Summary
Aktuelle Bilayer Kultur Modelle erlauben nicht funktioneller in-vitro- Studien, die in Vivo Mikroumgebungen zu imitieren. Mit Polyethylenglykol und Zinkoxid Template Methode, beschreibt dieses Protokoll die Entwicklung der eine ultradünne biomimetische Basalmembran mit einstellbaren Steifigkeit, Porosität und biochemische Zusammensetzung, die eng in Vivo imitiert extrazellulären Matrizen.
Abstract
Die Basalmembran ist ein wichtiger Bestandteil der zellulären Bilayer, die Steifigkeit, Zusammensetzung, Architektur und Porosität variieren können. In-vitro- Studien der endothelialen epithelialen Bilayer haben traditionell auf durchlässigen Support-Modelle, die Bilayer Kultur zu ermöglichen, sondern durchlässig unterstützt sind begrenzt in ihrer Fähigkeit, die Vielfalt der menschlichen Keller Membranen zu replizieren. Im Gegensatz dazu Hydrogel-Modelle, für die chemische Synthese erforderlich sind höchst abstimmbaren und Modifikationen von der Steifigkeit des Materials und die biochemische Zusammensetzung über Einbeziehung biomimetische Peptide oder Proteine ermöglichen. Jedoch sind traditionelle Hydrogel-Modelle in der Funktionalität begrenzt, weil sie Poren für Zell-Zell-Kontakte und funktionellen in Vitro Migrationsstudien fehlt. Zusätzlich, aufgrund der Dicke der traditionelle Hydrogele wurde Einbeziehung der Poren, die sich über die gesamte Dicke der Hydrogele schwierig. In der vorliegenden Studie verwenden wir poly-(ethylene-glycol) (PEG) Hydrogele und eine neuartige Zink Oxid Template Methode um die bisherigen Mängel der biomimetischen Hydrogele. Dadurch stellen wir eine ultradünne, Basalmembran-wie Hydrogel, das die Kultur der konfluierende zellulären Bilayer auf eine anpassbare Gerüst mit variabler Pore Architekturen, mechanischen Eigenschaften und biochemische Zusammensetzung ermöglicht.
Introduction
Extrazelluläre Matrizen (ECM) bilden die Protein-Gerüste, die Zellhaftung unterstützen und dienen als Barrieren zwischen verschiedenen Zelltypen und sind ein wesentlicher Bestandteil der komplexen Geweben und Organen. Im Gegensatz zum interstitiellen Bindegewebe ist der Basalmembran (BM) eine spezielle Art von ECM, das wirkt als Barriere gegen Gewebe Kompartimente voneinander trennen. BMs sind etwa 100 µm dick und erlauben daher für direkte und indirekte Kommunikation zwischen den Zellen auf beiden Seiten. Zwei typische Beispiele für BMs sind vaskuläre BMs, gefunden in der mikrovaskuläre Wand zwischen Perizyten und Endothelzellen und Atemwege BMs, die zwischen den Endothelzellen und epithelialen Zellen gefunden werden. BMs dienen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellfunktion, wie Zellpolarität und Migration, Gesundheit und Krankheit. 1 Zusammensetzung, Steifigkeit, Architektur und Porosität von BMs variiert Organsysteme unterschiedliche physiologische Funktionen zu erleichtern. BM Poren sind beispielsweise wichtig für die Aufrechterhaltung der Zell-Zell-Kommunikation, lösliche Moleküle Verbreitung und Migration von Immunzellen bei Entzündungen oder Bakterien während der Infektion. In den Atemwegen umfassen Poren die volle Stärke des BM, mit Durchmessern von 0,75 bis 3,86 µm.2
Die dünne Natur des BM gewährleistet die obwohl Zelltypen physisch voneinander getrennt sind, interzelluläre Kommunikation über Signalisierung parakrine und Kontakte vermittelt. So haben Forscher um menschliche Krankheit in-vitro- Studie auf porösen durchlässigen Träger Einsätze zu zellulären Bilayer Kultur verlassen. 3 diese Modelle wurden entscheidend für das Verständnis der zellulären Kommunikation, die in Gesundheit und Krankheit eine Rolle spielt. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 durchlässig Unterstützung Einsätze erfüllen die Grundvoraussetzungen für das Verständnis, wie physiologische Prozesse, z. B. Leukozyten Rekrutierung und bakterieller Infiltration regelt Zellezelle signalisieren; jedoch die Einsätze haben erhebliche Einschränkungen und nicht um eine menschliche BM Permeable Unterstützung zu imitieren Einsätze fehlen mechanischen und biochemischen Einstellbarkeit und die vereinfachende poröse Struktur ist nicht imitieren die faserige Struktur, die die unregelmäßigen Poren schafft typisch für BMs. Daher gibt es ein wachsendes Bedürfnis nach einstellbaren Systeme, die die native BM-Eigenschaften neu zu erstellen, die zelluläre Prozesse zu beeinflussen.
Polymer-basierten Substrate sind ideale Kandidaten für die Entwicklung von Biomimetic BMs zellulären Bilayer in einem Kontext zu studieren, die die in-Vivo -Umwelt genauer imitiert. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 Polymere sind mechanisch einstellbaren und chemisch geändert werden können, um biomimetische Peptid-Fragmente. zu integrieren 11 , 12 , 13 Bioinert Polymer-Polyethylenglykol (PEG) kann verwendet werden, um biomimetische BMs zu konstruieren, und neuere Arbeiten hat die Synthese von mechanisch einstellbaren PEG Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) Gele mit porösen Netzwerke, die Zelle Wachstum unterstützen detaillierte und entzündlichen Zelle Chemotaxis. 14 obwohl PEG-basierte veröffentlicht Substrate zur Verfügung gestellt eines realistischeren Modells der menschlichen ECM als durchlässige unterstützt, viele dieser Modelle sind extrem dick, mit einer Tiefe von rund 775 µm, das begrenzt die Fähigkeit Bilayer Kulturen mit Zellezelle erstellen Kontakte. 14
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Schaffung einer PEG Polymer-basierten BM Mimik, die viele der Einschränkungen der aktuellen Zelle Bilayer Kulturtechnologien überwindet. Haben wir eine Template-Methode, die das Polymer während der Synthese und Vernetzung, die anschließend und selektiv entfernt Zinkoxid, eine extensiv genutzte Material für die Herstellung der mikrokristallinen Produktion berücksichtigt die daraus resultierende Masse Polymer. Dieser Prozess generiert ein zufälliges porösen Netzwerk, gewunden und vernetzten Pore-Netzwerk von menschlichen BMs imitiert. Darüber hinaus kann die Porosität durch Ändern der Größe und Form von Zinkoxid Mikrokristalle über Änderung der Stöchiometrie der Reaktion während der Nadel Produktion geändert werden. Hier entwickelte Technik schafft eine ultradünne Hydrogel, das die Dicke der menschlichen BM schließlich, die Mechanik, die Porosität nachahmt, und die biochemische Zusammensetzung diese BM-ähnliche Konstrukte kann leicht geändert werden, um eine Mikroumgebung zu generieren die meisten ähnlich wie die gesehen in Vivo.
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Protocol
Lesen Sie bitte Material Safety Data Blatt (MSDS) vorherige aller Materialien jederzeit verwenden und Sicherheitsvorkehrungen überhaupt.
1. Synthese von Zinkoxid Nadeln
- Bereiten Sie 250 mL eines 0,04 M Zn (Nr.3)2* 6 H2O Lösung durch Zugabe von Zink Nitrat 2,9749 g auf 250 mL Wasser.
- Bereiten Sie 150 mL 1 M NaOH durch Zugabe von 6 g NaOH auf 150 mL Wasser vor.
- Richten Sie ein Mineralöl-Bad auf einer heißen Platte mit Rührer und tauchen ein Rundboden 500-mL-Fläschchen in das Ölbad bei Raumtemperatur.
- Fügen Sie 250 mL Zn (Nr.3)2* 6 H2O in den Kolben und rühren die Reaktion zu beginnen.
- Fügen Sie 150 mL NaOH-Lösung (ein weißer Niederschlag bilden kurz und dann verschwinden, wenn die beiden Lösungen weiter zu mischen). Rühren für 2 h aufgedeckt.
- Den Kolben auf 55-60 ° C erhitzen und weiter rühren für 24 h.
- Schalten Sie die Hitze und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur unter Rühren abkühlen lassen.
- Filtern Sie die Lösung auf einen Büchner-Trichter mit einem 11 µm Porengröße und trocknen lassen über Nacht, aufgedeckt. Wenn das Filterpapier nicht mehr nass aus der gegossenen Lösung ist und ein weißes Pulver in den Trichter Löcher gebildet hat, werden die Partikel vollständig getrocknet.
- ZnO Nadeln zu sammeln und bereiten für Rasterelektronenmikroskopie (SEM), die nadelartigen Morphologie zu bestätigen. Kurz, montieren Carbon Band auf eine Pin-Stub und einem Spatel Metall um die ZnO-Nadeln auf dem Carbon-Band zu schmieren. Sputter-Mantel mit 8 mm Iridium bei einer Dichte von 22,4 g/cm3 und Abrufen von Bildern bei 10 kV.
(2) Zugabe von Opfergaben Zinkschicht auf Objektträger für HCl induzierte Freisetzung von PEG
- Bereiten Sie Zink-Acetat-Lösung durch 1,756 g Zinkacetat in 200 mL Methanol auflösen.
- Reinigen Sie 3 "x 1" plain Objektträger mit 70 % Ethanol und ein Einweg-Tuch. Lassen Sie an der Luft trocknen 10 min.
- Stellen Sie ein Glas 150 mm Petrischale auf einer heißen Platte und auf 150-160 ° c vorheizen
- Mit einem Glas Pipettieren mit einer Glühbirne pipettieren, halten Sie die Glas-Objektträger mit Pinzette und Mantel Folien Anwendung 5 Tropfen von Zinkacetat, bildet eine dünne Schicht auf der Folie verteilt. Lassen Sie überschüssige Lösung zurück in Stammlösung Tropfen.
- Legen Sie die Folie in der vorgewärmten Petrischale (150-160 ° C) mit der Zink-Acetat beschichtete Seite nach oben. Auf der Herdplatte 15 Minuten verlassen.
- Entfernen Sie die Folie mit einer Pinzette und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Folie wird angezeigt, mit weißen Streifen beschichtet werden.
- Entfernen Sie alle Überschüssiges Zink, das auf den Folien mit einer Einweg-wischen um prominente weiße Schlieren zu entfernen ausgeführt wird. Die Oberfläche sollte einheitlich sein.
- Setzen Sie die vorbereiteten Folien mit UV-Licht in eine biologische Sicherheit Haube für mindestens 1 h um Sterilität zu gewährleisten.
Achtung: UV-Licht ist schädlich für die Augen und Haut ausgesetzt. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit Augen oder Haut und Stromversorgung schalten Sie aus, wenn Sie nicht verwenden.
3. Vorbereitung der Silikon-Isolatoren
- Geschnittene Silikon Blatt in Quadrate von weniger als 1 "x 1" (Isolatoren müssen möglicherweise in einer 6-Well Schale passen).
- Stanzen Sie 8-12 mm Löcher in der Mitte der Quadrate mit einem Biopsie-Punch.
- Autoklaven-Silikon-Isolatoren für 20 min bei 121,0 ° C und 1,12 kg/cm.
4. Vorbereitung der PEG-Lösung und PEG Gel Synthese
Hinweis: Funktionalisierung und Polymerisation von PEG wurde ausgiebig erkundet und detaillierte zuvor durch unser Labor und andere. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- Kombinieren Sie die RGD Zelle Klebstoffe Peptid mit Acryloyl-PEG-NHS in 50 mM Sodium Bicarbonat (pH 8,5) in einem Molverhältnis von 1:1 zur Funktionalisierung des Amin-Terminus des Peptids mit Acrylat glyko-, eine biochemische Reaktion zu ermöglichen, die bisher zeichnet sich um mehr als 85 % Wirkungsgrad zu erzielen. 17
- Bereiten Sie Foto-Initiator, durch Mischen von 2,2-Dimethoxy-2-Phenylacetophenone mit 1-Vinyl-2-pyrrolidon in einer Konzentration von 300 mg/mL.
- In 1,5 mL Röhrchen zu trennen, wiegen Folgendes: 20 mg ZnO Nadeln, 12,5 mg PEG-DA und 2,5 mg PEG-RGD.
- 20 mg ZnO Nadeln in 270 µL 10 % FBS/PBS-Lösung auszusetzen; Vortex mischen (ca. 15 s).
- Kurz (< 1 s) drehen Sie die Lösung in einer Benchtop Mini Zentrifuge, ZnO Aggregate auf der Basis des Rohres zu bringen.
- Sammeln Sie 250 µL vom oberen Rand der ZnO-Lösung, um sicherzustellen, dass die Aggregate an der Unterseite des Rohres bleiben. Zusammen Sie mit PEG-DA und PEG-RGD zum Erstellen einer PEG-Lösung mit ca. 2,5 mM RGD. Vortex mischen (ca. 15 s).
- Fügen Sie 2 µL Acetophenon/n-Vinyl-pyrrolidon Foto-Initiator und Vortex kurz zu mischen (ca. 5 s).
- 20 µL der Polymerlösung entlang der Mittellinie der ZnO beschichteten Folien hinzufügen.
- Senken Sie langsam eine zweite Folie an der Spitze mit dem ZnO Beschichtung Gesicht nach unten (die PEG-Lösung sollte zwischen zwei beschichtet ZnO-Schichten). Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu verhindern. Verschieben Sie die Folien seitlich entlang der Hauptachse erlauben Luftblasen zu entkommen und die Lösung in einer dünnen Schicht zu verbreiten. Den Großteil der Folie mit der Polymerlösung zu decken. Erstellen Sie einen leichten Überhang mit der Oberschlitten um sicherzustellen, dass die Folien in späteren Schritten auseinander gezogen werden können.
- Crosslink Folien unter einer 365 nm UV Lampe (ca. 10 mW/cm2) für 15 Minuten.
5. Freigabe von PEG Gele aus Glas-Objektträger
- Druck auf die überhängende Folie und manuell ziehen die beiden Folien voneinander entfernt in einem langsamen Tempo in Reihenfolge zu vermeiden, knacken die Folien. Lassen Sie die Gele oder über Nacht trocknen mindestens 5 min lang.
- Legen Sie die Folie in einem sterilen 25 mm Glas Petrischale und vorsichtig gießen Sie die 1 M HCl-Lösung auf der Folie, unter Verwendung nur genug, um die Folie (ca. 10-20 mL) umfassen. Schütteln Sie die Petrischale; das Gel sollte beginnen, aus der Folie zu heben, da die HCl löst sich die aufopfernde Zink-Beschichtung und Nadeln. Sobald das Gel frei von der Folie ist, Gießen Sie die HCl zurück in die Stammlösung.
- Spülen Sie das Gel durch sanft etwa 25 mL 1 X PBS in der Petrischale gießen, bis die Folie und Gel eingetaucht sind.
6. Zelle Bilayer Aussaat
- A549 Zellen für die Aussaat vorbereiten. Kurz gesagt, ein 75 cm2 Fläschchen mit 5 mL 1 X PBS spülen, geben Sie 3 mL von 0,25 % Trypsin-EDTA und lassen Sie sitzen für 2-3 min bei 37 ° C.
- Mechanisch Schütteln der Flasche, die Reaktion mit 3 mL Dulbecco geändert Eagle Medium mit 10 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin zu stillen, und sammeln Sie in einem 15 mL konische Kolben. Spülen mit einer zusätzlichen 4 mL komplette Dulbecco geändert Adler Medien und sammeln Sie in dasselbe konisch. Drehen Sie Zellen bei 475 X g für 6 min..
- Während Zellen nach unten drehen, fügen Sie einen kleinen Tropfen des kompletten Dulbecco geändert Eagle Medium in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte. Benutzen Sie eine Pinzette Silikon Isolatoren mit den Gels in die neue 6-Well-Platte zu übertragen, dass das Gel auf den Tropfen Medien ruht. Nun, da Gele in einer dünnen Schicht verteilt sind, stellen Sie sicher, gibt es keine großen Löcher für das Auge sichtbar. Dies sollte unmittelbar vor der Zelle Aussaat zu vermeiden, trocknen und knacken der Gele.
- Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium mit 10 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin in einer Konzentration von 6 x 105 Zellen/mL aufzuwirbeln. Tropfen der Zelle Aussetzung klug, der Mitte des Gels, versuchen, ein Meniskus im Bereich ausgestanzt der Silikon-Membran zu erhalten. Können Sie Zellen für 4 h halten.
- Nach 4 h Brunnen 0,5 mL Dulbeccos geändert Eagle komplette Medium hinzu und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, um komplette Haftung zu ermöglichen.
- Am nächsten Tag bereiten Mediumwechsel auf Zelle Aussaat.
- Spülen Sie ein 75 cm2 Fläschchen mit 5 mL 1 X PBS, geben Sie 3 mL von 0,25 % Trypsin-EDTA und lassen Sie sitzen für 2-3 min bei 37 ° C.
- Mechanisch Schütteln der Flasche, die Reaktion mit 3 mL M199 Medien mit fötalen Rinderserum 20 %, 1 % Penicillin-Streptomycin und Wachstum von 1 % Zuschlag zu stillen, und sammeln Sie in einem 15 mL konisch.
- Spülen mit 4 mL M199 komplette Medien und sammeln Sie in dasselbe konisch. Drehen Sie Zellen bei 475 X g für 6 min..
- Während Zellen nach unten drehen, fügen Sie einen kleinen Tropfen des kompletten Medium 199 in jede Vertiefung in einer neuen 6-Well-Platte. Legen Sie eine neue Silikon-Isolator in den Brunnen mit dem Absinken der Medien in der Mitte des Silikons.
- Klappen Sie mit einer Pinzette, sorgfältig die Silikon-Isolator unterstützen das PEG-Gel mit A549 Zellen auf dem Isolator in der neuen 6-Well-Platte.
- Aufschwemmen Sie Mediumwechsel bei einer Konzentration von 6 x 105 Zellen/mL und fügen Sie die Zellsuspension in die Mitte des gekippten Gel Tropfens Weise, versuchen, ein Meniskus auf dem Gel im Bereich ausgestanzt der Silikon-Membran zu erhalten. Können Sie Zellen für 2 h einzuhalten.
- Geben Sie nach 2 h sanft 2 mL M199 komplette Medien in jede Vertiefung hinzu.
7. die Immunfluoreszenz
- Sorgfältig entfernen Sie Medien von Gelen mit einer manuellen Pipette und ca. 500 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in der Mitte des Gels, wo die Zellen ausgesät werden. 30 min. bei Zimmertemperatur ruhen lassen.
Achtung: PFA ist eine giftige Chemikalie; Verschleißschutz und sicherzustellen, dass die Behandlung in einer biologischen Sicherheitsschrank erfolgt. - Sorgfältig entfernen der PFA und ca. 500 µL 2 % BSA mit PBS-Puffer in jedes Gel. 1 h bei Raumtemperatur stehen lassen.
- Entfernen Sie vorsichtig die BSA. Bereiten Sie Primärantikörper bei einer Verdünnung von 1: 100 in 2 % BSA mit PBS-Puffer, und jedes Gel fügen Sie 500 µL hinzu. 1 h bei Raumtemperatur stehen lassen. Spülen Sie sanft, mit 500 µL 1 X PBS.
- Wiederholen Sie den gleichen Prozess mit der Sekundärantikörper. Benutze folgende Antikörper: 1) Anti-Human CD144 (VE-Cadherin) Klon 16B1; (2) Anti-Human CD324 (E-Cadherin) Klon 6714; (3) Anti-Human CD31 (PECAM-1) Klon c-20; (4) Anti-A549; (5) Anti-Maus FITC; (6) Anti-Ziege Alexa Fluor 647. F-Aktin visualisieren, 500 µL Phalloidin hinzufügen (10 µg/mL mit PBS-Puffer) für 20 Minuten.
- Sorgfältig entfernen Sekundärantikörper oder Phalloidin und 500 µL DAPI (0,1 µg/mL) für 20 min. DAPI Lösung sorgfältig entfernen und sanft 1,5 mL 1 X PBS in jede Vertiefung so dass Gele in der Schwebe sind.
- Übertragen Sie mit Hilfe einer Pinzette und Silikon Isolatoren, ein Gel auf einen Objektträger. Dies gilt für jedes Gel unmittelbar vor Bildgebung und Gele in PBS-Lösung nach dem Imaging ersetzen.
- Alternativ montieren Sie Gele mit DAPI-Montage-Medium. Die Proben mit Nagellack gut verschließen, Abrufen von Bildern innerhalb von 2 Tagen trocknen und Knacken des Gels zu verhindern. Siehe Tabelle 1 für die Problembehandlung.
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Representative Results
PEG-RGD Hydrogele bildeten sich durch sandwiching Polymerlösung zwischen zwei Opfer Zinkoxid und Pore Templates mit Zinkoxid Nadeln zu erstellen. Aufopfernde Zinkoxid Komponenten wurden dann mit Salzsäure, Generierung von ultradünnen PEG Hydrogele mit kontinuierlichen Poren (Abbildung 1) entfernt. Die Morphologie von Zinkoxid Nadeln von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) bestätigt wurde, und die durchschnittliche Länge und breite waren entschlossen, 3,92 ± 0,089 µm und 0,43 ± 0,02 µm betragen (Abb. 2A - 2 b). Nach dem Entfernen von Zinkoxid Nadeln die Hydrogel-Poren wurden durch SEM visualisiert und gekennzeichnet (Abbildung 2C - 2E). Die durchschnittliche Pore Dichte für Hydrogele war 176.863 ± 49.532 Poren. SEM wurde auch verwendet, um zu visualisieren und die Pore Dichte eines standard 3 µm Pore Polycarbonat durchlässig Unterstützung Einsatzes zu berechnen und die Pore Dichte erwies sich deutlich niedriger, bei ca. 2,51 ± 0,05 Poren pro Quadrat mm (Abbildung 2D, ( Tabelle 2). Die durchschnittliche Porendurchmesser in den vorgefertigten Zinkoxid PEG Hydrogel 0,19 ± 0,01 µm und war deutlich kleiner als die 3,47 ± 0,21 µm Poren in den durchlässigen Unterstützung einfügen (Abbildung 2E, Tabelle 2) beobachtet. Optische Kohärenztomographie diente, beide 2- und 3-dimensionale Bilder zu erwerben und die Dicke des Hydrogele schweben mit 1 X PBS-Puffer (Abbildung 3-A - 3 b) bestimmen. Die durchschnittliche Gel Dicke war 18.89 ± 3.47 µm (Tabelle 2). Gel Mechanik wurden auch durch die Messung der Elastizitätsmodul, wie oben beschrieben, und die durchschnittliche Elastizitätsmodul erwies sich 96.78 ± 23,92 kPa (Tabelle 2). 14
Immunfluoreszenz-Mikroskopie zeigt, dass ihre phänotypischen Identitäten endothelial Zellen und Epithelzellen zu behalten, nachdem auf ultradünnen PEG-RGD Hydrogele kultiviert wird. Endothelzellen gepflegt Ausdruck PECAM-1 und epithelialen Zellen befleckt positiv mit einem Anti-A549 Antikörper (Abbildung 4A - 4 b). Beide Zelltypen unterhielt auch die Fähigkeit, die enge Verbindungen zu bilden. Endotheliale Zellen ausgedrückt VE-Cadherin an den Zell-Zell-Verbindungen und Epithelzellen ausgedrückt E-Cadherin (Abbildung 4C - 4-D). Die PEG-RGD Hydrogele auch zelluläre Bilayer zu unterstützen, und Zell-Zell-Kontakte zu bilden in den porösen Strukturen, wie durch immunofluorescent Bildgebung Phalloidin gefärbten Proben (Abbildung 4E) ermöglichen.
Abbildung 1 . Schematische Übersicht über Hydrogel-Vorbereitung-Protokoll. (A) Synthese und Sammlung von ZnO Nadeln. B) Vorbereitung der Objektträger; Schaffung einer Opferschicht ZnO. C) Aufbereitung und Sterilisation von Silikon Isolatoren. D) Vorbereitung der PEG-Lösung mit ZnO Nadeln. E) Polymerisation von PEG zwischen ZnO beschichteten Glasobjektträger Gele. Weiße Linien stehen für Opfer ZnO Nadeln und Beschichtungen. F) HCl Spülen für das Entfernen der Nadeln und Freisetzung von Gel aus Folien. Dunkle Linien repräsentieren Poren von gelösten ZnO Nadeln erstellt. G) Übertragung der Gele und Silikon-Isolatoren auf 6-Well Gericht für die Zelle Aussaat vorbereiten. H) Zelle zu säen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Zink-Nadel-Charakterisierung und Hydrogel Porosität. (A) REM-Aufnahme von Zink Nadeln (Skala bar 5 µm). B) Länge und Breite des Zink-Nadeln. Punkte stehen Messungen für einzelne Nadeln; Linien stellen bedeuten und Standardfehler. C) SEM Bild von porösen Hydrogel (Skala bar 2 μm). D) Pore Dichte und E) durchschnittlicher Poredurchmesser für Polycarbonat durchlässig unterstützt und PEG Hydrogele. Balken stehen für Mittelwert und Standardfehler. p < 0,0001 über T-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Hydrogel Dicke. Optische Kohärenztomographie zeigt A) 3-dimensional und (B) 2-dimensionale Bilder von Hydrogele in PBS schweben. Pfeile zeigen die Flüssigkeitsoberfläche, Sternchen steht für Hydrogel. Maßstabsleiste ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Hydrogele Unterstützung Monolage und Bilayer Kultur. Beide endothelial Zellen und Epithelzellen sind in der Lage, konfluierende Monolagen auf PEG Hydrogele zu bilden, wie durch fluoreszierende Färbung für A) CD31 (CD31 rot, DAPI blau) und (B) A549 (A549 rot, DAPI blau), beziehungsweise. Bildung von intakten Cadherin Kreuzungen sind demonstrierten für C) Endothelzellen (VE Cadherin grün, DAPI blau) und D) Epithelzellen (E Cadherin grün, DAPI blau) (Skala Bars 100 µm). E) zwei Beispiele für zelluläre Bilayer Phalloidin Färbung (Phalloidin rot, DAPI blau) (Skala Bars 10 µm) demonstriert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Problem | Mögliche Lösung |
| Gele haben große Löcher. | Stellen Sie sicher, dass Zink Nadeln hinreichend aufgespalten werden, bevor Sie sie verwenden. |
Tabelle 1. Lösungsvorschläge zur Behebung von Problemen.
| Hydrogel | Transwell | Extrazelluläre Matrix | |
| Pore Dichte (Poren/mm2) | 1,77 x 105 ± 4,9 x 104 | 2,51 ± 0,05 | 8.50 x 102 bis 7,0 x 104 2,14 |
| Porendurchmesser (µm) | 0,19 ± 0,01 | 3.47 ± 0,21 | 0,47 bis 3,86 2,14 |
| Dicke (µm) | 18.89 ± 3.47 | 10 | 0,05 bis 0,10 17 |
| Youngs Modulus (kPa) 5 | 96.78 ± 23,92 | > 1000 | 3,5- 14 |
Tabelle 2: Vergleich der Eigenschaften wie Hydrogel durchlässig Standardsupport einfügen und extrazelluläre Matrix (Werte repräsentieren meine ± Standardfehler)
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Discussion
Das Protokoll hier konnten wir einen einstellbaren PEG Hydrogel, dienen als Gerüst biomimetische BM erstellen. Insbesondere kann von unterschiedlichen Molekulargewichte der PEG, Peptid Konjugation Strategien und Zinkoxid mikrokristalline Strukturen oder Konzentrationen, der Elastizitätsmodul, biochemische Eigenschaften und poröse Struktur die Hydrogele, bzw. geändert werden. Das ultradünne PEG-Gerüst verfügt über eine höhere Dichte der Pore und eine kleinere Porendurchmesser, die mehr mimetischen Funktionen in in Vivo Keller Membranen im Vergleich zu einem standard durchlässig-Support-Modell (Tabelle 2). Darüber hinaus haben wir durch diese Methode eine ultradünne Struktur mit einer durchschnittlichen Stärke von weniger als 20 µm erreicht. Während die Polycarbonat-durchlässig-Support-Modelle bereits eine ultradünne Schicht von nur 10 µm, nach unserem Kenntnisstand erreicht haben ist dies das erste frei schwebende und abstimmbaren Hydrogel System, diese Dicke zu erreichen. Zu guter Letzt haben die PEG Hydrogele ein Elastizitätsmodul von etwa 100 kPa, die ist um Größenordnungen weniger steif als traditionelle durchlässig unterstützt, Gewebekultur Kunststoff und Glas, die alle elastischen Moduli im Bereich der GPa, und daher sind mehr vergleichbar mit den niedrigen (< 10 kPa) Elastizitätsmodul von in Vivo extrazelluläre Matrix (Tabelle 2).
Erreichung einer niedrigen Elastizitätsmodul war eines der Hauptziele der hier vorgestellten Arbeit, und ist eine Einschränkung der Verwendung von traditionellen Polycarbonat durchlässig-Support-Modelle. Es ist bekannt, dass Substrat Steifigkeit kann Zelle Verhalten zu diktieren, und Arbeit hat gezeigt, dass Substrat Steifigkeit zellulare Schicksal der Differenzierung von Zellen führen kann. 12 steifere Substraten werden auch häufig verwendet, um Krankheitszustände, einschließlich fibrotische Gewebe oder bösartige Tumore zu imitieren und sind daher nicht genau Vertreter der gesunden Gewebe. 18 , 19 , 20 , 21 um Ruhestrom zellulären Phänotypen und Funktionen zu studieren, ist es wichtig, Substrate verwenden, die ein Elastizitätsmodul zu imitieren, die relevanten in Vivoist. Eines der großen Vorteile dieses Systems ist die Fähigkeit, die Mechanik des Gels, stimmen die mit PEG mit Molekülmassen erreicht werden kann. Wie viele Krankheiten ECM Versteifung zugeordnet sind, bietet dieses System eine biomimetische Plattform für das Studium der Beeinflussung der versus erkrankten BM gesunde Zellfunktion. Weiterentwicklung dieses Systems kann auch erreicht werden, durch die Veränderung der Peptid-Fragment für Zelladhäsion enthalten. Für die Zwecke der vorliegenden Studie wurde RGD aufgrund seiner allgegenwärtigen Ausdruck in vielen BM Proteine und ihre Fähigkeit zur festen Zellhaftung zu erleichtern. Neben RGD können auch Laminin Fragmente eingearbeitet werden, Laminin-epithelialen Interaktionen zu fördern, die apikale basale Zelle Polarisierung führen. 1 genauso wie die BM Steifigkeit bei Krankheit verändert wird, ist die Zusammensetzung der Basalmembran unter pathologischen Bedingungen umgebaut. Mit Hilfe den Amin-reaktive PEG-NHS-Vorläufer, ist es möglich, eine Vielzahl von Peptiden und Proteinen, die PEG-Polymer-Basis konjugiert. 11 , 14 , 15 Dies ist besonders vorteilhaft für die Untersuchung der Auswirkungen der Integrin-Engagement für verschiedene Integrin-Rezeptoren. Zum Beispiel die RGD-Sequenz, die in Fibronektin und Kollagen zum Ausdruck kommt greift mehrere Integrine, aber hat eine hohe Spezifität für Integrin αvβ3. Um ein Fibronektin reichen Substrat speziell zu imitieren, könnte die Leucin-Asparagin-Säure-Valin (LDV)-Sequenz aufgenommen werden um α4β1 zu engagieren oder eine kollagene Membran zu imitieren, Asparaginsäure-Glycin-Glutamin-Säure-Alanin (DGEA) hinzugefügt werden Integrin engagieren Α2Β1. 8
Endothelial epithelialen Bilayer sind nur ein Beispiel für eine zelluläre Bilayer, die mit dem hier vorgestellten Modell erstellt werden kann. Anderen Bilayer, die natürlich in Vivo, getrennt durch nur eine dünne BM oder ECM, existieren gehören endothelial Pericyte und endotheliale Glattmuskel Zelle Bilayer. So die Anwendungen für diese Methode sind breit gefächert und reichen von pulmonalen Medizin für vaskuläre Biologie. Wegen der einzigartigen Porosität der diese Hydrogele bieten sie die Möglichkeit, funktionelle Studien durchzuführen, die Hydrogel Vorgängermodellen nicht unterstützen konnten. Durch die Poren in unser ultradünnen Hydrogel System Integration, schufen wir einen verbesserte biomimetische Ersatz für durchlässige Support-Modelle, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Infiltration, ein gemeinsames Auftreten in der pulmonalen epitheliale endotheliale Barriere bei Tuberkulose. 3 , 6 , 14 , 22 in ähnlicher Weise kann Seelenwanderung oder Chemotaxis von Entzündungszellen über vaskuläre Zellkulturen untersucht werden durch die Messung der Rate der Zelle schlagen auf die RGD funktionalisierten Zelle Klebefläche des Gels, wie zuvor gezeigt hat. 16 Dies ist ein entscheidender Vorteil gegenüber früheren Hydrogel basierte Methoden, die Co Kulturbedingungen über Kapselung erreicht haben. Solche Systeme ermöglichen Nähe und Zellezelle Kontakt zwischen zwei Zelltypen und wurden erfolgreich zur Messung von Funktionen wie Angiogenese und Vaskulogenese, aber fehlen die Zugänglichkeit zweidimensionale Systeme, die eine viel zu bieten einfachere Plattform zur Messung von Leck, Infiltration oder aktive Migration über eine Co kultivierten zellulären Barriere. 17
So die Methode demonstriert hier bietet eine Plattform für eine Vielzahl von Studien in mehreren Feldern und bietet ein Sprungbrett zur Erzeugung von relevanter Daten aus in-vitro- Studien in Vivo Krankheiten verstehen und Mechanismen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Prof. Paul Van Tassel und Prof. Chinedum Osuji für ihre nachdenkliche Gespräche und Materialwissenschaft Know-how danken. Diese Arbeit wurde von den Dubinsky neue Initiative Award und den nationalen Instituten der Gesundheit NIBIB BRPR01 EB16629-01A1 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
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