È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

7.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

26 dicembre 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Abstract

I macrofagi sono fagocitiche cellule dell'immunità innata, che avviare le risposte immunitarie ai patogeni e contribuiscono alla restituzione di tessuto e di guarigione. I macrofagi sono ugualmente importanti nella disattivazione le risposte infiammatorie. Abbiamo dimostrato che i macrofagi stimolati con l'immunoglobulina endovenosa (IVIg) possono produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria, interleuchina 10 (IL-10) e bassi livelli di citochine pro-infiammatorie in risposta a lipopolisaccaridi batterici ( LPS). IVIg è che un anticorpo polivalente, principalmente immunoglobulina Gs (IgG), riuniti dal plasma di donatori di sangue più di 1.000. Serve a integrare gli anticorpi nei pazienti con deficienze immunitarie o sopprimere le risposte immunitarie in pazienti con condizioni autoimmuni o infiammatorie. Infliximab, un anticorpo di terapeutico anti-tumore necrosi fattore alfa (TNFα), ha anche dimostrato di attivare i macrofagi a produrre IL-10 in risposta a stimoli infiammatori. IVIg e altri biologici basati su anticorpi possono essere testati per determinare i loro effetti sull'attivazione del macrofago. Questo articolo descrive metodi per la derivazione, la stimolazione e la valutazione del midollo osseo murino macrofagi attivati da anticorpi in vitro e macrofagi peritoneali murini attivati con anticorpi in vivo. Infine, dimostriamo l'utilizzo di western blotting per determinare il contributo di specifici percorsi di attività antinfiammatoria del macrofago di segnalazione delle cellule. Questi protocolli possono essere utilizzati con topi geneticamente modificati, per determinare l'effetto di una specifica proteina su attivazione macrofagica anti-infiammatori. Queste tecniche è utilizzabile anche per valutare se biologics specifico può agire modificando i macrofagi a uno stato di attivazione anti-infiammatori producono IL-10 che riduce le risposte infiammatorie in vivo. Questo può fornire informazioni sul ruolo dell'attivazione macrofagica nell'efficacia dei farmaci biologici durante modelli di malattia in topi e forniscono approfondimenti un potenziale nuovo meccanismo di azione nelle persone. Al contrario, questo può ammoniscono contro l'uso dei farmaci biologici basati su anticorpi specifici per il trattamento di malattie infettive, soprattutto se i macrofagi svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro l'infezione.

Introduzione

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata, che svolgono i ruoli multipli nella risposta immunitaria alle infezioni o lesioni. I macrofagi sono responsabili dell'avvio di una risposta immunitaria a danno di tessuto o di infezione, fermare la risposta infiammatoria e promuovere la guarigione di risposta1. Esempi dei tre stati di attivazione meglio studiati macrofago sono: 1) macrofagi trattati con interferone gamma (IFNγ) e lipopolisaccaride batterico (LPS), designato M (IFNγ + LPS), che contribuiscono alla risposta infiammatoria. 2) macrofagi stimolati con l'interleuchina 4 (IL-4), M(IL-4), che sono associati con la risposta di guarigione; 3) macrofagi stimolati con immunocomplessi (IC) e LPS, M (IC + LPS), che hanno la capacità di spegnere la risposta infiammatoria2,3. M (IC + LPS) sono distinti dai macrofagi di cicatrizzazione M(IL-4) e non esprimono l'arginasi enzima (Arg-1) o FIZZ14. Il miglior marcatore per questi macrofagi infiammatori è loro cytokine produzione5. I macrofagi hanno ruoli multipli nel mantenimento della salute, ma anche contribuiranno a malattie infiammatorie e cancro3. Per questo motivo, i macrofagi sono un fondamentale obiettivo terapeutico per il trattamento di un'ampia varietà di malattie. È importante studiare gli effetti degli anticorpi sul loro stato di attivazione di sviluppare trattamenti basati su macrofago per malattia.

Il focus di questa carta è sull'uso dei macrofagi del midollo osseo murino derivato (BMDMs) e macrofagi peritoneali di testare l'effetto di droghe dell'anticorpo su risposte infiammatorie in vitro e in vivo. Recentemente, ci sono stati più studi che mostrano gli effetti degli anticorpi il macrofago attivazione6,7,8. Macrofagi co-attivati con complessi immuni, che sono anticorpi complessati con un antigene e LPS, uno stimolo infiammatorio normalmente, producono livelli molto elevati della citochina antinfiammatoria IL-10 e livelli molto bassi di citochina pro-infiammatoria, interleuchina 12 (IL-12)9. Inoltre, infliximab, un anticorpo monoclonale contro il TNFα, è stato trovato a lavorare, in parte, inducendo antinfiammatori macrofagi attraverso suo frammento cristallizzabile (Fc) regione7. Abbiamo segnalato che IVIg + LPS inducono l'attivazione del macrofago antinfiammatori che è simile a M (IC + LPS), in cui co-stimolato i macrofagi producono grandi quantità di IL-10 e basse quantità della subunità citochina pro-infiammatoria Interleukin 12 o 23 p40 ( IL-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) e TNF8. IVIg è un farmaco composto da anticorpi policlonali, principalmente IgG, che è stata riunita dal sangue di più di 1.000 donatori10. Esso è usato per trattare una vasta gamma di malattie immunologiche, come purpura thrombocytopenic idiopatico e polineuropatia demielinizzante cronica, ma il suo meccanismo d'azione non è completamente capito11. Gli effetti delle droghe dell'anticorpo basato sull'attivazione del macrofago possono essere valutati utilizzando i metodi descritti nel presente documento.

Gli effetti dei farmaci biologici specifici sull'attivazione del macrofago possono essere testati in BMDMs e macrofagi peritoneali. Utilizzando queste fonti del macrofago consente la valutazione di cellule primarie. Test preliminari di anticorpi su cellule in coltura primaria richiede meno tempo e investimento monetario rispetto ad altri modelli di malattia che richiede tempo e costoso. Iniettare una droga in un topo sano in vivoe isolando le cellule e analizzarli ex vivo, si può determinare se gli studi sono autorizzati per valutare se il trattamento con farmaci biologici colpisce l'attivazione del macrofago in modelli di malattia.

Con pochi studi test direttamente l'effetto delle terapie biologiche sul macrofago attivazione in vitro e in vivo , le nostre tecniche forniscono un vantaggio rispetto a tecniche alternative. Le attuali tecniche comportano test effetti di farmaci biologici su cellule miste popolazioni in vitro, ad esempio l'effetto di infliximab in una reazione linfocitaria mista (MLR) o IVIg su macrofagi umani in cellule mononucleari di sangue periferico, dove l'effetto non può essere attribuita a una cella specifica tipo7,12. Utilizzando BMDMs e macrofagi peritoneali è vantaggioso rispetto all'utilizzo di linee cellulari, quali le cellule RAW 264.7, che non producono le citochine pro-infiammatorie, IL-12, in risposta a LPS8,13. Verificare l'effetto di un farmaco a base di anticorpi sul macrofago risposte ex vivo ha vantaggi perché risposte di citochina possono essere attribuite direttamente ai macrofagi, piuttosto che la deduzione di risposte del macrofago misurando i livelli di citochina del siero14 . BMDMs e macrofagi peritoneali possono essere derivati e isolati da topi geneticamente modificati per determinare il ruolo specifico di una proteina in attivazione macrofagica anti-infiammatori. Ad esempio, abbiamo utilizzato Il10 carente(- / -) BMDMs per dimostrare che IVIg-indotta di riduzione della produzione di citochine pro-infiammatorie dipende parzialmente dal-108. Meccanismo di azione di un farmaco può essere studiato usando macchiarsi occidentale, dove può essere determinato il ruolo delle proteine specifiche e segnalazione eventi. Reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) può essere eseguita su BMDMs o macrofagi peritoneali di mostrare pattern di espressione genica che derivano dall'attivazione dell'anticorpo. Modelli di malattia in topi possono fornire informazioni sull'efficacia potenziale di anticorpo-ha basato le terapie biologiche nei modelli per le malattie infiammatorie intestinali malattia, artrite reumatoide ed il cancro15,16, 17. Tuttavia, le tecniche qui descritte forniranno informazioni sul meccanismo di azione di questi farmaci biologici determinando se essi inducono l'attività antinfiammatoria del macrofago.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of British Columbia.

1. del midollo osseo del macrofago derivazione e attivazione con anticorpi

  1. Eseguire l'eutanasia usando CO2 asfissia.
    1. Del mouse posto nella camera di induzione. Eutanasia, mouse con 5% isoflurane anestesia, per 60-90 s, fino a quando l'immobile e la respirazione è profondo e lento.
    2. Spegnere l'anestesia isoflurano e amministrare di CO2 del 6-8 L/min fino a quando il mouse ha smesso di respirare. Lasciare mouse con CO2 per almeno altri 5 min verifica che non c'è più un battito cardiaco o la respirazione. Eseguire una dislocazione cervicale per assicurare la morte.
      Nota: 8-12 settimane vecchi topi forniscono il più alto rendimento dei macrofagi.
  2. Spray gambe del mouse con etanolo al 70% e bloccarli con braccia e gambe distese nella posizione supina sopra un bordo della gomma piuma. Con forbici e pinze per tenere la pelle, fate un taglio superficiale (0,2 cm) per rimuovere la pelle e del pelo dalla superficie di ciascuna delle zampe posteriori.
    Nota: Eseguire questa procedura e tutte le manipolazioni di cultura del tessuto in una cappa sterile.
  3. Tagliare il muscolo per rendere visibile delle tibie e femori. Rimuovere le tibie e femori, tagliando l'osso e i muscoli appena sotto l'articolazione dell'anca e sopra le caviglie. Tagliare come muscolo molto possibile.
  4. Spruzzare le ossa con etanolo al 70% e attendere 1 minuto per farlo evaporare, poi metterli in ben 6 piastra di medie a livello osseo (Iscove modificato medio di Dulbecco (IMDM), 10% siero bovino fetale (FBS)).
  5. Tagliare le estremità delle ossa di taglio 0,1 cm dell'osso fuori della caviglia e la parte superiore del femore in modo che la cavità dell'osso è esposto. Assicurarsi che il midollo è visibile e un ago di 26 calibro può essere posizionato nella cavità dell'osso.
  6. Tagliare le ossa e i muscoli per separare le tibie e femori da articolazioni del ginocchio. Inserire un ago di 26 calibro collegato a una siringa da 10 mL nella cavità. Sciacquare il midollo osseo in una provetta conica da 50 mL con 5 mL di osso a filo medio. Lavare due tibie e due femori, da un mouse, in ogni provetta da 50 mL.
  7. Pipettare su e giù parecchie volte o vortice il midollo a bassa velocità per disperdere delicatamente ciuffi. Stringhe del midollo devono essere suddiviso in macchie di piccolo (meno di 0,5 mm) del midollo. Riempire la provetta conica a 50 mL con l'osso a filo medio. Pipetta contenuto della provetta conica in una cultura di tessuto2 75 cm trattati boccetta e incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per 1 h.
    Nota: Macrofagi maturi e cellule mesenchimali diventerà aderente al pallone ed essere scartato, mentre i progenitori ematopoietici desiderati rimangano in sospensione.
  8. Dispensare il mezzo con progenitori ematopoietici in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare la provetta a 300 x g e a temperatura ambiente per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura (MCSF) fattore di stimolazione della Colonia del macrofago (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL di penicillina/streptomicina e 150 μM monothioglycerol (MTG)).
  9. Contare le celle utilizzando un emocitometro18. Aggiungere il terreno per risospendere le cellule ad una concentrazione di 0,5 x 106 cellule/mL, 1,5 x 107 cellule/boccetta in 30 mL di terreno e pipettare su e giù delicatamente. Pipettare 30 mL di sospensione in un matraccio da nuova coltura di tessuti trattato2 di 75 cm.
  10. Il giorno 4 e 7 ° giorno dopo la coltura iniziale nel passaggio 1,9, verificare che le cellule siano aderenti e leggermente ramificata utilizzando un microscopio a campo chiaro contrasto fase invertita. Scartare il supporto che contiene le cellule non-aderenti. Lavare le cellule con IMDM una volta e aggiungere 30 mL di terreno di coltura MCSF.
  11. Quando le cellule sono mature di giorno 10 (> 95% positivo per F4/80 e Mac-1), verificare di nuovo che le cellule sono aderenti e leggermente.
  12. Piastra di cellule per stimolazioni, rimuovere il terreno di coltura dalla beuta e aggiungere 8 mL di tampone di enzima libero, basato su EDTA cella dissociazione (Tabella materiali). Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C, 5% CO2.
  13. Raschiare delicatamente, cellule con una piccola quantità di pressione, con una spatola sterile cella. Check-nel microscopio che cellule staccato dalla superficie del pallone. Pipettare cellule dissociate in una provetta conica da 50 mL. Risciacquare il matraccio 3 volte con 5 mL di IMDM e piscina la soluzione di risciacquo con le cellule che sono state raccolte. Centrifugare le cellule a 300 x g a temperatura ambiente per 5 min.
  14. Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di terreno di coltura MCSF a tubo conico da 50 mL. Conteggio di cellule vitali utilizzando un emocitometro18. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL e piastra 100 µ l di sospensione cellulare (1 x 105 cellule/pozzetto) per pozzetto di una cultura di tessuto 96 pozzetti trattata, piatto fondo piatto.
    Nota: Le ossa da un mouse genererà abbastanza cellule per 100 pozzi. Se lo si desidera, 1 mL di cellule può essere placcato in una piastra a 6 pozzetti (coltura di tessuti trattati, fondo piatto). Un numero maggiore di cellule (1 x 106 cellule) può essere utile per analisi western blot.
  15. Una volta che è aderente, stimolare duplicato o triplicato pozzetti ciascuna con 10 ng/mL di LPS in IMDM, 30 mg/mL di IVIg, o IVIg + LPS. Dosi di LPS o IVIg possono essere titolate per ottimizzare le risposte. Lasciare i pozzetti duplicati o triplice copia come controlli non stimolati. Li Incubare per 24 h (37 ° C, 5% CO2).
    Nota: Ri-placcate cellule dovrebbero aderire pozzi di coltura del tessuto all'interno di 1 h.
  16. Raccogliere i surnatanti delle cellule da ciascun pozzetto in microcentrifuga individuali 1,7 mL e rimuovere particelle estranee di filatura a 10.000 x g per 5 min.
  17. Rimuovere il surnatante delle cellule ed evitare di disturbare il pellet. Mettere la cella chiarificata surnatante in una provetta da microcentrifuga sterile.
    Nota: I surnatanti delle cellule possono essere analizzati per citochine, IL-10 e subunità di citochina, IL-12 / 23p 40, dall'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) immediatamente, o conservati a-80 ° C a lungo termine. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali). Altre citochine pro-infiammatorie può essere analizzato, come IL-6 e TNF, come sono anche ridotti dal co-trattamento con IVIg + stimolazione dei LPS rispetto alla stimolazione con LPS da solo. Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche quali macchiarsi occidentale o quantitativa della polimerasi reazione a catena (Q-PCR) 19,20.

2. impegnativo topi In Vivo con IVIg e macrofagi peritoneali di raccolta

  1. Pesare ogni mouse.
Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo per ogni mouse.
Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di IVIg è richiesto.
  • Disegnare la quantità necessaria di IVIg in una siringa sterile da 1 mL dotata di una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, somministrare un volume equivalente di dose di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS), pH 7,4 invece di IVIg.
  • Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.
  • Posizionare l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, in rilievo fino e inserire 1,5 cm dell'ago. Iniettare l'IVIg o PBS intraperitonealmente. Aspettare 1 ora.
  • Eutanasia di topi con l'anestesia di isoflurano 5% seguita da 6-8 L/min CO2 asfissia (vedere i passaggi 1.1.1 - 1.1.2), o secondo orientamenti etici dell'istituzione.
  • Pin il mouse a un bordo della gomma piuma, con le membra sparse. Spruzzare le parti con etanolo al 70%.
    Nota: Eseguire la procedura in una cappa sterile.
  • Fate un taglio superficiale della pelle (0,2 cm) con le forbici lungo la linea mediana del mouse, per evitare di tagliare la cavità peritoneale. Tirare la pelle addominale fuori pancia del mouse usando il forcipe, affinché il rivestimento della parete peritoneale intatto è visibile.
  • Riempire una siringa da 5 mL con 5 mL di PBS sterile (pH 7.4). Inserire un 25 o 27 ago nella parte superiore della cavità da sinistra o da destra verso il centro del mouse con la smussatura dell'ago del manometro fino.
    Nota: Inserire l'ago con attenzione nel topo affinché non si inietti PBS negli organi, ma piuttosto, nello spazio peritoneale.
  • Spingere il fluido nella cavità peritoneale. Estrarre l'ago dalla cavità e massaggiare il peritoneo per 10 s per rimuovere tutte le cellule. Inserire l'ago nella parte superiore della cavità ed evitare gli organi. Raccogliere e mettere il liquido di lavaggio recuperato in una provetta conica da 15 mL sul ghiaccio.
    Nota: Per ogni 5 mL di fluido iniettato, saranno recuperati circa 3,75 mL.
  • Ripetere l'iniezione e recupero (passaggi 2,8-2,9) 3 più volte (volume di iniezione totale di 20 mL), per recuperare 15 mL di liquido di lavaggio in totale. Raccogliere il lavaggio da ogni mouse in una provetta conica separato da 15 mL.
    Nota: Dopo l'ultima iniezione, potrebbe essere più facile estrarre il liquido dal lato lontano destro e sinistro del mouse, dove ha accumulato fluido. Gli organi causerà meno interferenze con l'ago in questa posizione.
  • Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in 500 μL di placcatura medio (IMDM, 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina) per topo svuotata. Conta Vitali macrofagi utilizzando un emocitometro18.
    Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali. Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio.
    Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi per rimuoverli, utilizzando il buffer di lisi del globulo rosso di 1x secondo le istruzioni del produttore.
  • Risospendere le cellule in mezzo a 1 x 106 macrofagi/mL di placcatura e 100 μL per pozzetto in una piastra di coltura di tessuti trattato 96 pozzetti piatto inferiore della lastra.
    Nota: Potrebbe essere necessario al pool di cellule da più di un mouse per un esperimento se utilizza in triplice copia pozzi o titolazione stimolanti. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria. Non ci sarebbe abbastanza cellule per 5 pozzi, o 1 esperimento in duplice copia, con una dose di LPS.
  • Incubare le cellule per 1 h a 37 ° C, 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente. Le cellule aderenti sono macrofagi peritoneali. Rimuovere i surnatanti delle cellule e cellule non aderenti. Lavare i pozzetti due volte con 200 μL IMDM (pre-riscaldato a 37 ° C), attendere 10 s e lentamente inclinare il piatto. Sostituire il mezzo di placcatura. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 per 30 min prima della stimolazione.
  • Stimolare i macrofagi con 10 ng/mL di LPS in IMDM, o lasciare non stimolate, come un controllo. Incubare per 24 h, raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule (vedere i passaggi 1.16-1.17) per analisi di citochina IL-10 da ELISA. Seguire il protocollo di ELISA da kit disponibile in commercio (Tabella materiali).
    Nota: Dopo stimolazione, cellule aderenti possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR.

    • 3. impegnativo topi in Vivo con IVIg + LPS e macrofagi peritoneali di raccolta

    1. Pesare ogni mouse. Calcolare il volume di IVIg (concentrazione stock di 100 mg/mL) necessari per fornire una dose finale di 2,5 g/kg peso corporeo. Calcolare la quantità di LPS (concentrazione stock 100 μg/mL in IMDM) necessaria per fornire una dose finale di 0,2 μg/g di peso di corpo.
      Nota: ad esempio, per un mouse 20g, 500 µ l di soluzione madre di IVIg e 40 µ l di una soluzione di 100 μg/mL di LPS è richiesti.
    2. Disegnare la quantità necessaria di IVIg e LPS in una siringa sterile da 1 mL con una sterile 26 ago del manometro. Per topi di controllo che non riceverà IVIg, è possibile sostituire un volume equivalente di IVIg con PBS sterile a pH 7,4.
    3. Collottola il mouse con una mano afferrando la sua pelle sul retro del collo con il pollice e il dito indice e che tiene la coda e le zampe posteriori con le restanti dita. Inclinare il suo corpo verso il suolo.
    4. Posto l'ago a un angolo di 30-40° rispetto addome del mouse, nel quadrante inferiore destro, smussato e inserire 1,5 cm. iniettare le IVIg + LPS, o PBS + LPS, intraperitonealmente as in passaggio 2.4.
    5. Dopo 1h, raccogliere macrofagi peritoneali attenendosi alla procedura 2.5-2.10.
    6. Selezione di celle verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere 1 mL di fluido di lavaggio recuperati e utilizzare per IL-10 e IL-12 / 23p 40 analisi di ELISA secondo le istruzioni del produttore o congelare a-80 ° C per le analisi future.
      Nota: Per garantire il confronto puntuale tra i trattamenti per l'analisi di citochina fluido di lavaggio, eseguire Internetlittlereno 5ml della cavità peritoneale 4 volte per un volume finale di 15 mL. Non tutto il liquido sarà recuperato da ogni filo.
    7. Come descritto al punto 2.11, risospendere e contare i macrofagi praticabili.
      Nota: I macrofagi sarà leggermente più grandi rispetto alle altre cellule peritoneali.
    Rendimento tipico è 5x105 - 1 x 106 . macrofagi/mouse utilizzando un mouse C57BL/6 di tipo selvaggio.
    Opzionale: Se un gran numero di globuli rossi è presente nel pellet cellulare, eseguire un passaggio di lisi secondo le istruzioni del produttore per rimuoverli, come descritto al punto 2.11.
  • Come descritto al punto 2.12, risospendere le cellule in medium di placcatura.
    Nota: Potrebbe essere necessario alle cellule di piscina da più di un mouse per un esperimento. Ad esempio, se un mouse ha avuto 5 x 105 macrofagi, 500 μL di placcatura medio sarebbe necessaria.
  • Come in 2.13, incubare le cellule per 1 h a 37 ° C 5% CO2 per consentire i macrofagi diventare aderente.
  • Raccogliere e chiarire il medium condizionato, secondo passi 1.14-1.15, da tutte le cellule peritoneali.
    Nota: I campioni possono essere utilizzati immediatamente o congelati e conservati a-80 ° C per l'analisi di cytokine Elisa.
  • Eseguire il passaggio 2.11, ma Incubare le cellule per 24 h non stimolate. Raccogliere e chiarire i surnatanti delle cellule, secondo passi 1.16-1.17, per l'analisi di cytokine Elisa.
    Nota: Le cellule possono essere preparate per tecniche come il western blot o PCR, come in passaggi 1.16-1.17 e 2.14.

    • Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

    Risultati

    Macrofagi derivato del midollo osseo murino possono essere coltivati da precursori di cellule ematopoietiche nel midollo osseo aspira. Il midollo osseo aspira pool da femori e tibie di un topo C57BL/6 in genere resa 107 derivata midollare macrofagi, che li rende una fonte conveniente dei macrofagi per esperimenti. BMDMs può essere utilizzato per verificare le risposte di droga dell'anticorpo basato quando sfidato con uno stimolo infiammatorio in vitro.

    Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

    Discussione

    Gli Stati di attivazione del macrofago svolgono un ruolo importante in entrambi di omeostasi e malattia del tessuto22. Macrofagi possono avere distinti così come sovrapposizione di Stati di attivazione, a seconda delle stecche in loro microambiente3. Hanno ruoli distinti in tutte le fasi della risposta infiammatoria: difesa contro gli agenti patogeni, ferita restituzione di tessuto e di guarigione, e hanno anche uno stato di attivazione antinfiammatori distinti che è import...

    Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

    Dichiarazioni

    Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

    Ringraziamenti

    La rosa è il destinatario del premio borsa di studio laureato 4-anno fellowship (4YF) University of British Columbia. L.M.S è il destinatario di un'associazione canadese di Gastroenterologia / di Crohn e colite Canada / CIHR nuovo investigatore stipendio premio ed è uno studioso biomedica della Fondazione Michael Smith per ricerca di salute. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di progetto dal Canadian Blood Services, in collaborazione con la canadese istituti di ricerca sanitaria (concessione n # CIHR2016-LS).

    Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

    Materiali

    Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
    NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
    Iscove' s modificato Dulbecco' Tecnologievita12440053
    Siero fetale bovino (FBS)Tecnologie per la vita12483-020
    Fattore stimolante le colonie di macrofagi murini ricombinanti (MCSF)Tecnologie per le cellule staminali78059
    Penicillina-streptomicina Tecnologievita15140148
    Monotioglicerolo (MTG)Sigma88640
    1X tampone per lisi dei globuli rossieBioscience
    Tampone per dissociazione cellulareLife technologies13150016Senza enzimi, a base di Hanks, EDTA
    Lipopolisaccaride (LPS)Sigma aldrichL 4516Da E. coli 0127:B8
    IVIg (Gammunex)GrifolsRicevuto da BC Children's Hospital, Medicina trasfusionale
    IVIg (Gammagard liquido)Baxter Healthcare CorporationRicevuto da BC Children's Hospital, Medicina
    IVIg (Octagam)OctapharmaRicevuto da BC Children's Hospital, Medicina
    Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (sterile), pH 7.4Tecnologie di vita10010023
    topo IL-10 ELISABD biosciences555252
    topo IL-12/23p40 ELISABD biosciences555165
    anticorpi anti-Erk1/2Tecnologia di segnalazione cellulare9101
    anticorpo anti-pp38Tecnologia di segnalazione cellulare9211
    anticorpo anti-GAPDHFitzgerald industries10R-G109A
    ago da 26 gBD biosciences305110
    Siringa da 1 mL Siringada
    Siringa da 10 mLBD biosciences309604
    Provetta conica da 15 mLBD biosciences352096
    Provetta conica da 50 mLBD biosciences352070
    (1,7 mL)DiamedSPE155-N
    75 cm><2 Pallone trattato per coltura tissutaleBD biosciences353136
    Raschietto cellulareBD biosciences 353085
    ForceptsVWR82027-386punta fine, dissezione 
    ForbiciVWR82027-582Delicato, 4 1/2
    "Microscopio a campo chiaroMoticAE31Scala a contrasto di fase invertito
     Mettler PE 3000
    per la per la trasfusionaletrasfusionale 10 mL 309659

    Riferimenti

    1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
    2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
    3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
    4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
    5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
    6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
    7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
    8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
    9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
    10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
    11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
    12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
    13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
    14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
    15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
    16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
    17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
    18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
    19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
    20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
    21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
    22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
    23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
    24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
    25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
    26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
    27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
    28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
    29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
    30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
    31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

    Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

    Ristampe e permessi

    Tag

    Macrofagi del midollo osseoMacrofagi peritonealiImmunoglobuline endovenaProduzione di IL 10Western blottingStimolazione cellulareAnalisi delle citochineModelli murini
    Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali
    Contattaci
    Raccomanda alla biblioteca

    Privacy

    Termini di utilizzo

    Politiche

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.