Articolo metodologico

Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello

DOI:

10.3791/56387

⸱

12 ottobre 2017

 ,  ,  , 
1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo la tecnica di soffio, da cui reagenti farmacologici possono essere somministrati durante la registrazione di cellule intere patch-clamp ed evidenziano vari aspetti delle caratteristiche che sono cruciali per il suo successo.

Abstract

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Amministrazione farmacologica è comunemente usato quando lo svolgimento di cellule intere patch-clamp registrazione nelle fette del cervello. Uno dei migliori metodi di applicazione della droga durante la registrazione elettrofisiologica è la tecnica di soffio, che può essere utilizzata per studiare l'effetto dei reagenti farmacologici sulle attività neuronale nelle fette del cervello. Il grande vantaggio di applicazione puff è che la concentrazione di droga intorno al sito di registrazione aumenta rapidamente, impedendo così la desensibilizzazione dei recettori di membrana. Riuscito uso di applicazione di soffio comporta particolare attenzione ai seguenti elementi: la concentrazione del farmaco, i parametri della micropipetta soffio, la distanza tra la punta di una micropipetta di soffio e il neurone registrati e la durata e pressione guidando il puff (libbre per pollice quadrato, psi). Questo articolo descrive una procedura dettagliata per la registrazione di cellule intere correnti indotte da sbuffando acido gamma - aminobutirrico (GABA) su un neurone di una fetta di corticale prefrontale. In particolare, la stessa procedura può essere applicata con lievi modifiche per altre zone del cervello come l'ippocampo e lo striato e per diverse preparazioni, quali colture cellulari.

Introduzione

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La tecnica del patch-clamp, uno strumento primario per lo studio di segnali elettrici nei neuroni, è stata sviluppata in anni 19701,2. Dei principali vantaggi di questa tecnica è che esso fornisce conoscenza su come specifici trattamenti (ad es., farmacologico) può alterare funzioni neuronali o canali in tempo reale3. Valutazione farmacologica di funzione di un neurone durante la registrazione in una fetta di cervello cellule intere richiede l'applicazione di farmaci, come gli agonisti o antagonisti dei recettori specifici, i neuroni in fase di registrazione. Questo metodo permette l'identificazione di alterazioni neuronali che si verificano dopo l'applicazione di un farmaco specifico, portando così a una migliore comprensione delle proprietà fisiologiche e patologiche dei neuroni4. Sebbene amministrazione farmacologica possa essere condotte via sia5 o soffio di aspersione6, quest'ultima è la tecnica superiore. In particolare: (i) puff applicazione rapidamente aumenta farmaco concentrazione intorno il neurone registrato ad un livello tale che è impedita la desensibilizzazione dei recettori di membrana; (ii) il volume di droga soffiato è estremamente basso, affinché ci sia scarso effetto sulla soluzione del bagno, che pertanto riduce eventuali effetti indesiderati dei prodotti chimici amministrati su fettine di cervello; (iii) il protocollo di soffio può essere impostato e salvato, rendendo l'esperimento molto precisamente riproducibile; (iv) soffio applicazione rappresenta l'uso economico di agonisti/antagonisti, in particolare qualora tali reagenti siano costose o difficili da ottenere.

Qui, ci concentreremo sulla registrazione cellule intere correnti indotte da sbuffando GABA nelle fette del cervello acutamente preparato, una preparazione che ha il vantaggio di circuiti cerebrali relativamente ben conservato. Come conduciamo correnti inibitorie indotta da soffio7 sarà descritti in questo articolo. Utilizzando cesio (Cs+)-base di soluzioni interne e che tiene i neuroni a 0 mV, introdurremo GABA-puff evocato correnti postsinaptiche inibitorie (ampiezza) con dettagli tecnici appropriati. Utilizzando un modello murino di depressione indotta dal lipopolysaccharide (LPS) iniezione8, indichiamo che il eIPSC ampiezza evocata da un soffio di GABA è ridotta significativamente in fette di topi iniettati LPS rispetto ai comandi del veicolo. La nostra intenzione è che questo articolo dovrebbe mostrare come la tecnica di soffio è ampiamente applicabile a studi mirati a valutare l'effetto di sostanze chimiche, farmaci o composti sulle attività neuronale nelle fette del cervello.

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Protocollo

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Custodia degli animali

e tutti gli animali sono stati condotti esperimenti secondo procedure approvate dal comitato etico per la ricerca animale presso South China Normal University, secondo le linee guida per la cura degli animali, istituito dall'Istituto nazionale di Salute.

1. preparazione di soluzioni

  1. preparare 500 mL di standard cerebrospinale artificiale (ACSF) contenente i componenti descritti nel nostro lavoro pubblicato 7 come elencato nella tabella 1.
    1. Vetro pulito uso becher con acqua deionizzata per preparare una soluzione fresca di ACSF. Pulire la spatola con acqua deionizzata e asciugare prima dell'uso aggiungere NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, MgSO 4, D-glucosio e aggiungere il CaCl 2 dopo aver fatto gorgogliare la soluzione con 95% O 2 / 5% CO 2 miscela per ~ 20 min (come descritto in dettaglio nella tabella 1) a 500 mL di acqua deionizzata. Mescolare fino a quando completamente sciolto.
    2. Assicurarsi la ACSF è completamente chiaro senza alcuna precipitazione. Quindi regolare il pH a 7,2-7,4. Bolla con una miscela di gas composta da 95% O 2 e 5% CO 2 per un minimo di 20 ~
  2. Preparare 250 mL di soluzione di taglio fetta che contiene i prodotti chimici 7 descritto in tabella 2.
    1. Aggiungere KCl, MgCl 2, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, choline·Cl, D-glucosio e aggiungere il CaCl 2 Ultima come indicato al punto 1.1.1, 250 ml di acqua deionizzata e sciogliere come descritto in 1.1.1 e 1.1.2.
    2. Dopo spumeggiante con 95% O 2 / 5% CO 2, posizionare la soluzione in un congelatore per 15-20 min in modo che la soluzione di taglio diventa ghiacciata e parzialmente congelati.
      Nota: Usiamo questa soluzione di taglio quando si effettuano le fette da 1-2 mese-vecchi topi; la formula può differire per topi più vecchi di 2 mesi.
    3. Soluzione di LPS preparare sciogliendo in soluzione salina sterile privo di endotossina isotonica (0,9% NaCl). LPS è somministrato per via intraperitoneale (0,5 mg/kg) e iniziare la registrazione dopo 2 h.

2. Preparazione della fetta di corteccia prefrontale

  1. prendere la soluzione di taglio fuori dal freezer e omogeneizzare per ottenere una granita. Mettere la soluzione sul ghiaccio e bolla costantemente con 95% O 2 / 5% CO 2.
  2. Utilizzando le forbici grandi, nitide, rapidamente decapitare un mouse come descritto 9 e subito messo la testa in un becher pieno di ghiacciata (0-4 ° C) soluzione di taglio.
  3. Tagliare la parte superiore del cranio lungo la linea mediana in direzione caudale--nasale con forbice e rimuovere le porzioni laterale del cranio. Rimuovere il cervello con una spatola fine e goccia in soluzione di taglio ghiacciata.
    Nota: Passaggi 2.2-2.3 devono essere fatto rapidamente (idealmente < 1min).
  4. Mettere il cervello sul coperchio di una scatola Petri 9 cm riempito con ghiaccio. Sciacquare il cervello con soluzione di taglio ghiacciata. Tagliare il cervelletto e bulbo olfattivo con una lama di rasoio.
  5. Colla del cianoacrilato applica alla provetta titolare di un vibratomo. Posizionare con cura il blocco di cervello su goccia di colla, rostrale rivolta verso l'alto e subito immergere in soluzione di taglio ghiacciata.
  6. Regolare il portalama del vibratome ad un angolo di 15° con riferimento al piano orizzontale e preparare 350-µm fette coronali del cervello (frequenza di vibrazione della lama = 85 Hz, velocità = 0,1 mm/s).
  7. Utilizzando una pipetta, trasferire le fette nella camera di recupero riempite con ACSF, incubare per 1 h (a RT) con costante ribollimento di 95% O 2 / 5% CO 2.

3. Intero-cellula Patch registrazione

  1. Make vetro Micropipette di borosilicato per utilizzare come elettrodi di registrazione o soffio Micropipette secondo le linee guida specifiche del manuale di Puller. Per la registrazione di elettrodi, punta resistenze sono nel range 4-6 M Ω, mentre soffio Micropipette hanno diametri di punta nella gamma 2-5 µm.
  2. Aggiungere stampo della scanalatura del Na + (TTX, 1 µM), blocco veloce Na + canale e quindi i potenziali di azione, a ACSF e mantenere una portata costante di questa soluzione di 2-3 mL/min in camera di registrazione, di pompa peristaltica nella camera e aspirazione fuori di esso. Bubble ACSF con 95% O 2 / 5% CO 2 costantemente per garantire la redditività delle fette.
  3. Trasferire una fetta di cervello nella camera di registrazione utilizzando una pipetta Pasteur modificata cui punta fine è stato tagliato per adattarsi alle dimensioni della fetta. Coprire la fetta con un ancoraggio di platino fetta con fili di nylon paralleli distanziati ≥ distanziate per contenere la fetta sulla piattaforma di 2 mm.
  4. Riempire la micropipetta di registrazione con soluzione interna 7 (tabella 3) e riempire le micropipette puff con GABA a 10 µM, 50 µM e 100 µM (disciolto in ACSF) o ACSF come controllo del veicolo.
  5. Per prevenire l'occlusione con detriti, applicare una leggera pressione positiva utilizzando una siringa da 1 mL prima di immergere l'elettrodo di registrazione nel ACSF. Utilizzando un micromanipolatore sotto un microscopio (4 x lente dell'obiettivo), posizionare la micropipetta di elettrodo e puff di registrazione in modo che le punte appaiono al centro dell'immagine video nel monitor ( Figura 1 A).
  6. Regolare il fuoco del microscopio (obiettivo obiettivo di 40 x) riducendo gradualmente la micropipetta puff e posizionarlo sopra il neurone di registrazione ad un angolo di 45°. Mantenere la distanza tra la punta della micropipetta soffio e il neurone registrate tra 20-40 µm ( Figura 1 B). Il neurone con l'elettrodo di registrazione si avvicinano lentamente e con attenzione e poi rilasciare la pressione positiva. Applicare una debole e breve di aspirazione attraverso il tubo collegato alla pinza porta elettrodo per creare un sigillo di giga-ohm.
  7. Mantenere la tensione a 0 mV. Dopo la formazione del sigillo giga-ohm, compensare per una rapida e lenta capacità manualmente o automaticamente. Quindi applicare un breve e forte aspirazione attraverso il tubo di cui sopra per entrare nel modo della intero-cellula.
    8. Modalità di
  8. record eIPSC in tensione-morsetto. Applicare la bassa pressione del gas (azoto, 4-6 psi) alla micropipetta puff utilizzando un Picospritzer controllato da un generatore di Master 8 tensione passo per fornire singolo o accoppiato GABA soffi ( Figura 2).
  9. Modificare la durata del soffio per ottenere i migliori risultati di eIPSC ( Figura 3) e misurare la eIPSC nel modello di depressione indotta da LPS ( Figura 4).

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Risultati

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La tecnica di soffio consente ai ricercatori di studiare l'effetto di droghe, in particolari recettori sulla superficie di un dato neurone. In questo articolo, ci concentriamo su correnti mediate da recettori GABA. La figura 1 Mostra le micropipette puff e registrazione. Per eliminare qualsiasi effetto sui neuroni registrati della pressione fisica generata da Sfoglia, ACSF e soffi di saccarosio (Figura 2A) vengon...

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Discussione

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Applicazione di soffio viene ampiamente utilizzata per valutare il recettore postsinaptico funzione3,4,7, ma richiede un controllo preciso in ogni esperimento. Descriviamo qui una procedura che coinvolge cellule intere patch di bloccaggio, che dimostra che GABA-puff indotto IPSCs (cioè, ampiezza) nelle fette del cervello corticale prefrontale. La resistenza dell'elettrodo di registrazione è MΩ circa 5, mentre il diametro della p...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desidera ringraziare le seguenti organizzazioni: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), scienza e tecnologia divisione di Guangdong (2013KJCX0054), la Fondazione di scienze naturali della provincia di Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), Guangzhou scienza e tecnologia Bureau (201607010320).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Micropipette in vetro borosilicatoShutter InstrumentsBF150-86-10diametro esterno 1,50 mm; diametro interno 0,86 mm
Estrattore per micropipetteShutter InstrumentsMODELLO P-97 Estrattore per micropipette Flaming/Brow
MicromanipolatoriShutter InstrumentsMP-285
Amplificatore controllato da computer     Molecular DevicesMulticlamp 700B
Sistema di acquisizione digitale Molecular DevicesDigidata 1440A
Fotocamera per immaginiNikon 2115001Apparecchiature di ispezione
Microscopia Nikon Eclissi FN1 
Master 8A.M.P.I.Master-8 Stimolatore
Affettatrice a vibratomoLeicaVT 1000S
Lama di rasoioGillette74-SFLYING EAGLE
Video monitorPanasonicWV-BM 1410
502 CollaDeli7146Colla cianoacrilato
Pompa peristalticaShanghai JIA PENG CorporationBT100-1F
VideocameraOlympus America MedicalOLY-150
Pipette di trasferimentoBiologix30-0138A1
a impulsi

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

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