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Articolo metodologico

Intero Genome Sequencing di glabrata del Candida per rilevazione di marcatori di antifungini farmaco resistenza

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DOI:

10.3791/56714

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28 dicembre 2017

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1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio ha implementato il sequenziamento del genoma intero per l'analisi di mutazioni in geni che conferiscono resistenza ai farmaci antifungini in glabrata del Candida. Glabrata del c. isolati resistenti agli echinocandine, azoli e 5-flucitosina, sono stati sequenziati per illustrare la metodologia. Profili di predisposizione degli isolati correlata con la presenza o l'assenza di modelli specifici di mutazione nei geni.

Abstract

Glabrata del candida è in grado di acquisire rapidamente le mutazioni che provocano resistenza ai farmaci, soprattutto di azoli ed echinocandine. Identificazione delle mutazioni genetiche è essenziale, come rilevata resistenza in vitro può spesso essere correlata con guasto clinico. Abbiamo esaminato la fattibilità dell'utilizzo di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) per l'analisi del genoma della resistenza ai farmaci antifungini in glabrata del c. L'obiettivo era fattori abilitanti riconoscibili e barriere nell'implementazione WGS e misurarne l'efficacia. Questo documento delinea il punti di controllo chiave di controllo di qualità e componenti essenziali della metodologia WGS per indagare i marcatori genetici associati con ridotta sensibilità agli agenti antifungosi. Si stima anche l'accuratezza dell'analisi dei dati e Disabilita-intorno-periodo di prova.

Fenotipica suscettibilità di 12 clinica e un ceppo ATCC di glabrata del c. è stata determinata attraverso prova antifungosa di predisposizione. Questi tre inclusi isolano coppie, da tre pazienti, che hanno sviluppato aumento nelle concentrazioni inibitorie minime di droga. In due coppie, la seconda isolare ogni coppia ha sviluppato resistenza alla echinocandine. Il secondo isolato della terza coppia sviluppato resistenza alla 5-flucitosina. Il rimanente composto da sensibili e resistenti dell'azolo isolati. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) in geni collegati alla resistenza echinocandine, azolici e 5-flucitosina sono stati confermati in isolati resistenti attraverso WGS utilizzando il sequenziamento di nuova generazione.  Non-sinonimo SNPs nella resistenza antifungina sono stati identificati geni quali FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 e FCY2 . Nel complesso, una media del 98% del legge WGS degli isolati di glabrata del c. mappati il genoma di riferimento con una copertura di circa 75-fold profondità di lettura. I tempi e i costi erano paragonabili a Sanger sequenziamento.

In conclusione, WGS di glabrata del c. era fattibile nel rivelare le mutazioni di gene clinicamente significativi coinvolti nella resistenza alle classi di farmaci antifungini differenti senza la necessità di più reazioni di PCR/DNA sequencing. Questo rappresenta un passo positivo verso la creazione di capacità WGS nel laboratorio clinico per la rilevazione simultanea di sostituzioni che conferisce resistenza antifungina.

Introduzione

Glabrata del candida è un agente patogeno sempre più incontrato con importanza come una specie che esibisce la resistenza per l'azoli e anche più recentemente, a echinocandine1,2,3. A differenza della diploide albicans del c., il genoma aploide di glabrata del c. potrebbe consentirle di acquisire mutazioni e sviluppare resistenza multifarmaco più facilmente. Co-resistenza a entrambe le classi di droga è stato anche segnalato4. Quindi, la valutazione precoce di predisposizione antifungosa e rilevamento di farmaco-resistenza di glabrata del c. è fondamentale per la terapia corretta, mirata anche come nel contesto di stewardship antifungino per limitare i driver della resistenza agli antimicrobici1 , 5 , 6. stabilire un flusso di lavoro efficiente per rilevare rapidamente la presenza di mutazioni conferma collegate ai biomarcatori di resistenza in isolati resistenti sarà anche contribuire a migliorare la prescrizione le decisioni e gli esiti clinici.

Antifungosa di predisposizione è solitamente valutata misurando la concentrazione inibitoria minima (MIC) che è definita come la più bassa concentrazione di farmaco che si traduce in una significativa riduzione nella crescita di un microrganismo paragonato a quello di una crescita di droga-libero controllo. Il Comitato europeo sul test di suscettibilità antimicrobica (EUCAST) e Laboratory Standards Institute (CLSI) e clinici hanno standardizzato antibiogramma metodi al fine di rendere MIC determinazione più accurata e coerente7, 8. Tuttavia, l'utilità di antimicotico MIC rimane limitata soprattutto per le echinocandine, in particolare per quanto riguarda i confronti interlaboratorio dove diverse metodologie e condizioni sono usate9. C'è anche incerta correlazione dei microfoni con risposta al trattamento echinocandine e incapacità di distinguere WT (o sensibili) isolati da quelli che harboring FKS mutazioni (echinocandine-resistenti)10,11. Nonostante la disponibilità di conferma singolo gene PCRs e Sanger sequenziamento dei marcatori di resistenza antifungina, realizzazione di risultati è spesso in ritardo dovuto alla mancanza di rilevazione simultanea di più resistenza marcatori5,12. Quindi, simultanee rilevazione delle mutazioni che conferiscono resistenza in posizioni diverse nel genoma, attivata dall'analisi di sequenziamento-basata di intero genoma, offre vantaggi significativi rispetto alle attuali approcci.

Tutto il sequenziamento del genoma (WGS) è stato implementato con successo per tenere traccia di trasmissione della malattia durante le epidemie, come pure un approccio per valutazione e test in batteri e virus13di resistenza genoma rischio. Gli avanzamenti recenti nella tecnologia di sequenziamento degli acidi nucleici hanno fatto il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) degli agenti patogeni in clinicamente actionable Disabilita-intorno-tempo sia tecnicamente ed economicamente fattibile. Sequenziamento del DNA offre importanti vantaggi rispetto ad altri metodi di identificazione dell'agente patogeno e caratterizzazione impiegate in laboratori di microbiologia14,15,16. Innanzitutto, fornisce una soluzione universale con qualità, velocità e produttività elevata. L'ordinamento può essere applicata a qualsiasi dei microrganismi e permette economie di scala a laboratori locali o regionali. In secondo luogo, essa produce dati in un formato di 'futuro' suscettibile di confronto a livello nazionale e internazionale. Infine, la potenziale utilità di WGS in medicina è stata aumentata dalla rapida crescita delle basi di dati pubblici contenenti genomi di riferimento, che possono essere collegati alle basi di dati equivalenti che contengono metadati aggiuntivi clinici ed epidemiologici17 ,18.

Recenti studi hanno dimostrato l'utilità di WGS per identificazione di marcatori di resistenza antifungina da isolati clinici di Candida spp. 10 , 19 , 20. questo è principalmente dovuto alla disponibilità di alto-rendimento benchtop sequencer, bioinformatica stabilito condotte e diminuendo il costo di sequenziamento21,22. Il vantaggio di WGS fungine su Sanger sequenziamento è che WGS permette di sequenziamento dei genomi multipli su una singola esecuzione. Inoltre, WGS di genomi di Candida può identificare mutazioni novelle nel target farmacologico, traccia l'evoluzione genetica e tipi di sequenza clinicamente rilevanti20,22,23. La cosa più importante, in caso di resistenza del multidrug intrinseca, WGS può aiutare nella diagnosi precoce delle mutazioni che conferiscono resistenza prima del trattamento selezione22,24.

Qui, abbiamo esaminato la fattibilità dello screening WGS-abilitato per mutazioni associate alla resistenza ai farmaci di diverse classi di agenti antifungini. Vi presentiamo una metodologia per l'implementazione di WGS da micologia diagnostica laboratorio prospettive e degli utenti finali. Abbiamo incluso in questa analisi tre isolare coppie coltivate da tre casi clinici separati in cui in vitro resistenza alla echinocandine e 5-flucitosina sviluppato nel tempo dopo il trattamento antimicotico.

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Protocollo

Nessuna approvazione etica è stato richiesto per questo studio.

1. preparazione sottocultura e inoculo per Candida glabrata

  1. Selezionare un gruppo di C.glabrata isolati da studiare che dovrebbe anche includere almeno un glabrata del c. americano tipo cultura Collection (ATCC) con modello conosciuto di predisposizione.
  2. Sottocultura isolate toccando una singola Colonia utilizzando un'ansa di plastica monouso sterile e striature su agar di un Sabouraud destrosio (SDA) piastra da8.
  3. Incubare la piastra SDA per 24-48 h a 35 ° C per coltura pura di isolare con una buona crescita.

2. la determinazione della predisposizione antifungosa

  1. Utilizzo di un'ansa di plastica monouso sterile per prendere 4-5 colonie di circa 1 mm di diametro da un fresco subcoltivate glabrata del c. isolare il piatto SDA. Risospendere in 3 mL di acqua distillata sterile. Miscelare bene pipettando delicato per ottenere la sospensione uniforme.
  2. Regolare la densità delle cellule a 0,5 McFarland che equivale a 1 x 106 a 5 x 106 cellule/mL utilizzando un densitometro 8.
  3. Eseguire test di sensibilità facendo uso di analisi commerciale (Vedi tabella materiali e reagenti) su tutti i c. glabrata isola seguendo le istruzioni del produttore. Interpretare la suscettibilità degli isolati basato su microfoni risultante di droghe antifungose secondo le linee guida CLSI e preparare il rapporto (tabella 1)8.

3. genomic estrazione del DNA per il sequenziamento

  1. Risospendere una loopful delle colonie da una piastra SDA recente sviluppata in 300 µ l di 50 mM EDTA in una provetta da 1,5 mL.
  2. Aggiungere 40 µ l di zymolyase (10 mg/mL) per la sospensione e delicatamente dispensare 5 volte sino ad ottenere una sospensione uniforme.
  3. Incubare il campione a 37 ° C per 1-2 ore digerire la parete cellulare. Raffreddare a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Centrifugare la sospensione a 14.000 × g per 2 minuti e poi rimuovere con attenzione il sovranatante.
  5. Estrazione del DNA genomico seguendo linee guida del kit di estrazione del DNA (Vedi tabella materiali).
  6. Risospendere estratte pellet di DNA in 50 µ l di 10 mM Tris tampone (pH 7.5-8.5) anziché il buffer di eluizione fornito nel kit.
  7. Controllare la purezza del DNA tramite la misura della densità ottica (od) a 260/280 nm25.

4. genomic quantificazione del DNA

  1. Preparare un 1x buffer di Tris EDTA (TE) fornito nel kit di dosaggio basato sulle linee guida del produttore per l'analisi di fluorescenza (Vedi tabella materiali).
  2. Diluire il campione di DNA aggiungendo 2 µ l a 98 µ l di tampone di dosaggio di TE (volume finale di 100 µ l, diluizione fattore 01:50) in un piatto ben 96 monouso: 1x. Questo passaggio di diluizione può essere eseguito manualmente mediante una pipetta multicanale o da workstation di gestione automatizzata di liquidi.
  3. Preparare la gamma degli standard diluendo la lambda DNA (100 µ g/mL) forniti nel kit di analisi di fluorescenza (tabella 2) e includono per misura insieme campioni.
  4. Aggiungere 100 µ l di colorante fluorescente a 100 µ l diluito campioni di DNA e gli standard per la reazione. Incubare per 5 min a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
  5. Misurare la fluorescenza di tutti i campioni sulla base degli orientamenti del produttore.
  6. Tracciare la curva standard utilizzando le letture di fluorescenza e calcolare la concentrazione originale dei campioni del DNA.
  7. Determinare il volume di DNA e di tampone Tris 10 mM (pH 8) da aggiungere a regolare la concentrazione di DNA a 0,2 ng / µ l.
  8. Eseguire le diluizioni del DNA utilizzando Gestione workstation automatizzata di liquidi. Questo passaggio può essere ottenuto anche pipettando manuale.

5. DNA libreria preparazione

Nota: Preparazione di biblioteca e sequenziamento è stato effettuato a seguito del produttore protocolli e linee guida fornite dall'azienda (Figura 1A) (Vedi tabella materiali).

  1. Amplificazione di PCR e Tagmentation
    1. Etichettare una nuova piastra 96 pozzetti rigida di parete sottile.
    2. Aggiungere 5 µ l di input quantificati DNA a 0,2 ng / µ l (1 ng in totale) per ogni campione bene della piastra.
    3. Aggiungere 10 µ l di tampone di tagmentation e 5 µ l di tampone di amplificazione per ogni contenente DNA e pipettare delicatamente per mescolare. Sigillare la piastra con un sigillo di targhetta adesiva.
    4. Posizionare la piastra in un termociclatore ed eseguire il seguente programma PCR: 55 ° C per 5 min e permanenza a 10 ° C. Quando il campione raggiunge i 10 ° C, procedere immediatamente a neutralizzare.
    5. Aggiungere 5 µ l di tampone di neutralizzazione alla piastra per neutralizzare la reazione di amplicon e pipettare delicatamente mix. La piastra ed incubare a temperatura ambiente per 5 min.
    6. Aggiungere 15 µ l di indicizzazione PCR mastermix ai campioni.
    7. Utilizzare una scatola di tubi di primer indice disponibili per un setup di formato piastra a 96 pozzetti affinché ciascun campione ottiene una combinazione unica di indici basati sul modello di indice (tabella 3).
    8. Disporre i tubi di primer Indice Indice piastra rack (Figura 1B) utilizzando l'ordine fornito nel modello di tabella 3 e registrare la posizione degli indici sul modello.
    9. Posizionare la piastra di tagmentation con aggiunto PCR mastermix sull'indice scolapiatti con i tubi di indice in ordine.
    10. Mettere tubi di primer 1 indice nella disposizione verticale e indice primer 2 tubi in disposizione orizzontale sulla cremagliera indice. Con attenzione usando una pipetta multicanale, aggiungere 5 µ l di primer indice per ogni campione.
    11. Sostituire vecchi tappi dei tubi di indice con tappi nuovi per evitare la contaminazione incrociata tra indici.
    12. Sigillare la piastra con sigillanti piastra 96 pozzetti chiaro ed eseguire la seconda PCR come segue: 95 ° C per 30 s, 12 cicli di 95 ° C per 10 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s e 72 ° C per 5 min.
  2. Pulizia di PCR
    1. Trasferire il prodotto PCR per pulizia di PCR, dalla piastra di tagmentation in un piatto profondo-pozzo (Vedi tabella materiali).
    2. Vortex la soluzione commerciale biglie magnetiche (Vedi tabella materiali) in base alle istruzioni del produttore e aggiungere 30 µ l di perline per ogni prodotto PCR in piastre da profondo.
    3. Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1800 giri/min per 2 min e incubare a temperatura ambiente senza agitare per 5 min.
    4. Posizionare la piastra su un supporto magnetico per 2 min, fino a quando il surnatante è cancellata.
    5. Scartare il surnatante con cautela la piastra ancora sul supporto magnetico.
    6. Aggiungere 200 µ l di etanolo di 80% preparati al momento con la piastra sul supporto magnetico.
    7. Incubare la piastra sul supporto magnetico per 30 s e attentamente rimuovere e scartare il supernatante senza le perline.
    8. Ripetere la fase di lavaggio e consentire le perline per asciugare all'aria per 15 min. Remove etanolo in eccesso se presente.
    9. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 52,5 µ l di tampone di risospensione ai talloni.
    10. Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1800 giri/min per 2 min e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti senza agitazione.
    11. Posizionare la piastra sul supporto magnetico e consentire il surnatante cancellare.
    12. Usando una pipetta multicanale, attentamente trasferire 50 µ l del surnatante dalla piastra di pulitura per una nuova piastra rigida.
  3. Normalizzazione di biblioteca
    1. Scongelare i reagenti di normalizzazione biblioteca secondo le linee guida del produttore (Vedi tabella materiali).
    2. Consente di trasferire una nuova piastra profondo 20 µ l del surnatante dalla piastra di pulitura.
    3. Aggiungere 45 µ l della sospensione di biglie magnetiche e sigillare la piastra con un foglio sigillante.
    4. Agitare la piastra su un agitatore per micropiastre a 1800 rpm per 30 min. Questo tempo di incubazione è fondamentale e non deve essere superato.
    5. Collocare la piastra su un supporto magnetico per 2 min e confermare che il supernatante è cancellata (Figura 1B).
    6. Rimuovere e scartare il surnatante in un contenitore appropriato di rifiuti pericolosi con la piastra ancora sul supporto magnetico.
    7. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e lavare le perle con 45 µ l di tampone di lavaggio.
    8. Agitare la piastra con il tampone di lavaggio su un agitatore per micropiastre a 1800 rpm per 5 min.
    9. Collocare la piastra su supporto magnetico per 2 min e scartare supernatante quando diventa chiaro.
    10. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e ripetere il lavaggio con tampone di lavaggio.
    11. Rimuovere la piastra dal supporto magnetico e aggiungere 30 µ l di 0,1 N NaOH.
    12. Agitare la piastra con 0,1 N NaOH su un agitatore per micropiastre a 1800 rpm per 5 min e posizionare la piastra sul supporto magnetico per 2 min o fino a quando il liquido è chiaro.
    13. Aggiungere 30 µ l di tampone di eluizione in ciascun pozzetto di una nuova piastra finale libreria normalizzata rigida trasparente 96 pozzetti a parete sottile.
    14. Trasferire 30 µ l di supernatante dalla piastra di normalizzazione alla piastra finale libreria normalizzata per rendere il volume finale 60 µ l. Le librerie sono ora pronte per essere ordinati in sequenza.
  4. Determinazione della concentrazione di DNA biblioteca di qPCR
    1. Scongelare i mastermix, primer e standard forniti nel kit qPCR secondo le linee guida del produttore (Vedi tabella materiali).
    2. Combinare la PCR reagente mastermix e primer forniti nel kit qPCR seguendo le istruzioni del produttore e aliquote possono essere conservate a-20 ° C.
    3. Per determinare la concentrazione di libreria di DNA, preparare una diluizione di 1/8000 delle librerie del DNA tramite tampone Tris 10 mM (pH 8) eseguendo una diluizione di 1: 100 (libreria di DNA 1,5 µ l a 148,5 µ l di tampone Tris) seguita da una diluizione di 1: 80 (2 µ l da 1: 100 a 158 µ l di tampone Tris).
    4. Agitare la piastra diluizione a 700 giri/min per almeno 1 min e poi Centrifugare a 14000 × g per 1 min.
    5. Preparare 20 µ l di reazione di PCR finale con 4 µ l di DNA standard o diluito libreria del DNA e 16 µ l di mastermix.
    6. Eseguire le seguenti impostazioni del produttore nel termociclatore PCR: 95 ° C per 5 min, 35 cicli di 95 ° C per 30 s e 60 ° C per 45 s e finale 65 ° C a 95 ° C per l'analisi della curva di fusione.
    7. Ottenere i valori di Ct delle norme e librerie di campioni del DNA dal termociclatore qPCR.
    8. Generare una curva standard dal valore di Ct degli standard (Figura 2). Definire l'intervallo QC superiore e inferiore di ± 3 cicli dalla media. Ad esempio, se il Ct valore medio è di 13 cicli della gamma QC è tra i 16 e 10 cicli.
    9. Determinare le concentrazioni di individuale e media library (ALC) dalla curva standard e i valori di Ct.
    10. Determinare il volume di librerie pool totale (PAL) per essere utilizzato sulla base di calcolo indicato di seguito per la sequenza finale, considerando che la concentrazione di libreria target è tra 1.4-13:08.
      Nota: Biblioteca di concentrazione ottenuto da qPCR media = ALC; Totale biblioteche pool (PAL) = ALC / 2; Denaturato PAL (DAL) = PAL * 0.666
      A seconda del volume di DAL che si mescola con il tampone, è la concentrazione della libreria da aggiungere alla cella di flusso. Ad esempio, se 65 µ l di libreria viene aggiunto a 835 µ l di tampone, quindi da questa diluizione (Dil 1) 195 viene aggiunto ad un volume totale di 1300 µ l: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = concentrazione finale (dovrebbe essere tra 1.4-13:08)

6. Biblioteca pooling e sequenziamento Initiating nel Sequencer di Benchtop

  1. Cartuccia di reagente di disgelo secondo le linee guida del produttore. Estrarre una nuova cella di flusso dalla sua confezione da deposito di 4 ° C e portare a temperatura ambiente almeno 30 min prima del sequenziamento. Estrarre la cartuccia di buffer e sequenziamento prechill buffer prima dell'uso (Vedi tabella materiali).
  2. Preparare una libreria di controlli mescolando 5 µ l di libreria (1 nM) e 5 µ l di 0,2 N NaOH. Vortex brevemente e incubare per 5 min a temperatura ambiente per denaturare la libreria di controlli nei singoli fili.
  3. Aggiungere 5 µ l di 200 mM Tris-HCl, pH 7 e vortice. Aggiungere 235 µ l di tampone di sequenziamento prechilled e mescolare delicatamente. Il volume totale è di 250 µ l con concentrazione finale di libreria di controllo alle 20 pM.
  4. Librerie di DNA piscina trasferendo 5 µ l di ciascuna libreria di campioni da sequenziare dalla piastra finale biblioteca normalizzato in una provetta singola bassa-bind 1,5 mL.
  5. Aggiungere 30 µ l di biblioteca in pool e 30 µ l di 0,2 N NaOH denaturare librerie in un altro tubo di basso bind.
  6. Vortice il basso-bind tube e incubare per 5 min a temperatura ambiente per denaturare le librerie nei singoli fili.
  7. Aggiungere 30 µ l di 200 mM Tris-HCl, pH 7 a tubo con librerie denaturate per neutralizzare la reazione.
  8. Aggiungere 65 µ l di sospensione neutralizzati librerie denaturato e 835 µ l di tampone di sequenziamento pre-refrigerati e vortice per mescolare bene.
  9. In un tubo finale basso bind combinare i seguenti: 195 µ l da biblioteche denaturati neutralizzati, 1.30 µ l di libreria di controlli e 1103.70 µ l di tampone di sequenziamento. Mescolare bene.
  10. Caricare il mix finale biblioteca (1300 µ l) nel posto designato sulla cartuccia di reagente.
  11. Set-up il sequenziamento eseguito inserendo i dettagli di progetto e campione nel Sequencer designato sito Web seguendo le linee guida.
  12. Avviare sequenziazione seguendo le linee guida. Caricare la cella di flusso, cartuccia di reagente con librerie e buffer nel sequencer di benchtop.
  13. Registrare i numeri di lotto di tutti i kit di reagenti e cartucce usate nel sequenziamento.

7. dati scaricare dal sito Web di sequenziamento

  1. Scarica file FASTQ seguendo le istruzioni del produttore fornite sul sito Web.
  2. Per una buona qualità eseguita verifica che la percentuale Q30 è ≥ 75% e cluster densità è tra 170-280 K/mm2 con ottimale a 200-210 K/mm2 (tabella 4).

8. analisi dei dati di sequenziamento

  1. Importare file FASTQ di campioni sequenziati in pacchetto software integrato di analisi dei dati (Vedi tabella materiali).
  2. Creare un flusso di lavoro di sequenziamento nel software aggiungendo funzionalità dall'elenco cioè rifilatura, il mapping a riferimento (riferimento selezionare genoma), riallineamento locale e analisi di variante (Figura 3A) utilizzando le impostazioni elencate nella tabella 5.
  3. Eseguire il flusso di lavoro selezionando un singolo campione o un batch di file di esempio FASTQ e salvare il file di output in cartelle campione designato.
  4. Generare report per profondità di copertura di sequenza, regioni mappate ed elenco delle varianti strutturali nel genoma (Figura 3B).
  5. Elenco delle varianti strutturali consente di cercare non sinonimo singoli polimorfismi del nucleotide (SNPs) in geni che conferiscono resistenza e virulenza.
  6. Preparare report elencando SNP posizione, gene e numero di isolati resistenti o sensibili (tabella 6).

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Risultati

Tredici glabrata del c. che comprende gli isolati di glabrata del c. ATCC 90030 e 12 dal laboratorio di riferimento clinico di micologia (isolati CMRL1 a CMRL12), Westmead Hospital, Sydney sono stati studiati (tabella 1). Questi hanno incluso tre paia di isolati CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 e CMRL-5/CMRL-6 ottenuti prima e dopo la terapia antifungosa con nessun correlazioni epidemiologiche tra loro 24 (tabella 1).

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Discussione

Questo studio ha determinato la fattibilità, sequenze temporali approssimativo e precisione di rilevazione WGS-Guida di farmaco-resistenza di glabrata del c. Il tempo di consegna (TAT) per la preparazione di biblioteca e il sequenziamento è stato quattro giorni e la segnalazione di uno-due giorni risultati analizzati. Ciò confronta con almeno una quantità simile TAT per i test di suscettibilità da piastre di coltura e Sanger sequenziamento con significativamente più alto numero di campioni. Circa 30-90 c. gl...

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Dichiarazioni

Gli autori hanno nessun concorrenti interessi finanziari e nessun conflitto di interessi di divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal centro per le malattie infettive e microbiologia, salute pubblica. Gli autori non hanno ricevuto altri finanziamenti per questo studio. Gli autori ringraziano Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann e Ranjeeta Menon per la loro consulenza e assistenza con l'esperimento di sequenziamento del genoma intero.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DensiCHECK PlusBioMé rieux IncK083536 Densitometro utilizzato per le letture McFarland
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Piastra per il test di suscettibilità commerciale con farmaci antifungini standard.
Fisherbrand Anelli e aghi per inoculazione monousoFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Gli anelli in plastica monouso possono essere utilizzati direttamente dalla confezione. Non è richiesta alcuna fiammatura.
Provette per microcentrifuga Eppendorf Safe-LockSigma Aldrich, MerckT2795     Volume 2,0 mL, naturale
 
ZYMOLYASE 20T di Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Utilizzato per la lisi della parete cellulare dell'isolato fungino prima dell'estrazione del
Kit
purificazione del DNA genomico guidato Wizard Promega A1120Fa 100 estrazioni di DNA
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589  Reagente Picogreen indicato come colorante fluorescente nel protocollo.
Include lo standard Lambda DNA e il reagente picogreen per il saggio.
Kit di preparazione del campione di DNA Nextera XTIlluminaFC-131-1096Include reagenti Scatola 1 e Scatola 2 per 96 campioni
Kit indice Nextera XT v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Set di indici A
Set di indici B
Set di indici C
Set di indici D
NextSeq 500/550 Kit ad alto rendimento v2 IlluminaFC-404-2004300 cicli, più di 250 campioni per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cicli, più di 130 campioni per kit
Kit di controllo PhiXIlluminaFC-110-3001Per organizzare gli indici dal kit indice in ordine
Kit di fissaggioFC-130-1005  Kit
di quantificazione della libreria KAPA a 2 dispositivi
per il sequenziamento di nuova generazione		KAPA BiosystemsKK4824Include standard predefiniti, primer e
sistema di gestione dei liquidi MasterMix Janus NGS Express PerkinElmerYJS4NGSutilizzato per le diluizioni del DNA durante il sequenziamento
  Piastra di conservazione da 0,8 mLThermo ScientificAB0765B Piastra MIDI per la pulizia della libreria di DNA e
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881  Sfere magnetiche in soluzione per la purificazione della libreria
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Utilizzato per la purificazione del DNA basata su biglie magnetiche
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT1502Agitatore per piastre a 96 pozzetti con 4 piattaforme
Piastra PCR a guscio rigidoBioRadHSP9601parete sottile, 96 pozzetti
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Ospita una piastra a 96 pozzetti
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adesivo, ottico BioRad  MSB1001Sigillanti per piastre trasparenti a 96 pozzetti
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware per l'analisi dei dati, versione 8
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Riferimenti

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