Valutazione degli effetti di farmaci a base di anticorpi sul midollo osseo murino e l'attivazione dei macrofagi peritoneali

Sommario

Farmaci a base di anticorpi hanno rivoluzionato il trattamento per le malattie infiammatorie. Oltre ad avere effetti diretti su target specifici, gli anticorpi possono attivare i macrofagi per diventare anti-infiammatori. Questo protocollo descrive come antinfiammatorio del macrofago attivazione può essere valutato in vitro utilizzando macrofagi del midollo osseo del topo e in vivo, utilizzando i macrofagi peritoneali.

Abstract

I macrofagi sono fagocitiche cellule dell'immunità innata, che avviare le risposte immunitarie ai patogeni e contribuiscono alla restituzione di tessuto e di guarigione. I macrofagi sono ugualmente importanti nella disattivazione le risposte infiammatorie. Abbiamo dimostrato che i macrofagi stimolati con l'immunoglobulina endovenosa (IVIg) possono produrre le quantità elevate della citochina antinfiammatoria, interleuchina 10 (IL-10) e bassi livelli di citochine pro-infiammatorie in risposta a lipopolisaccaridi batterici ( LPS). IVIg è che un anticorpo polivalente, principalmente immunoglobulina Gs (IgG), riuniti dal plasma di donatori di sangue più di 1.000. Serve a integrare gli anticorpi nei pazienti con deficienze immunitarie o sopprimere le risposte immunitarie in pazienti con condizioni autoimmuni o infiammatorie. Infliximab, un anticorpo di terapeutico anti-tumore necrosi fattore alfa (TNFα), ha anche dimostrato di attivare i macrofagi a produrre IL-10 in risposta a stimoli infiammatori. IVIg e altri biologici basati su anticorpi possono essere testati per determinare i loro effetti sull'attivazione del macrofago. Questo articolo descrive metodi per la derivazione, la stimolazione e la valutazione del midollo osseo murino macrofagi attivati da anticorpi in vitro e macrofagi peritoneali murini attivati con anticorpi in vivo. Infine, dimostriamo l'utilizzo di western blotting per determinare il contributo di specifici percorsi di attività antinfiammatoria del macrofago di segnalazione delle cellule. Questi protocolli possono essere utilizzati con topi geneticamente modificati, per determinare l'effetto di una specifica proteina su attivazione macrofagica anti-infiammatori. Queste tecniche è utilizzabile anche per valutare se biologics specifico può agire modificando i macrofagi a uno stato di attivazione anti-infiammatori producono IL-10 che riduce le risposte infiammatorie in vivo. Questo può fornire informazioni sul ruolo dell'attivazione macrofagica nell'efficacia dei farmaci biologici durante modelli di malattia in topi e forniscono approfondimenti un potenziale nuovo meccanismo di azione nelle persone. Al contrario, questo può ammoniscono contro l'uso dei farmaci biologici basati su anticorpi specifici per il trattamento di malattie infettive, soprattutto se i macrofagi svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro l'infezione.

Introduzione

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata, che svolgono i ruoli multipli nella risposta immunitaria alle infezioni o lesioni. I macrofagi sono responsabili dell'avvio di una risposta immunitaria a danno di tessuto o di infezione, fermare la risposta infiammatoria e promuovere la guarigione di risposta¹. Esempi dei tre stati di attivazione meglio studiati macrofago sono: 1) macrofagi trattati con interferone gamma (IFNγ) e lipopolisaccaride batterico (LPS), designato M (IFNγ + LPS), che contribuiscono alla risposta infiammatoria. 2) macrofagi stimolati con l'interleuchina 4 (IL-4), M(IL-4), che sono associati con la risposta di guarigione; 3....

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of British Columbia.

1. del midollo osseo del macrofago derivazione e attivazione con anticorpi

1. Eseguire l'eutanasia usando CO₂ asfissia.
   1. Del mouse posto nella camera di induzione. Eutanasia, mouse con 5% isoflurane anestesia, per 60-90 s, fino a quando l'immobile e la respirazione è profondo e lento.
   2. Spegnere l'anestesia isoflurano e amministrare di CO₂ del 6-8 L/min fino a quando il mouse ha smesso di respirare. Lasciare mouse con CO₂ per almeno altri 5 m....

Risultati

Macrofagi derivato del midollo osseo murino possono essere coltivati da precursori di cellule ematopoietiche nel midollo osseo aspira. Il midollo osseo aspira pool da femori e tibie di un topo C57BL/6 in genere resa 10⁷ derivata midollare macrofagi, che li rende una fonte conveniente dei macrofagi per esperimenti. BMDMs può essere utilizzato per verificare le risposte di droga dell'anticorpo basato quando sfidato con uno stimolo infiammatorio in vitro.

Discussione

Gli Stati di attivazione del macrofago svolgono un ruolo importante in entrambi di omeostasi e malattia del tessuto²². Macrofagi possono avere distinti così come sovrapposizione di Stati di attivazione, a seconda delle stecche in loro microambiente³. Hanno ruoli distinti in tutte le fasi della risposta infiammatoria: difesa contro gli agenti patogeni, ferita restituzione di tessuto e di guarigione, e hanno anche uno stato di attivazione antinfiammatori distinti che è import.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Iscove' s modificato Dulbecco' Tecnologie	vita	12440053
Siero fetale bovino (FBS)	Tecnologie per la vita	12483-020
Fattore stimolante le colonie di macrofagi murini ricombinanti (MCSF)	Tecnologie per le cellule staminali	78059
Penicillina-streptomicina Tecnologie	vita	15140148
Monotioglicerolo (MTG)	Sigma	88640
1X tampone per lisi dei globuli rossi	eBioscience
Tampone per dissociazione cellulare	Life technologies	13150016	Senza enzimi, a base di Hanks, EDTA
Lipopolisaccaride (LPS)	Sigma aldrich	L 4516	Da E. coli 0127:B8
IVIg (Gammunex)	Grifols	Ricevuto da BC Children's Hospital, Medicina trasfusionale
IVIg (Gammagard liquido)	Baxter Healthcare Corporation	Ricevuto da BC Children's Hospital, Medicina
IVIg (Octagam)	Octapharma	Ricevuto da BC Children's Hospital, Medicina
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (sterile), pH 7.4	Tecnologie di vita	10010023
topo IL-10 ELISA	BD biosciences	555252
topo IL-12/23p40 ELISA	BD biosciences	555165
anticorpi anti-Erk1/2	Tecnologia di segnalazione cellulare	9101
anticorpo anti-pp38	Tecnologia di segnalazione cellulare	9211
anticorpo anti-GAPDH	Fitzgerald industries	10R-G109A
ago da 26 g	BD biosciences	305110
Siringa da 1 mL Siringa	da
Siringa da 10 mL	BD biosciences	309604
Provetta conica da 15 mL	BD biosciences	352096
Provetta conica da 50 mL	BD biosciences	352070
(1,7 mL)	Diamed	SPE155-N
75 cm><2 Pallone trattato per coltura tissutale	BD biosciences	353136
Raschietto cellulare	BD biosciences 353085
Forcepts	VWR	82027-386	punta fine, dissezione
Forbici	VWR	82027-582	Delicato, 4 1/2
"Microscopio a campo chiaro	Motic	AE31	Scala a contrasto di fase invertito
	Mettler	PE 3000

per la per la trasfusionaletrasfusionale 10 mL 309659