひずみロゼッタ (DE3) ベクトル ペット 24 エンコーディングで変換、マウス PrP (23-231 残基) は、rPrP を準備していました。
    1. 氷のペット 24 mPrP(23-231) と変換ロゼッタ (DE3) のグリセロール ストックを解凍
    2. 連勝 LB (ルリア ベルターニカミラ) 最終濃度 50 μ G/ml のカナマイシンのプレートし、37 ° C のインキュベーターで一晩インキュベートします。細菌を含んでいる固体媒体で湿度結露を避けるためにプレートが逆さまにしていることを確認します。2 つのプレートの少なくとも 1 つの成長があることを確認する 2 つのプレートを準備します
      3. 。
    3. 準備 1 L LB とオートクレーブ滅菌すること
      4. 。
    4. 1 ml のカナマイシン (50 mg/mL)、クロラムフェニ コール (34 mg/mL) 1 mL 滅菌 LB 媒体のサプリメント 1 L.
    5. カナマイシンとクロラムフェニ コールを含む LB 培地 3 mL を接種する使い捨て接種ループを使用して、各プレートのコロニーを拾う
      6. 。
    6. 5-6 のための 225 rpm で一定の揺れで 37 ° C でインキュベーターでミニ文化の場所
    7. タンパク質発現の誘導のため一緒にエクスプレス Autoinduction システム 1 LB 媒体のオリジナル 1 l の残りの部分にミニ文化を追加します
      8. 。
    8. 場所 2 L フラスコ、またはより大きい、20-24 のための 200 の rpm で一定の揺れで 37 ° C でインキュベーターでの培養
    9. 4 × 250 mL 遠沈管に 1 L 文化を分割します
      10. 。
    10. 室温で 20 分間 3,750 × g で文化を含んでいる管でスピンダウンします
      11. 。
    11. は、上澄みを廃棄し、50 mL 遠沈管に細菌のペレットを収集、処理まで-80 ° C でそれらを凍結します。結果として得られるペレットが良い蛋白質収量 3 に 4 g を圧迫している
      12. 。
  2. 封入体の準備
    1. 数分の 37 ° C で冷凍餌 (3 に 4 g) を解凍します
      2. 。
    2. の凍結のペレット-80 ° C で 10 分間の 1 つのより多くの時間と再び解凍。さらに 2 回を凍結融解のこの手順を繰り返します
      3. 。
    3. は、1 X で細菌のペレットを再懸濁します 溶解試薬 (例えば BugBuster マスター ミックス) によって徹底的にピペッティングします。細菌のペレットの 1 g に 5 mL の試薬を使用します。完全にミックスを均質化することを確認します
      4. 。
    4. 室温で 20 分間ロッカーの磨砕液をインキュベートします
      5. 。
    5. 室温で 20 分間 16,000 x g でホモジネートを遠心します
      6. 。
    6. 慎重にそれにオフを注ぐことによって培養上清を破棄
    7. 溶解試薬として、前の手順で使用されている X 1 の同じ量のペレットをホモジナイズしてください
      8. 。
    8. 常温ロッカー上で 15 分間ホモジネートをインキュベートします
      9. 。
    9. 1:10 の十分な量を追加 (0.1 x) 40 mL の総磨砕液の容積を得るため溶解試薬。よく均質化確認する逆解析によるミックス
      10. 。
    10. 4時 15 分 7,900 x g でホモジネートを遠心分離機 ° C
    11. 慎重にそれを注ぐことによって上澄みを廃棄
    12. 溶解試薬 x 0.1 40 mL にペレットを再懸濁します
      13. 。
    13. 4時 15 分 16,000 x g でホモジネートを遠心分離機 ° C
    14. それを注ぐことによって慎重に上澄みを廃棄し、さらに処理するまで-20 ° C で封入体を含むペレットを格納します
      15. 。
  3. 蛋白質の浄化
    1. 室温で封入体を解凍
      2. 。
    2. 14 ml 8 M グアニジン HCl の解凍の封入体を溶解 (38 g グアニジン塩酸塩 0.1 M ナポ 4 pH 8.0 で塗りつぶし H 2 O 50 mL に懸濁液で最終的な解決の pH を調整しない) タンパク質の可溶化
      3. 。
    3. 上下ピペッティングでよく均質化してください
      4. 。
    4. 加温 50 分間室温でロッカーのライセート
      5. Ni NTA 樹脂の準備 18 g
    5. ビーズ (3 に 4 g 細菌ペレットの 18 g) 100 mL の真空と 100 mL 0.22 μ m ボトル上部フィルターを使用して水でそれらをすすいでください。
      1. 50 mL のチューブで Ni NTA 樹脂ビーズの 18 g を配置し、最終巻をするためにバッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8) の変化の十分な量を追加 50 mL まで
        2. 。
      2. 常温ロッカー上で 50 分間変性バッファーのビードを平衡します
        3. 。
    6. 不溶性の残骸を削除する 5 分 16,000 x g でライセートの封入体を遠心します
      7. 。
    7. 平衡のビーズに上清を追加し、ペレットを破棄します
      8. 。
    8. は、Ni NTA 樹脂に結合する蛋白質を許可する部屋の温度で 40 分のロッカーにミックスを入れて
      。 注: ニッケル キレート ビーズは、ニッケル親和性によって PrP を浄化するために使用されます。PrP のヒスチジン豊富な N 末端領域はニッケル イオン任意の彼タグなしにバインドする蛋白質を可能にするニッケル (ii) への親和性をレンダリングします
      9. 。
    9. (A と B) の両方のラインをきれいに水で洗って FPLC
      10. 。
    10. 変性バッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0、6 M グアニジン塩酸塩、pH 8) プライム (列が添付されていない) システムに両方のライン (A および B) を実行
    11. は、列上に樹脂をロードします。気泡を最小限に抑えることを確認してください
      12. 。
    12. は、FPLC に列をアタッチし、変性バッファー 0% と 100% 年末までにバッファーを巻き戻しする変性バッファー A 100% と 0% のリフォールディング バッファー B (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、pH 8.0) 最初から線形グラデーションを実行します。この徐々 にシフトが 240 分 0.75 mL/min の流速で実行され、PrP の適切な折りたたみに必要です
      。 注: クロマトグラフィー精製過程では、変性の PrP は最初ゆっくり refolded 樹脂の変性バッファーを交換するリフォールディング バッファーの線形グラデーションを適用することによって。このステップはまたカオトロ ピック グアニジン HCl を削除します
      13. 。
    13. 100% リフォールディング バッファーは 0.75 mL/分でさらに 30 分間カラムを通過し続けて確認
    14. リンス水溶出バッファー (100 mM リン酸ナトリウム、10 mM トリス、500 mM のイミダゾール pH 5.8) A の行、列をバイパスします。これが AKTA における溶出バッファーと今取替えは変性バッファーが消去されます
      15. 。
    15. 2 mL/分リフォールディング バッファー B と 0% 溶出バッファー A 最初に巻き戻しバッファーと 100% 溶出バッファー 0% に 100% から 40 分間の線形グラデーションを実行することによってタンパク質を想定し, 浸出液
      。 注: 溶出バッファーのイミダゾールの集中は PrP を競う ' s、ニッケルの (ii) にバインドします。蛋白質一次ピークの溶出がグラデーションを介しての方法の約 1/3 始めるべきであります。
      1. 増加する OD 280 nm のクロマト グラムを見る
        2. 。
    16. 大きなピークの中心に蛋白質を含んでいる管のみを収集します
      。 注: 各 2 mL の溶出画分は 15 mL チューブに収集されます
      17. 。
    17. 透析バッファー (10 mM リン酸ナトリウム, pH 5.8) の約 1/3 量 (1 mL) ですぐにチューブに含まれる蛋白質を希釈します
      18. 。
    18. すぐに氷のチューブを配置
    19. チューブに含まれる溶出蛋白質をプールします
      20. 。
    20. 悪い透析カセット (分子量カットオフ 10 kDa) にタンパク質
      21. 。
    21. は中古冷蔵透析バッファー (3.6 L) 4 ° C で 2 時間にカセットを入れ、一晩のため新鮮な透析バッファー (3.6 L) にカセットを転送します。作る透析バッファーが一定の攪拌下にあることを確認します
      22. 。
    22. タンパク質を透析後注射器を用いた 0.2 μ m acrodisc シリンジ フィルターをフィルター処理します
      23. 。
    23. BCA タンパク質定量キットを用いたタンパク質濃度を測定します
      24. 。
    24. 濃縮または希釈タンパク質濃度 0.3 mg/mL に調整する必要がある場合
      。 注: SDS ページとブルー染色で純度を確認します
      25. 。
    25. マイクロ遠心チューブ用のタンパク質の 1 mL 因数を行い、すぐにさらに使用するまで-80 ° C で保存、RT QuIC プロトコルで説明されているようです
      26. 。

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Representative Results

検出の感度は低い27まだ CWD 糞便抽出液 10% (w/v) を用意していた RT QuIC 反応を播くことできます。具体的な取得することを許可鹿 rPrP 結果27のではなく、糞便の均質化の特定のバッファーを使用していたマウス rPrP 基板の使用する併用 RT QuIC 反応の高いバック グラウンド蛍光を避けるために重要なステップ。NaPTA 沈殿物の添加は、増幅反応 (図 2) のシードの活性を阻害することがなく rPrP RT QuIC (図 1) での自発的な転換を削減しました。NaPTA 治療に優れた増幅を認めた CWD 正糞便サンプルの結果の蛍光信号がまだ低い (図 1)。さらに、いくつかのサンプルのプリオンの増幅低蛍光レベル一定高原に達して。RPrP の劣化/変性または rPrP プール30を消費する経路を団粒形成に起因することができます反応の飽和状態を示します。さらにプリオンの増幅と検出の感度を強化、基板交換の手順はプロトコルに組み込まれました。RT QuIC プロトコル (図 2) に基板交換の導入増加感度 (77% RT QuIC の 14 のうち 18 サンプルされた肯定的な) と特異性 (100%; RT QuIC になって肯定的で否定的なコントロールのどれも) の検出 (を参照してくださいチェンらからテーブル 127) します。 最後に、これらのすべての手順 (図 3) は、CWD プリオン感染性の低レベルを含む試験片を用いた RT QuIC 検出のための信頼性と機密性の高いプロトコルの最適化につながった。

基板交換は RT QuIC 反応の最初の 25 時間後に導入された、反応を補充することで新鮮な基板と新鮮な蛍光を含むバッファー染料 Th t.プロトコルで基板交換手順を導入し、RT QuIC の反応時間は 75 時間 50 h から延長されました。基板交換定款を図 2に示すとおり、プリオンの増幅率の有意な改善を認めた.

Figure 1
図 1: RT QuIC でマウス rPrP 基板の自然変換シード精製 CWD 負糞便ホモジネートと。非感染エルク (C181-006) やミュールジカの糞便の乳剤が最終濃度 10% (w/v) を得るために糞便抽出バッファーで均質化されました。浄化、これらの糞便の乳剤で処理、NaPTA 沈殿物によって集中される 10 回。Unpurified 糞便ホモジネート (、)、NaPTA 精製、濃縮フォーム (b) 示される、希釈は, RT QuIC 反応基質としてマウス rPrP のシードに使用されました。Y 表示 Th T 蛍光の相対的な単位、横軸は反応時間を描きます。自発的なコンバージョンの削減は、NaPTA 精製糞便 (b) で見られました。チェンらから使用するデータ27.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2。基板交換を使用して糞 CWD プリオンの検出の改善。CWD プリオンに感染 (C051 05, 05 C052) 個々 のエルクの糞便のホモジネート精製、NaPTA 沈殿物によって集中されます。NaPTA 処理を希釈した 2 x 10-1 2 x 10-3種子, RT QuIC 反応マウス rPrP 基板に使用する間。50 h または 75 h (b) の長期の潜伏期間で基板交換の通常期間で基板交換 (、) なし RT QuIC アッセイを行った後者のため基板交換は RT QuIC 反応の最初の 25 時間後導入されました。反応量の 90% を除去し、作りたて rPrP 基板と Th t. を含む RT QuIC 反応混合物に置き換えプロトコルの基板交換の手順を紹介、75 h チェンらから使用するデータ、RT QuIC の反応時間が 50 h から延長されました。27.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: フロー図 CWD 感染シカ科から PrPSc糞便抽出を記述して、RT QuIC を使用してアクティビティとプリオンの増幅をシード アッセイします。CWD 感染動物の糞便、糞便抽出バッファーで均質化された、NaPTA 沈殿法に提出し、RT QuIC 法によるテストします。後者は、基板交換手順を導入することによって行われました。NaPTA と基板交換の手順の定款は、省自然変換と播種性プリオンの増幅の強力な改善で起因しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

RT QuIC 以前尿と糞便経口感染したミュールジカとオジロジカ38エキス CWD のプリオンを検出するため採用されました。この原稿に示すシステムは、RT QuIC アッセイの適応方法です。追加の手順は、検出と CWD プリオン感染した動物の糞便材料のためのアッセイの感度を改善するために「古典的な」RT QuIC 法に取り込まれました。

糞便抽出における検出感度は RT QuIC プロトコルの改善に私たちを導いた。敏感な生体外の糞便におけるプリオンの検出を達成するために重要なステップはプリオン変換および/または伝播を妨げるし、検出感度を向上させるコンポーネントを削除するためにサンプルの準備のために追加されました。CWD 感染前臨床・臨床のエルク、播種活動を検出および糞便抽出におけるプリオン変換の検出限界を高めるために不可欠だった RT QuIC と NaPTA/sarkosyl 治療のプロトコルで基板交換を組み込む.

NaPTA 降水量は、通常を特定し検出可能なレベルに PrPScを集中 sarkosyl 抽出を伴う一般的な手法です。NaPTA は、sarkosyl は携帯無料システム44の低濃度でプリオン変換を容易にするために知られている洗剤は PrPSc好ましく沈殿させる PrPC 43以上知られています。これでアライメント、NaPTA と sarkosyl の組み合わせを使用して可能性があります収率を生成高い繊維集合体の in vitroの45,46,47の前に示すように。この方法論は、精製唾液39および全血中40の供試体で正常に末梢の CWD のプリオンを検出する RT QuIC アッセイに以前に組み込まれています。我々 の研究は、糞便のサンプル準備のプロトコルで NaPTA/sarkosyl 浄化を組み込むことできる CWD プリオン検出 RT QuIC の最初の証拠を提供します。さらに、この方法で我々 は RT QuIC アッセイの CWD 負糞便ホモジネート rPrP 基板の自発的な転換を減らすためにことができた。

基板交換30の効果を説明する潜在的なメカニズムが提案されています。(前に新鮮な基質の添加) 反応の最初のラウンドでのみ少量の種子は RT QuIC 反応に追加されます。RPrP の部分だけがシード反応に組み込まれ、基板の残りの部分がどちらか非アミロイド集合体を形成する反応プレート井戸の壁との相互作用によってや、使用が少なくを参照して変換する形式に変更します。ded RT QuIC 製品ではなく、元の種子。その結果、種 rPrP の取り込み速度が遅いと線維形成は遅れ位相で検出できません。遅れ位相でシード RT QuIC 産物は、「高速アセンブリ ステージ」に到達する最終的に細長い、プリオンより小さい総計急速握手をして分割で増幅または横の追加ことができます。この段階での反応に追加されます新鮮な基板は容易に形成不明確な集計ではなく、シード製品に組み込まれます。私達のプロトコルで基板交換ステップの設立された感度を増加する変更PrPSc前臨床動物および/または阻害化合物からの非常に低い量のサンプルでプリオン種子を検出に便利でした。

PMCA フォールディング増幅分析最初の in vitroタンパク質説明21は、いくつかの利点ではなく、RT QuIC 試金を使用してください。PMCA でチューブを培養し、; 超音波発生装置内に含まれる水浴の超音波処理超音波発生装置の周囲に配置されている管は増幅管センター 48に位置と比較しての有効性は低下を示しています。震えている RT QuIC システム コントロールが容易になるようです。96 の井戸のフォーマットの使用は、RT-QuIC、しかし、Moudjoらによって開発された mb PMCA の本当の利点49,50、同様の利点を示したが、まだ少ない PMCA で使用します。

基板として RT QuIC 使用組換え rPrP 変換;対照的に、ほとんどの場合 PMCA は正常な脳のホモジネートを使用します。さらに、RT QuIC 配列相同性は必要ありません種子と基板51-53の間。

PMCA でプリオン レプリケーションに必要な因子の存在を感染結果の製品。ただし、RT QuIC のアッセイでは、増幅された PrP は感染しません。体外増幅の試金では、PrPCの自然変換により最もおそらく偽陽性反応の発生は定期的な問題です。したがって、試金と本研究で使用される条件は、シード rPrP 変換と自然変換の違いを最大限にこのような障害を最小限に抑えるために合わせて調整されました。

結論としては、NaPTA/sarkosyl 治療糞便内アッセイ阻害剤の除去を有効にし自発的な変換を削減します。興味深いことに、治療は precipitatedPrPScの種まき活動を妨げませんでした。さらに、基板交換は付随して採用されたときで、検出の感度が大幅に改善。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

トレーニングとシカの PrP 細菌発現プラスミドを提供する博士バイロン コーイー (NIH ロッキー山研究所) に感謝しております。SG は、カナダの研究の椅子プログラムによってサポートされます。我々 はアルバータ州プリオン研究所ゲノム カナダとアルバータ州農業・林業ゲノム アルバータ州、カルガリー大学この作業を支援するから SG にこの研究のための資金を認めます。我々 は、動物研究のマーガレット ・ ガン財団から研究助成を認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software

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慢性消耗性疾患、プリオン、問題 127 免疫 RT QuIC、変換の in vitroアッセイ、診断、検出、糞便
リアルタイム揺れる誘起変換用糞便材料の CWD プリオンの検出
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Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. … More

Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).

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