Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

Formazione di epithelia con polarità apico-basale è un processo fondamentale nello sviluppo e comporta una riorganizzazione drammatica del microtubuli e proteine centrosomali. Una matrice radiale dei microtubuli che emana da un posizione centrale microtubule centrosomal organizzazione centro (MTOC) è prominente in molte cellule animali e questo è particolarmente adatto per cellule relativamente piatte. Al contrario, le cellule epiteliali colonnari, come quelli dell'intestino, assemblare matrici dei microtubuli non radiali transcellulare che meglio supportano la forma e le funzioni specializzate di queste cellule. Questa riorganizzazione drammatica dei microtubuli avviene mediante il centrosoma trasferirsi l'apice e MTOCs non centrosomal apicale (n-MTOCs) che formano, che diventa responsabile per l'ancoraggio dei microtubuli transcellulare^{1,2 , 3 , 4 , 5}.

Molta della nostra conoscenza di differenziazione epiteliale e la riorganizzazione di associata ai microtubuli è venuto dalle indagini di 2D in vitro strati di cellule che non vengono visualizzati l'architettura tissutale in vivo . Sviluppo di 3D in vitro organoid culture, introdotta da Clevers e colleghi di lavoro⁶, rappresenta un importante progresso tecnologico come imitano lo sviluppo e l'architettura in vivo . Una gerarchia di differenziazione epiteliale è evidente nell'intestino; cellule staminali nella parte inferiore delle cripte danno origine al transito immaturo amplificando le cellule che proliferano e si differenziano gradualmente durante la loro migrazione fino alla cripta sul piccolo del villo intestinale o superficie colica, dove sono diventato completamente differenziati prima di essere capannone nel lumen⁷. D'importanza, questo è replicato in organoids intestinale dove le cellule dalla nicchia delle cellule staminali proliferano forma cisti che successivamente generano cripta-come germogli con cellule staminali nella parte inferiore e la differenziazione di progredendo gradualmente verso la regione di ciste, che diventa campione di villo-come⁸. Il organoid intestinale rappresenta quindi un potente modello per studiare non solo dei microtubuli e riorganizzazione centrosomal durante la differenziazione epiteliale, ma numerose altre proteine, come pure fornendo una piattaforma ideale per lo screening di farmaci e alimenti composti del potenziale terapeutico benefici^9,10.

Organoids sono adatti per vivere-imaging delle proteine fluorescenti-etichettate ed entrambi knock-in e organoids knock-out può essere generato usando CRISPR/Cas9 gene editing^11,12. Tuttavia, stabilire l'espressione e la localizzazione delle proteine endogene da studiare è importante, soprattutto per verificare il comportamento delle proteine con tag. Immuno-etichettatura 3D organoids coltivate in seminterrato matrix o ex vivo isolato il tessuto è più complesso di cellule coltivate in piastre di coltura in 2D. Il protocollo di fissazione deve preservare la delicata architettura 3D dei organoids pur conservando l'antigenicità di anticorpo (cioè, gli epitopi per l'associazione di anticorpi). Ad esempio, paraformaldeide al 4% (PFA) è comunemente usato come fissativo ma mentre è un fissativo di azione relativamente rapida e dà buona conservazione morfologica, nella nostra esperienza spesso si traduce in perdita di antigenicità e non è adatto a molti centrosomali anticorpi. La capacità del fissativo e anticorpi di penetrare i tessuti e strutture 3D dovrebbe anche essere considerata. A tal fine, abbiamo modificato e sviluppati protocolli di isolamento del tessuto e indiretta immuno-etichettatura dei organoids 3D in vitro ed ex vivo isolato tessuto intestinale. Descriviamo come isolare piccole cripte intestinali e villi e tessuto colico e includere un protocollo per l'isolamento dei organoids 3D come alternativa al fissaggio e immuno-etichettatura all'interno della matrice di seminterrato. Presentiamo tre protocolli di fissazione alternativi per immuno-etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali, ad esempio ninein e dei microtubuli plus-fine rilevamento proteine (+ puntali), quali le proteine EB e CLIP-170 (veda inoltre riferimenti^{8, 13}). Inoltre discutiamo i pro ei contro associato ogni protocollo.

Tutti i metodi descritti qui sono stati effettuati secondo le linee guida della University of East Anglia di licenza istituzionale.

1. isolamento del tessuto intestinale

1. Isolamento delle cripte coliche per immuno-etichettatura (Vedi Figura 1, schematica)
   1. Eutanasia il mouse (usando CO₂ asfissia) e rimuovere i due punti (inizio alle intestino cieco ed estrazione caudalmente) con forbici e pinzette¹⁴di dissezione.
   2. Svuotare il contenuto del colon con tamponato fosfato salino (PBS) usando una pipetta di vetro con bulbo di gomma. PBS: cloruro di sodio (8,0 g/L), cloruro di potassio (0,2 g/L), sodio fosfato bibasico (1,15 g/L) e potassio fosfato monobasico (0,2 g/L), a pH 7,3.
   3. Utilizzando una bacchetta di metallo (2,4 mm di diametro) o alla fine di una pipetta di vetro, tenendo un'estremità del tubo colica di scorrere delicatamente il tessuto sopra la canna/pipetta così "everting" il tessuto colico in modo che l'epitelio è ora sulla parte esterna.
      Nota: Se questo non è possibile aprire il colon con le forbici e tagliare in pezzi di 5 mm.
   4. Trasferimento anteverso colon o pezzi di una provetta conica da 50 mL contenente 40 mL di PBS.
   5. Capovolgere la provetta più volte per ulteriori Rimuovi contenuto intestinale, muco, ecc.
   6. Trasferire il colon/parti a 40 mL di 3 mM EDTA in PBS e incubare a temperatura ambiente (TA) per 15 min.
      Nota: Diluire stock di pH 8.0 di EDTA 0.5 M con PBS.
   7. Agitare per rimuovere il muco e trasferire i due punti/pezzi in una provetta conica di 50 mL contenente fresco 40 mL di 3 mM EDTA in PBS. Incubare per 35 minuti a TA.
   8. Trasferire i due punti/pezzi a 10 mL di PBS in una provetta conica da 50 mL e agitare vigorosamente per 30 s a rilasciare cripte (frazione di cripta).
   9. Rimuovere i due punti/pezzi dal tubo e inserire nuovamente 3 mM EDTA nel caso in cui è necessaria un'ulteriore isolamento. Centrifugare la restante frazione di cripta a 300 x g per 5 min.
   10. Prelevare mL 5 del surnatante e risospendere il pellet di cripta nel rimanente volume di 5 mL.
   11. Osservare sotto un microscopio stereoscopico con zoom (ingrandimento X 50-100) per verificare la presenza delle cripte coliche.
       Nota: Se non ci sono nessun cripte presenti poi incubare i colon/pezzi in 3 mM EDTA in PBS per altri 30 min e quindi ripetere i passaggi 1.1.8 - 1.1.11.
   12. Centrifugare la frazione di cripta a 300 x g per 5 min.
   13. Rimuovere il surnatante tutti per ottenere un pellet di cripta e procedere immediatamente alla fissazione (sezione 3).
2. Isolamento di piccole cripte intestinali e villi per immuno-etichettatura (Figura 2)
   1. Eutanasia del mouse (usando CO₂ asfissia) e rimuovere l'intestino tenue (duodeno prossimale all'ileo terminale) con forbici e pinzette¹⁴di dissezione.
      Nota: per visualizzare diverse sezioni dell'intestino tenue, quindi a questo punto separare e trattare separatamente. Vedi Figura 1 e tabella 1 per un diagramma di flusso e le temporizzazioni.
   2. Scaricare il contenuto dell'intestino tenue con PBS utilizzando una pipetta di vetro con bulbo di gomma.
   3. Tagliare aperto piccolo intestino con le forbici per dissezione e in 15 mL di PBS in una capsula di Petri.
   4. Lavare delicatamente l'intestino in PBS per rimuovere il contenuto luminale mentre non danneggiare la superficie della mucosa. Trasferire il tessuto a un fresco di Petri e ripetere il lavaggio con PBS.
   5. L'intestino tagliato a pezzi di 3-5 mm e trasferire a un 100 mm di Petri contenente 15 mL di 30 mM EDTA in PBS e incubare per 5 min a RT. in alternativa Incubare 3 mM EDTA in PBS per 30 min.
   6. Frazione 1 (isolamento di Villi): trasferire i pezzi intestinali in 10 mL di PBS in una provetta conica da 50 mL, agitare vigorosamente per 10 s e versare in una capsula di Petri di 100 mm. Verifica la frazione per villi isolati sotto un microscopio stereoscopico. In questa fase, per lo più villi dovrebbero essere presente, ma questo può variare tra gli isolamenti.
      Nota: Per evitare isolati villi/cripte attaccare alla plastica, capsule di Petri e tubi di raccolta dovrebbero essere prerivestiti con siero bovino fetale (FBS). Versare FBS in piatti e/o tubi e rimuoverlo immediatamente. Vedere la tabella 1 per le guide di temporizzazione per ogni frazione.
   7. Trasferire i pezzi intestinali torna in 30 mM EDTA in PBS e incubare per 5 min. Durante questa incubazione, raccogliere 1 frazione in una provetta conica da 15 mL (sensibilizzati con FBS) e centrifugare a 300 x g per 5 min.
   8. Frazione 2: Trasferire pezzi intestinale una provetta conica da 50 mL contenente 10 mL di PBS, agitare vigorosamente per 20 s e poi versare in un 100mm di Petri. Verifica la frazione sotto il microscopio. In genere, in questa fase una coltura mista di villi e cripte sono presenti (Figura 2A).
   9. Trasferire pezzi intestinale torna in 30 mM EDTA in PBS e incubare per ulteriori 5 minuti. Durante questa incubazione, pallina frazione 2 in una provetta conica da 15 mL (sensibilizzata con FBS) a 300 x g per 5 minuti rimuovere il surnatante da frazioni 1 e 2 senza disturbare il pellet e procedere immediatamente alla fissazione (passaggio 3).
   10. Frazione 3 (isolamento cripta): trasferire i pezzi intestinali in 10 mL di PBS in tubo da 50 mL, agitare per 20 s e versare in una capsula di Petri di 100 mm. Frazione di controllo sotto il microscopio. In questa fase, la frazione conterrà principalmente cripte (Figura 2B).
   11. Parte 4: Trasferire i pezzi intestinali in 10 mL di PBS, agitare per 20 s e versare in un 100mm di Petri. Frazione di controllo sotto il microscopio. In questa fase solo cripte dovrebbero essere presenti.
   12. Frazione 5: Trasferire i pezzi intestinali in 10 mL di PBS, agitare per 20 s e versare in una capsula di Petri di 100 mm. Frazione di controllo sotto il microscopio. Di solito, in questa fase, molto poche cripte vengono estratti. Se più di qualche cripte vengono estratti, quindi continuare con una frazione di^th 6.
       Nota: Se una popolazione pura cripta è desiderata (ad esempio, per la generazione di organoid), quindi utilizzare un colino di cella 70 µm per rimuovere qualsiasi villi intatti dalla frazione arricchita di cripta.
   13. Raccogliere le frazioni 3-5 in tubi conici separati 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.
   14. Verifica i pellet di frazioni 3 - 5 e rimuovere i surnatanti senza disturbare il pellet e procedere immediatamente alla fissazione (sezione 3).

2.Isolamento dei Organoids intestinale da seminterrato Matrix cupole in piastre da 24 pozzetti

Nota: La formazione dei organoids all'interno del seminterrato matrice cupole è stato descritto altrove¹².

1. Pozzi di cappotto con seminterrato matrice cupola secondo le istruzioni del produttore.
2. Lavaggio pozzetti contenenti seminterrato matrice cupole con 500 µ l di PBS.
3. Aggiungere freddo 250 µ l di soluzione di recupero di cella (4 ° C) ad ogni pozzetto (Vedi Tabella materiali).
   Nota: La soluzione di recupero di cella fredda sarà depolymerize microtubuli tutti, ma stabili.
4. Raschiare le cupole di matrice seminterrato utilizzando una micropipetta P1000 e attentamente Pipettare su e giù tutto il bene di disfacimento e rimuovere la matrice seminterrato da plastica.
5. Raccogliere il surnatante in microcentrifuga da 1,5 mL obbligatoria bassa.
6. Capovolgere la provetta di associazione basso 1,5 mL più volte e controllare al microscopio se il organoids sono stati isolati e sono liberi di muoversi e non in ciuffi. Tenere il tubo sotto un microscopio stereoscopico e vista sotto ingrandimento basso (50x).
7. A pellet il organoids mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti a TA.
8. Rimuovere il reagente di recupero e procedere immediatamente alla fissazione (passaggio 3).

3. fissazione del tessuto intestinale isolato e Organoids

1. Fissazione del metanolo
   1. Risospendere la frazione di cripta/villo intestinale isolato in 10ml e organoids in 1 mL di metanolo a-20 ° C.
   2. Incubare le cripte/villi/organoids a-20 ° C in un freezer per 15 minuti e invertire le provette ogni 5 min.
   3. Pellet di cripte/villi/organoids mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min.
   4. Rimuovere il metanolo e aggiungere la soluzione di lavaggio (1 mL per organoids e 10 mL per frazioni isolate cripta/villo). La soluzione di lavaggio può consistere sia di PBS con 1% di siero o di PBS con 0,1% detergente e l'1% del siero.
      Nota: Usare il siero dalla stessa specie come quella degli anticorpi secondari. Ad esempio, se gli anticorpi secondari sono stati generati in capra quindi utilizzare siero di capra.
   5. Immediatamente, centrifugare le cripte/villi/organoids a 1.000 x g per 5 min a pellet.
   6. Rimuovere la soluzione di lavaggio e risospendere il organoids/villi/cripte in soluzione di lavaggio fresco.
   7. Posto in un rotatore del tubo con la velocità impostata su 20 giri/min. Lavare le cellule per un totale di 1 h, cubettatura cripte/villi/organoids mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min) ogni 15 min e sostituendo la soluzione di lavaggio.
      Nota: Se un rotatore del tubo non è disponibile quindi invertire i tubi manualmente ogni 5 min per risospendere le culture isolate.
2. Fissazione di formaldeide/metanolo
   Nota: Maneggiare i fissativi e formaldeide in una cappa aspirante.
   1. Risospendere le villi/cripte isolati in 10 mL o organoids in 1 mL di soluzione fissante-20 ° C (9,2 mL di metanolo con 800 µ l di soluzione di formaldeide).
   2. Difficoltà cripte/villi/organoids a-20 ° C in un freezer per 15 minuti e capovolgere la provetta ogni 5 min.
   3. Pellet di cripte/villi/organoids mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min.
   4. Rimuovere il Formaldeide/metanolo e aggiungere la soluzione di lavaggio (1 mL per organoids o 10 mL per frazioni isolate cripte/villo). La soluzione di lavaggio può consistere sia di PBS con 1% di siero di capra o PBS con 0,1% detergente e l'1% del siero.
   5. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids.
   6. Rimuovere la soluzione di lavaggio e risospendere in soluzione di lavaggio fresco.
   7. Posto in un rotatore del tubo con la velocità impostata su 20 giri/min. Lavare le cellule per un totale di 1 h, cubettatura cripte/villi/organoids mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min) ogni 15 min e sostituendo la soluzione di lavaggio.
3. Fissazione di PFA
   Attenzione: Soluzioni e polvere PFA devono essere maneggiati in una cappa aspirante.
   Nota: Nella maggior parte dei casi 4% PFA in PBS è usato ma a seconda della conservazione di antigenicità dell'anticorpo, le concentrazioni più basse possono essere utilizzate.
   1. Risospendere isolati pellettati cripte/villi in 10 mL 4% PFA e incubare a temperatura ambiente per 1 h, e l'isolato pellettato organoids in 1 mL 4% PFA e incubare per 30 min. In entrambi i casi è necessario invertire le provette ogni 10 min.
   2. Pellet di cripte/villi/organoids mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 min.
   3. Rimuovere il PFA e aggiungere la soluzione di lavaggio (1 mL per organoids e 10 mL per isolato cripte/villi). La soluzione di lavaggio è costituito da PBS con 0,1% detergente e l'1% del siero.
   4. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids.
   5. Rimuovere la soluzione di lavaggio e risospendere in soluzione di lavaggio fresco.
   6. Posto in un rotatore del tubo con velocità impostata su 20 giri/min. Lavare le cellule per un totale di 1 h, cubettatura cripte/villi/organoids mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min) ogni 15 min e sostituendo la soluzione di lavaggio.
      Nota: Se un rotatore del tubo non è disponibile quindi invertire tubi manualmente ogni 5 min per risospendere le culture isolate.
   7. Ricupero dell'antigene (passaggio facoltativo consigliato per la fissazione di PFA)
      1. A pellet cripte/villi/organoids mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      2. Aggiungere 1-10 mL di sodio citrato 10 mM a pH 6.0 (pre-riscaldato a 80 ° C) e incubare a 80 ° C per 20 min.
      3. A pellet cripte/villi/organoids mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      4. Aggiungere mL 1-10 di fresco 10 mM sodio citrato a pH 6.0 (pre-riscaldato a 80 ° C) e incubare a temperatura ambiente per 20 min.
      5. A pellet cripte/villi/organoids mediante centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
      6. Lavare in 1-10 mL di PBS con 1% di siero e ripetere un ulteriore 3 volte d'appallottolamento cripte/villi/organoids mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min) prima di aggiungere la soluzione di lavaggio fresco.

4. blocco passo

1. Rendere la soluzione bloccante: aggiungere siero specie anticorpo secondario di 10% in PBS (facoltativo: aggiungere 0,1% detergente).
2. A pellet cripte/villi/organoids mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min) e rimuovere il surnatante.
3. Aggiungere 5-10 mL di soluzione bloccante a seconda del numero di campioni richiesti (Vedi nota sotto). In questa fase, dividere la soluzione di cripte/villi/organoids in tubi singoli (1,5 mL basso associazione microcentrifuga con ogni provetta contenente 0,2 - 1 mL) per la colorazione con gli anticorpi differenti.
   Nota: Ogni frazione isolata cripte/villi darà tra 5-10 campioni che possono essere utilizzati per diverse combinazioni di etichettatura in base alla dimensione del pellet. Idealmente, un pellet di dimensioni tra 2-4 mm è necessaria per ogni campione.

5. primaria dell'anticorpo incubazione

1. Diluire gli anticorpi primari (Vedi Tabella materiali) in PBS contenente 10% di siero e 0,1% di detersivo. Tra 100 e 200 µ l soluzione di anticorpo primario è necessaria per campione di tubo del microcentrifuge.
2. Rimuovere la soluzione bloccante mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min).
3. Risospendere il pellet di cripte/villi/organoid nella soluzione anticorpo primario e incubare a 4 ° C durante la notte utilizzando un rotatore del tubo (20 giri) per mantenere il organoids/villi/cripte in sospensione.
4. Giorno successivo: portare i campioni torna a RT per 1h sul rotatore tubo (20 giri).
5. A pellet il campione mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min) e rimuovere la soluzione di anticorpo primario.
6. Aggiungere 1 mL di soluzione di lavaggio e risospendere il pellet di cripta/villo/organoid.
7. Rimuovere immediatamente la soluzione mediante centrifugazione (1.000 x g per 5 min).
8. Aggiungere 1 mL di soluzione di lavaggio fresco e girare le cellule in un rotatore del tubo (20 giri) per 2 ore. Cambiare la soluzione di lavaggio mediante centrifugazione ogni 30 minuti come descritto al punto 5.7.

6. incubazione dell'anticorpo secondario

1. Diluire gli anticorpi secondari (Vedi Tabella materiali) in PBS con 10% siero e 0,1% detergente. Circa 200 µ l di soluzione di anticorpo secondario è necessaria per campione di tubo del microcentrifuge.
   Nota: Altamente cross-assorbito anticorpi dovrebbero essere usati per ridurre la reattività degli anticorpi secondari in mouse cripta/villo/organoid.
2. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids e risospendere il pellet in 200 µ l di soluzione di anticorpo secondario.
3. Girare i tubi in un rotatore tubo (20 giri) a temperatura ambiente per 1 h.
4. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids e rimuovere i surnatanti (non associata a anticorpi secondari).
5. Risospendere il pellet in soluzione di lavaggio e immediatamente Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids.
6. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di soluzione di lavaggio fresco.
7. Girare su un rotatore tubo (20 giri) RT per 1,5-2 h, sostituire la soluzione di lavaggio ogni 20-30 min, come descritto in precedenza nei passaggi 6,3-6,6.

7. nucleare macchia

1. Diluire la macchia nucleare nella soluzione di lavaggio (secondo il protocollo del produttore), ad esempio DAPI o Hoechst. Ad esempio: (20 mg/mL) di soluzione madre di DAPI è diluito 01:10, 000. La soluzione di riserva possa essere tenuta in aliquote a-20 ° C.
2. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids e rimuovere la soluzione di lavaggio.
3. Risospendere il pellet in soluzione colorante di contrasto nucleare.
4. Girare su un rotatore di tubo (20 giri/min) a temperatura ambiente per 10 min.
5. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids, rimuovere la soluzione di macchia nucleare e risospendere il pellet in soluzione di lavaggio.
6. Girare in un rotatore di tubo (20 giri/min) a temperatura ambiente per 30-60 min, cambiando la soluzione di lavaggio ogni 10 min.

8. montaggio isolato cripte, Villi e Organoids

1. Centrifugare a 1.000 x g per 5 min a pellet cripte/villi/organoids e rimuovere tutta la soluzione di lavaggio.
   Nota: Se il pellet si disperde, poi Centrifugare nuovamente.
2. Aggiungere 2 gocce di difficile impostazione supporti di montaggio con antifade agente al pellet.
3. Tagliare l'estremità di una micropipetta P200 e attentamente risospendere il pellet in mezzi di montaggio. Evitare la generazione di bolle.
   Nota: Le culture organoid isolato sono molto appiccicose; Assicurarsi che risospendere completamente.
4. Utilizzare la micropipetta per trasferire la miscela di cripte/villi/organoids nella soluzione di supporti di montaggio e dispensare in una linea lungo il centro di un vetrino da microscopio.
   Nota: La riga non deve essere più lungo il vetro di copertura che deve essere utilizzato. Verifica utilizzando un microscopio stereoscopico se cripte/villi/organoids sono ben distribuite su diapositiva e non raggruppato.
5. Posizionare un vetro di copertura sopra la parte superiore; evitare la generazione di bolle.
6. Collocare il vetrino in un libro di diapositiva e conservare in frigorifero durante la notte per il supporto di montaggio impostare prima di analizzare su un microscopio confocale.
   Nota: Per l'anticorpo del mouse colorazione nel tessuto del mouse, utilizzare l'immunofluorescenza commerciale kit (Vedi Tabella materiali). Sostituire il blocco passo (sezione 4) con un blocco di 10 min con proteina soluzione bloccante seguita da un'incubazione di 1 h con il reagente bloccante che viene fornito con il kit. Quindi al punto 5.8 (nel mezzo di lavaggio) aggiungere un 1 h di incubazione con il reagente enhancer segnale di fluorescenza. Quindi utilizzare reagenti del kit in fluorescente diluente (altri anticorpi secondari possono essere utilizzati anche in combinazione con questo reagente). Incubare come sopra e procedere dal punto 6 con il resto del protocollo.

9. la fissazione e Immuno-etichettatura dei Organoids all'interno della matrice di seminterrato

Nota: Organoids destinati per la fissazione e immuno-etichettatura pur rimanendo all'interno della matrice di seminterrato sono stati generati nel seminterrato matrice cupole in cima a lamelle di vetro rotondo in una piastra a 24 pozzetti (una cupola per pozzetto). Le cupole di matrice organoid seminterrato sono state elaborate entro la piastra a 24 pozzetti dall'aggiunta e la rimozione delle varie soluzioni.

1. Rimuovere il mezzo da pozzi e aggiungere il fissativo; lasciare per 1 h.
2. Rimuovere il fissativo e lavate in PBS contenente 1% siero e 0,1% detergente per 2 h, cambiando ogni 30 min.
3. Rimuovere la soluzione di lavaggio e bloccare in PBS con 10% siero e 0,1% detergente per 1 h.
4. Diluire gli anticorpi in PBS con 1% di siero o di PBS con 1% di siero e 0,1% di detersivo.
5. Rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 100-200 μL anticorpo primario (Vedi Tabella materiali) soluzione in ciascun pozzetto.
   Nota: è importante rimuovere tutta la soluzione bloccante per non diluire ulteriormente gli anticorpi.
6. Posizionare il piatto in frigorifero e incubare per una notte a 4 ° C
7. Poi lasciare a temperatura ambiente per 1-2 h.
8. Rimuovere la soluzione di anticorpo e lavare per 2-3 h sostituire la soluzione di lavaggio ogni 20 min.
9. Rimuovere tutte le soluzione di lavaggio e aggiungere 100-200 μL anticorpi secondari diluito (Vedi Tabella materiali) in PBS con 1% di siero; Incubare per 1 h a TA.
10. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario e lavare per 2 h, cambiando ogni 20 min.
11. Rimuovere la soluzione di lavaggio ed aggiungere la soluzione DAPI; lasciare per 10 min a soluzione di riserva di RT. uso DAPI (20 mg/mL) diluito a 01:10, 000.

Isolamento del tessuto intestinale per immuno-etichettatura
I protocolli di isolamento del tessuto descritto per il colon e intestino tenue sono stati ottimizzati per la conservazione e l'immuno-etichettatura dei microtubuli e proteine associate, ma non per attuabilità delle cellule staminali e generazione organoid (Figura 1 e tabella 1 ). Lo scopo era di generare la cripta e fazioni del villo che erano come pulito (privo di muco e altri tessuti) possibile, riducendo al minimo l'esposizione a EDTA e freddo per preservare la struttura e impedire la depolimerizzazione dei microtubuli con soluzioni fredde di ghiaccio, che inducono depolimerizzazione dei microtubuli tutti, ma stabili. Nella figura 2 vengono illustrati esempi di immagini di frazioni 2 e 3 da tessuto intestinale piccolo isolato, con 2 frazione contenente una miscela di entrambi i villi e cripte (Figura 2A, B), mentre 3 frazione contiene principalmente cripte (Figura 2 D).

Fissazione e l'immuno-etichettatura di tessuto intestinale isolato
Le frazioni di singole o combinate sono stati poi elaborate per la fissazione e immuno-identificati attraverso una serie di passaggi tra cui fissazione, detersivo, blocco, anticorpo e lavaggio soluzioni, prima di ri-sospendere le villi/cripte finale pellet in mezzi di montaggio, trasferimento a diapositive e coprendo con lamelle di vetro. Le cripte e villi erano imaged quindi su un microscopio confocale.

Buona conservazione ed etichettatura dei microtubuli e actina sia villi e cripte è stata realizzata da quanto segue: una combinazione di fissazione di formaldeide/metanolo a-20 ° C, ripetuto lavaggio in PBS contenente siero di detersivo e 1% 0,1% e blocco in PBS con 0,1% detergente e 10% di siero, seguito da incubazione overnight a 4 ° C in anticorpi primari e quindi 2h in anticorpi secondari a temperatura ambiente (Figura 3). Fissazione di formaldeide/metanolo inoltre ha funzionato bene per etichettatura + suggerimenti come l'EBs e CLIP-170 in cripte isolate e villi (Figura 4). EB3 accumulazioni plus-fine dei microtubuli (noti come comete) erano evidenti nelle cripte (Figura 4A), mentre l'associazione lungo il reticolo dei microtubuli stabili potrebbe essere visto nei campioni di villi (Figura 4). Localizzazione distinta di CLIP-170 e p150incollato (subunità del dynactin) era chiaramente evidente presso la n-MTOCs apicale nei villi isolati (Figura 4B). La fissazione con il protocollo di formaldeide/metanolo non funzionava costantemente per la localizzazione di ninein in tessuto intestinale isolato usando il nostro anticorpo Pep3 contro ninein del mouse. Tuttavia, fissazione di metanolo a-20 ° C seguita dal lavaggio stesso e blocco soluzioni per quanto riguarda la formaldeide/metanolo ha dato molto buona localizzazione del ninein all'interno di cripte isolate e villi (Figura 5;8di riferimento). È interessante notare che, mentre ninein è concentrata presso la centrosomi apicale qualche accumulo alla base delle cellule era evidente in alcune cellule all'interno di cripte isolati (Figura 5). Se ciò è dovuto il contrassegno non specifico o una conseguenza della procedura di isolamento, il delaying fissazione (e influenzando così la conservazione) avrà bisogno ulteriore indagine. Tuttavia, metanolo-fisso (-20 ° C) le sezioni criostato dei villi (Vedi Figura 3bi 8) hanno anche rivelato ninein dalla cella base in alcune cellule, suggerendo che ninein può anche associare una popolazione basale dei microtubuli.

Fissazione e immuno-etichettatura dei organoids isolato dalla matrice seminterrato
Piccolo organoids intestinale erano generato e cresciuto nella matrice seminterrato per tre settimane o più (Figura 6A; riferimento6,15). Un freddo (4 ° C) soluzione di recupero cellulare è stato utilizzato per isolare organoids dalla matrice dello scantinato. La soluzione di matrice depolimerizzata seminterrato con organoids è stata trasferita ai tubi e centrifugata prima della fissazione e immuno-etichettatura. Questo prodotto preparazioni molto puliti e ha permesso di raggiungere il organoids per le varie soluzioni. Le cellule differenziate all'interno dei domini di villo organoid contengono microtubuli apico-basale stabili; questi con l'etichetta bene nella maggior parte dei casi (Figura 6B, C) ed EB1 potrebbe anche essere visto lungo il reticolo dei microtubuli (Figura 6E; riferimento13). Tuttavia, la soluzione di recupero di cella fredda può provocare depolimerizzazione dei microtubuli dinamici, che era evidente in alcuni campioni dalla mancanza di comete EB1 (che si legano alla plus-fine dei microtubuli crescenti) all'interno dei domini di cripta basale (Figura 6F ). In altri campioni, astrali microtubuli (dinamici) sono stati conservati (Figura 6). Organoid isolamento prima della fissazione e immuno-etichettatura ha lavorato anche per proteine giunzionali, ninein, CLIP-170 e gli indicatori delle cellule, quali mucina per le cellule di calice e chromogranin A per cellule enteroendocrine.

Fissazione e immuno-etichettatura dei organoids all'interno della matrice di seminterrato
Figura 7 Mostra un organoid nella fase di ciste (A–C) e in una fase iniziale di sviluppo cripta (D), fissa in formaldeide/metanolo e immuno-etichettati per microtubuli e ninein. Microtubulo buona conservazione ed etichettatura nonché di etichettatura per ninein presso apicale n-MTOCs era evidente. Figura 8A, B indica un dominio cripta entro un giorno 6 organoid fissati con il protocollo di metanolo ed etichettati per microtubuli ed EB1. Buona conservazione dei microtubuli ed EB1 comete era evidente suggerendo conservazione della dinamica dei microtubuli.

Organoids erano anche fisso e immuno-etichettato pur rimanendo all'interno della matrice di seminterrato. Gli svantaggi di questa procedura potrebbero essere scarsa penetrazione del fissativo e intrappolamento degli anticorpi all'interno della matrice di seminterrato (Figura 8B), anche se in entrambi i casi meno frequentemente quando 0,1% detergente è stato incluso nel fissativo e/o lavare soluzioni. Inoltre, 4% PFA fatto non conserva la matrice seminterrato ben ma causato a dissolversi, anche se questo era meno così con 1% PFA.Fissazione di metanolo, d'altra parte, talvolta indotto crollo organoid.

Etichettatura con alcuni anticorpi come l'indicatore di cella di cellule staminali marcatore Lgr5 e Paneth CD24 dimostrato infruttuoso con i protocolli PFA, metanolo o formaldeide/metanolo di 4%. Tuttavia, il organoids di fissaggio all'interno della matrice di seminterrato con 1% PFA in PBS con 0,1% detergente a temperatura ambiente ha provocato l'etichettatura per entrambi Lgr5 e CD24 (Figura 9).

Figura 1: isolamento di piccoli villi intestinali e cripte. Diagramma di flusso dei passaggi chiave nella cripta isolamento prima della fissazione e immuno-etichettatura e piccolo del villo intestinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: isolato villi e cripte dal mouse tenue. Campo chiaro immagini al microscopio delle frazioni intestinale mostrando villi (frecce grandi) e cripte (piccole frecce). (A, B) Frazione 2 contiene una miscela di villi e cripte e conservazione della morfologia sui villi coriali e cripta è evidente in B. (C, D) Frazione 3 Mostra isolamento delle cripte e l'assenza di villi e cripte intatte, tra cui una cripta biforcata in C. Scala bar = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: isolato piccolo villo intestinale e cripta fisso in formaldeide/metanolo e immuno-etichettati per microtubuli e actina. Schema (A) dell'epitelio del villo e cripta con diversi tipi di cellule indicato. Le caselle evidenziate indicano le regioni rappresentante imaged in B e C. (B, C) Sezioni ottiche confocale attraverso parte di un campione di villo (B) e la cripta basale (C) isolato dal piccolo intestino utilizzando 30 mM EDTA e fissate in formaldeide/metanolo, lavate in PBS contenente 1% capra del siero e 0,1% detergente, bloccato in PBS contenente 10% di siero di capra e 0,1% detergente ed etichettati per microtubuli con anticorpo di topo monoclonale anti-tubulina (verde) e per l'actina con anticorpo di coniglio policlonale anti-β-actina (rosso). Ben conservato apico-basale fasci di microtubuli sono evidenti nelle cellule dei villi coriali e la cripta e l'actina può essere visto concentrate nella regione apicale rivolto verso il lume (freccia). Scala bar = 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Isolato piccolo intestinale cripta e villi fissi in formaldeide/metanolo e immuno-etichetta per i microtubuli, EB3, p150incollatoe CLIP-170. Confocale sezioni ottiche delle regioni cripta e villi isolato dal piccolo intestino utilizzando 30 mM EDTA e fissate in formaldeide/metanolo, lavata in PBS contenente 10% di siero di capra e 0,1% detergente, bloccato in PBS contenente 10% di siero di capra e detersivo 0,1%, e immuno-etichettati. (A) cripta etichettati con anticorpo policlonale α-tubulina coniglio (rosso) e un anticorpo EB3KT36 monoclonale di topo (verde) e macchiato per DNA con DAPI (blu) che mostra i microtubuli apico-basale ed EB3 comete. L'immagine invertita singolo canale mostra chiaramente EB3 comete in tutto le cellule basali cripta suggerendo la buona conservazione delle dinamiche ma anche stabili microtubuli. Villo (B) cellule epiteliali etichettate con anticorpo policlonale di CLIP-170 coniglio (rosso, vedi anche riferimento16) e il mouse co-localizzazione di monoclonale p150Glued anticorpo (verde) mostrando apicale. Immagini di canale singolo invertito sono riportate di seguito. (C) cellule del villo etichettato con anticorpo policlonale α-tubulina coniglio (rosso) e l'anticorpo di topo monoclonale EB3-KT36 (verde) e macchiato per DNA con DAPI (blu) che mostra i microtubuli apico-basale con EB3 lungo il reticolo. L'associazione di grata EB3 è evidenziato nell'immagine ingrandita mentre l'immagine invertita monocanale suggerisce sia EB3 comete e associazione della grata. Scala bar = 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: isolato del colon cripta fissate in metanolo, immuno-etichettati per ninein ed E-caderina e colorato con DAPI. Sezione ottica confocale di basale e regione di transito-amplificando di una cripta isolato dal colon utilizzando 3 mM EDTA e fissate in metanolo, lavate in PBS contenente siero di capra 1% e 0,1% detergente e bloccato in PBS contenente detergente di siero e 0,1% di capra 10%. La cripta è stata etichettata con anticorpi policlonali ninein di coniglio (Pep3, veda inoltre riferimento8, rosso) e mouse (verde) E-caderina anticorpo monoclonale e macchiato con DAPI (blu). L'immagine invertita singolo canale Mostra ninein solo. L'immagine mostra una cripta ben conservata con E-caderina rivelando il contorno delle singole celle e ninein concentrata presso la centrosomi apicale. Essa suggerisce buona penetrazione del fissativo e gli anticorpi e la conservazione dell'antigenicità. Barra della scala = 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: sviluppo Organoid, fissazione e immuno-etichettatura di isolato organoids. (A) fase contrasto immagini che mostra diverse fasi di sviluppo organoid da aggregati cellulari per cisti con iniziazione di bud e completamente formata organoids con domini cripta e villi coriali.(B–F) Sezioni ottiche confocale attraverso organoids isolato dalla matrice di seminterrato utilizzando la soluzione di recupero di cella a 4 ° C (10 min) seguita dalla fissazione di formaldeide/metanolo, lavaggio in PBS contenente 10% di siero di capra e 0,1% detergente, bloccando in PBS contenente 10% capra siero e 0,1% detergente e immuno-etichettatura per i microtubuli, β-catenina ed EB1. (B) Organoid ciste etichettata per microtubuli (blu) e β-catenina (rosso) rivelando conservazione buona microtubule etichettatura e nella maggior parte delle cellule. (C) distinti apico-basale microtubuli sono evidenti in queste cellule epiteliali allargate da una ciste organoid. (D) divisione delle cellule con l'etichetta per i microtubuli risultati mandrini tra cui microtubuli astrali (dinamici) (freccia). (E, F) Dominio del villo (E) e cripta dominio (F) organoid regioni mostrando alcuni EB1 etichettatura lungo il reticolo dei microtubuli stabili, soprattutto in villo, mentre pochissimi EB1 comete sono visibili anche all'interno della cripta basale suggerendo che dinamiche non sono stati conservati i microtubuli. Scala bar = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E-F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Organoids fisso all'interno della matrice di seminterrato in formaldeide/metanolo e immuno-etichettati per microtubuli e ninein. Confocale sezioni ottiche dei organoids fissate in formaldeide/metanolo, lavato e bloccato in PBS contenente 10% di siero di capra e 0,1% detergente ed etichettato pur rimanendo nella matrice seminterrato. (A–C) Ciste organoid etichettati per microtubuli (verdi) e ninein (Pep3; riferimento8, rosso) e colorato con DAPI (blu), mostrando l'immagine unita a e invertito immagini monocanale per microtubuli (B) e ninein (C). Le immagini mostrano i microtubuli apico-basale e apicale ninein localizzazione, suggerendo molto buona conservazione strutturale del organoid e penetrazione degli anticorpi così come compensazione di anticorpi non legati. (D, E) Organoid con sviluppo di cripta fisso ed etichettati come sopra e ancora mostrando ottima conservazione strutturale, l'etichettatura e la compensazione degli anticorpi. Distinti microtubuli apico-basale e apicale n-MTOC ninein localizzazione è evidente ed evidenziata nell'immagine ingrandita (E) della regione "in box" in D. Barre di scala = 10 μm (A-D); (E) di 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Organoids fisso all'interno della matrice di seminterrato in metanolo e immuno-etichettati per microtubuli ed EB1. Confocale sezioni ottiche dei organoids fissate in metanolo, lavato e bloccato in PBS contenente siero di capra 10% e 0,1% detergente ed etichettati, pur rimanendo nella matrice seminterrato. (A) ciste dominio da una completamente sviluppato organoid etichettato con coniglio policlonale α-tubulina (rosso) e il mouse anticorpi monoclonali EB1 (verde) che mostra i microtubuli apico-basale, mandrini (freccia) in due e la divisione delle cellule e distinti EB1 comete. Alcuni trapping di anticorpi non legati EB1 è evidente. Tuttavia, la buona conservazione strutturale e l'etichettatura dei microtubuli ed EB1 è osservato. La presenza di comete EB1 suggerisce che la dinamica dei microtubuli sono stati conservati (A, Inverti). (B) invertito immagine della regione di ciste organoid risultati α-tubulina anticorpo etichettatura con anticorpi considerevoli intrappolato all'interno della matrice circostante di seminterrato (freccia). Scala bar = 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Organoids fissata all'interno della matrice di seminterrato in 1% PFA e immuno-etichettati per Lgr5 e CD24. Confocale sezioni ottiche dei organoids fisso all'interno della matrice di seminterrato in 1% PFA in PBS contenente 0,1% detergente, lavate in PBS con siero di capra 1% e 0,1% detergente ed etichettati con anticorpi contro Lgr5 e CD24. (A, B) Nicchia delle cellule staminali all'interno di un dominio di cripta mostrando cellule di Paneth positivo per CD24 (rosso). Le immagini di contrasto confocale e fase sono state unite nell'A. B indica il singolo canale di CD24 etichettatura. (C) cellule staminali regione all'interno di un dominio di cripta mostrando un Lrg5 positivo delle cellule staminali. Barre di scala = 10 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Timeline della piccola isolamento cripta e villi intestinale e fissaggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.