Summary
Vi beskriver en metode til at syntetisere biokompatible 10-nm guld nanopartikler, functionalized af belægning poly-ethylen glycol på overfladen. Disse partikler kan være brugt i in vitro og i vivo til at levere therapeutics til nanoskala cellulære og ekstracellulære rum der er vanskelige at adgang med konventionelle nanopartikel størrelser.
Abstract
Guld nanopartikler (AuNPs) har været brugt i udstrakt grad i medicinske forskning på grund af deres størrelse, biokompatibilitet og modificerbare overflade. Specifikke målretning og drug delivery er nogle af anvendelserne af disse AuNPs, men endotel ekstracellulære matricer defensive egenskaber hæmmer partikel optagelse. For at løse dette problem, beskriver vi enmetode syntesen for ultrasmå guld nanopartikler til at forbedre vaskulær levering, med tilpasselig funktionelle grupper og polymer længder for yderligere justeringer. Protokollen udbytter 2,5 nm AuNPs, der er et loft med tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chlorid (THPC). Udskiftning af THPC med hetero-funktionelle polyethylenglycol (PEG) på overfladen af AuNP øger den hydrodynamiske radius til 10.5 nm samtidig forskellige funktionelle grupper på overfladen. Den sidste del af protokollen omfatter en valgfri tilføjelse af en fluorophore at give AuNPs til visualiseres under fluorescens at spore nanopartikel optagelse. Dialyse og ingot blev brugt til at rense og isolere AuNPs. Disse fluorescerende nanopartikler kan visualiseres i både in vitro og i vivo forsøg på grund af den biokompatible PIND belægning og fluorescerende sonder. Derudover størrelsesområde af disse nanopartikler gengive dem en ideel kandidat til sondering af glycocalyx uden at forstyrre normale Vaskulaturen funktion, hvilket kan føre til forbedret levering og therapeutics.
Introduction
Nanopartikler har været anvendt til medicinafgivelse og billedbehandling for sin evne til at navigere gennem kroppen til at nå målet områder af interesse1,2. Partiklerne kan ophobes i tumorer via utætte Vaskulaturen eller lokalisere hvor en target ligand er overexpressed og udsat. Guld, specielt, er blevet et almindeligt anvendte nanopartikel materiale på grund af sin unikke kemiske og fysiske egenskaber, der påvirker transport og frigivelse af therapeutics3. Guld er en effektiv nanopartikel materiale, fordi dens overflade kan ændres til at binde til dithioler og har høj biokompatibilitet på grund af sin lav toksicitet4. AuNPs kan være bærere af store Biomolekylær narkotika og har haft succes i at levere peptider, nukleinsyrer og proteiner, så AuNPs at være gunstig for målretning2,4.
Desværre er nanopartikel drug delivery effektivitet blevet hæmmet af de negativt ladede glycocalyx, som er den ekstracellulære frakke på membranen af mest pattedyrceller og pore størrelser på op til 7 nm5,6. Denne porestørrelse er mindre end de fleste nanopartikel drug luftfartsselskaber, som har typiske diametre spænder fra 50-200 nm. Under sygdomstilstande blive disse glycocalyx porer større på grund af nedbrydning, øget permeabilitet gennem i endothelial celler. De fleste nanopartikler er dog stadig for store til at drage fordel af denne strukturelle ændring i glycocalyx. En konsekvens af denne uoverensstemmelse i størrelse er, at konventionelt mellemstore partikler ikke interagerer positivt med endothelceller denne linje blodkar. Dette påvirker levering af intravenøst administreret partikler i endotelet, og kan også siges om partikel transport gennem den blod hjerne barrieren7,8,9,10.
En metode til at bekæmpe dette problem er at udnytte mindre partikler til at passere gennem de små porer i glycocalyx. Her, syntetisere vi en 10,5 nm ultrasmå guld nanopartikel, som normalt bør være afskrækket af intakt, sunde glycocalyx. Når glycocalyx begynder at blive forringet, nanopartikel bør let trænge ind celler gennem stigende porestørrelse. Protokollen i dette papir beskriver en syntese af ultrasmå guld kerne beklædt med PIND, som øger biokompatibilitet og reducerer systemiske clearance4. STANGEN kan også indeholde flere typer af funktionelle grupper, åbner muligheder for konjugation af målretning ligander, fluorophores og therapeutics. Tidligere viser offentliggjorte resultater, at disse ultrasmå nanopartikler tendens til at blive taget mere positivt i regioner af forstyrret endotel glycocalyx funktion selv uden nogen aktiv målretning4,11. Dette angiver muligheden og vigtigheden af at udnytte partikler af korrekt størrelse for levering programmer. Følgende protokol præsenterer syntesen, oprensning og karakterisering af den PIND-coated AuNPs (PEG-AuNP), med diskussionen af skræddersy funktionelle grupper og bøjninger for andre programmer.
Protocol
1. forberedelse eller indkøb af stamopløsninger (skal opbevares ved stuetemperatur eller frosne indtil brug)
- Forberede en 1 M natriumhydroxid (NaOH) stamopløsning af opløse 400 mg NaOH i 10 mL ultrarent vand ved stuetemperatur, og blande materialerne godt.
Bemærk: Ultrarent vand er defineret som vand uden urenheder såsom partikler, bakterier, nukleaser, ioner eller spor af organics. En luftrensning system anvendes til at opnå den ultrarent vand, resulterer i dens resistivitet af op til 18.2 mΩ·cm, der angiver en lav anioniske forurening. Brugen af kommercielt tilgængelige flaske ultrarent vand kan ikke anbefales. Fremover, vil denne ultrarent vand henvist til som vand, medmindre andet er angivet. - Forberede en 6M NaOH stamopløsning ved at opløse 2,4 g NaOH i 10 mL vand, og gemme løsningen ved stuetemperatur.
- Forberede en 250 mM stamopløsning af chloroauric syre (HAuCl4) ved at opløse 1 g tørrede HAuCl4 i 10,16 mL vand. Fortyndes 1 mL 250 mm HAuCl4 med 9 mL vand til arbejde koncentration af 25 mM HAuCl4. Gemme HAuCl4 løsning ved stuetemperatur.
- Forberede en 0,1 M karbonat buffer til pH 8,8, ved at opløse 84 mg natriumhydrogencarbonat i 10 mL vand og justere til pH 8,8 ved at tilføje 6 M NaOH fra trin 1.2. Gemme karbonat buffer ved stuetemperatur.
- Bland 20 mL af tetrazolium sammensatte, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt (MTS), med en stabilisator, phenazine ethosulfate (PES) (Se Tabel af materialer). Opbevar MTS/PES blandingen i delprøver (i en periode på højst 10 fryse-tø cykler) ved-20 ° C i mørke.
2. Sammenfatning af guld nanopartikel kerner
- Fremstilles en fortyndet opløsning af THPC ved at tilføje 12 µL 80% THPC i vand til 1 mL vand i et microcentrifuge rør ved stuetemperatur.
- Sikre en 100-mL rund bund kolbe over midten af et magnetisk røre pladen. Hældes 45 mL af vandet i kolben og røre vandet på 300 rpm ved hjælp af en lille ægformet magnetiske rør bar. Der tilsættes 0,5 mL 1 M NaOH og 1 mL fortyndet THPC løsning. Fortsætte med at røre reaktionsblandingen kraftigt i 5 min.
- Fortsæt omrøring blandingen, og der tilsættes 2 mL 25 mM HAuCl4 løsning. Farven af blandingen skifter fra gul til mørk brun inden for sekunder, med angivelse af dannelsen af THPC udjævnede AuNPs med en negativ ladning. Rør blandingen i en yderligere 15 min at give mulighed for komplet dannelsen af guld-kerner.
3. tilsætning af Polymer Corona omkring den guld nanopartikler
- I perioden 15 min i skridt 2.3 beskrevne forberede PIND løsninger ved at opløse hver af følgende i 1 mL vand i 4 mL hætteglas: 30 mg NH2-PLØK-SH; 7,5 mg m-PIND-SH; 7,5 mg COOH-PIND-SH.
Bemærk: Den resulterende koncentration skal være 8.8 M NH2-PLØK-SH, 3,75 M m-PIND-SH og 3.75 M COOH-PIND-SH. - Efter at reducere omrøring hastigheden af løsningen i rund bund kolben til 100 rpm, føje at PLØK udjævnede løsninger til løsningen af THPC AuNPs dråbevis. Fortsæt til blandingen omrøres forsigtigt natten ved stuetemperatur, til at sikre effektiv fjernelse af THPC og udskiftning af PIND.
- For de næste 72 timer, skal du bruge en 12-14 kDa molekylvægt cutoff cellulose membran til dialyze stirred blandingen mod en 4 L spand vand rørte ved 60 rpm. Binde enderne af membraner af dialyse clips og opløsningen overføres via pipette.
Bemærk: Denne dialyse proces med 12-14 kDa cutoff membranen kun fjerner ureageret PIND, THPC og andre kemiske reaktanter, ved diffusion langs en koncentration gradient. - For at opretholde høj koncentration forløb og fremme kontinuerlig diffusion, Skift vand hver 2 h for de første 6 h og hver 6-12 h det resterende 66 h.
Bemærk: Formålet med dette vand Skift tidsplan er til at rumme den hurtige diffusion, der opstår tidligt på grund af den i første omgang høj koncentration inden for prøven. Dialyse processen beskrevet ovenfor blade nanopartikel løsning semi-renset, fordi nanopartikler, bundfald, aggregater og andre store størrelse urenheder ikke kan passere gennem porerne i 12-14 kDa cutoff membran. - Semi-renset nanopartikel Opløsningen filtreres i et 50mL konisk rør ved hjælp af en 0,2 µm sprøjte filter til at fjerne de resterende bundfald, aggregater og andre store størrelse urenheder.
- Placer den koniske rør i et-80 ° C fryser og lad den rensede PEGylated AuNP (PEG-AuNP) løsning til at fryse for omkring 5 h.
- Bruge en fastfrysning tørretumbler til lyophilize den renset PIND-AuNP.
- Opbevares tørt, renset PIND-AuNP ved 4 ° C indtil brug.
4. de tråddannende Fluorophores ved hjælp af N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester på NH2 grupper på PIND-AuNP
- Sikre en kolbe på 50 mL rund bund over midten af et magnetisk røre pladen. Fyld kolben med 18 mL vand og rør til vand ved 100 omdrejninger i minuttet ved hjælp af et æg-formet magnetiske rør bar.
- Veje 2 mg af den frysetørrede PIND-AuNP i en 4 mL konisk slange, ved hjælp af en høj præcision benchtop skala. Bruge en anti-statisk pistol til at fjerne statisk opladning og klamrer sig af PEG-AuNP pulver til tube overflade. Tilsættes 2 mL vand til røret. Hæld 2 mL PIND-AuNP løsning i rund bund kolben til yderligere rekonstitution i alt 20 ml vand. Fortsæt til blandingen omrøres ved 100 omdrejninger i minuttet ved hjælp af et æg-formet magnetiske rør bar.
- Der tilsættes 1 mL af 0,1 M, pH 8,8 carbonat buffer til 20 mL af rekonstitueret AuNP indeholdt i rund bund kolben. Fortsæt omrøring.
- Tilsæt 5 µL af 10 mg/mL fluorescerende NHS ester i dimethylsulfoxid.
Bemærk: Alle fluorescerende farvestof kan bruges i denne proces. Rør den fluorescerende PIND natten over. Holde det ved stuetemperatur og dækket i folie. - For de næste 72 h, fjerne overskydende fluorophores ved hjælp af protokollen beskrevet taktfast 3.3. Kort, dialyze stirred blandingen ved hjælp af en 4 L spand vand og en 12-14 kDa molekylvægt cutoff cellulose membran. Skift vandet hver 2 for de første 6 h og hver 6-12 timer for de resterende 66 h.
- Få 1 mL af den renset fluorescerende PIND-AuNP løsning, der skal anvendes til karakterisering beskrevet nedenfor i afsnit 5. Fryse og lyophilize den resterende løsning for at opnå fluorescerende nanopartikler i pulverform til opbevaring ved 4 ° C, som beskrevet i trin 3,5-3,7.
- Brug en 0,2 µm sprøjte filter til at sterilisere og fjerne enhver potentiel bundfald engang rekonstitueres til celle kultur applikationer.
5. karakterisering af fluorescerende pegyleret guld nanopartikler
- Ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi (TEM) til at visualisere guld nanopartikel kernen og kvantificere størrelserne
- Drop 10 µL af den rensede fluorescerende PIND-AuNP løsning på en carbon coated maskegitteret TEM.
- Efter 5 min, skal du bruge et stykke filtrerpapir til omhyggeligt vægen væk overskydende væske fra kanten af gitteret TEM indtil en film, der indeholder fluorescerende PIND-AuNPs er efterladt.
- Se de fluorescerende PIND-AuNPs på 80 kV og ved en forstørrelse på 50.000-150, 000. Tage digitale billeder.
Bemærk: Kun den guld kerne vil være synlig, fordi PIND ikke er elektron tæt på TEM. - Ved hjælp af en måling software, indstille måleskalaen i korrelation til skalalinjen. Beregner diameteren af ca 20 guld kerner, og derefter bestemme den gennemsnitlige guld kerne diameter.
Bemærk: TEM imaging systemet automatisk anbringer en skalalinjen på de digitale billeder.
- Måling af hydrodynamiske nanopartikel størrelse ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS)
- Overføre 1 mg af frysetørret THPC-belagte AuNPs ind i et microcentrifuge rør ved hjælp af fremgangsmåden i trin 4.2. Overføre 1 mg af frysetørrede PIND-AuNP i en separat tube. Der tilsættes 1 mL af vandet til hvert rør og hver AuNP opløsning overføres til en 1 mL klar plast.
- Placer en kuvette i en DLS instrument og måle sfæriske hydrodynamiske diameter ved hjælp af partikel analyzer software, der er indbygget i DLS system.
- Afbilde de målte hydrodynamiske diameter ved hjælp af et histogram format.
Bemærk: Histogrammet vil gruppere nanopartikler af størrelse. Den største gruppe af nanopartikler vil afklare den diameter, der bedst beskriver størrelsen af AuNPs syntetiseret i denne protokol.
- Fluorometriske fluorescens bekræftelse
Bemærk: Samme prøve- og kuvette fra trin 5.2 kan bruges til at måle fluorescerende signal.- Fjerne kuvette fra DLS og indsætte i en spectrofluorometer. Sæt excitation bølgelængde 633 nm og Læs den udsendte fluorescens signaler langs en bølgelængdeområdet af 650-800 nm.
- Bekræfte, at peak er ca 665 nm, som korrelerer til emission højdepunkt for NHS.
Bemærk: Justere excitations- og bølgelængder ifølge fluorophore bruges i processen.
- MTS assay11 for at vurdere biokompatibilitet
- I en 96-godt klare bund sterile vævskultur behandlet plade, afpipetteres 100 µL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM, suppleret med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin/streptomycin) og 3.2 x 103 celler i hver brønd.
Bemærk: I denne undersøgelse, rotter fedt pad endotelceller er brugt. Ialt 21 brønde anvendes til at give mulighed for 3 flergangsbestemmelser for hver af de 7 forskellige nanopartikel koncentrationen (Se trin 5.4.3 for bestemte koncentrationer af interesse). - Tillad celler til at vokse til confluency i fugtighed og 5% CO2 kontrolleret væksthuse ved 37 ° C11.
- Forbered enkelte microcentrifuge rør, hver indeholder 300 µL af DMEM med nanopartikler i forskellige koncentrationer. Denne undersøgelse kræver 7 forskellige rør af DMEM med følgende PIND-AuNP koncentrationer: 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL og 1.000 µg/mL.
- Opsug DMEM fra røret. Fylde brøndene i tre eksemplarer med 100 µL af DMEM medier indeholdende 0, 10, 50, 100, 250, 500 eller 1000 µg/mL af AuNP.
- Tillad celler og nanopartikler til co Inkuber i et forud fastsat tidsrum, her for 16 h.
- Nær slutningen af inkubationstiden, tø MTS/PES blandingen fra trin 1,5.
- Efter inkubationen Opsug DMEM og den suspenderede, løst vedlagte nanopartikler fra brøndene. Tilsæt 100 µL af friske DMEM sammen med 20 µL af MTS/PES løsning til at opnå 1:5 MTS/PES DMEM forhold efter producentens protokol. Inkuber celler med MTS/PES ved 37 ° C i 2 timer.
Bemærk: Denne 2 h inkubation tid bestemmes af den metaboliske aktivitet i endothelial celler og kan forøges til op til 4 h til andre celletyper. Inden for perioden 2 h metaboliseres MTS i endothelial celler i farvede formazankoncentrationen, der blander sig med DMEM. Biokompatibilitet af PEG-AuNP og sandsynligheden for cellernes levedygtighed vil blive demonstreret med flere farvede formazankoncentrationen. Toksicitet af PEG-AuNP og risikoen for, at cellerne dør bliver vist med mindre intens farve. - Udføre kolorimetriske analyse af hver brønd ved at læse absorbans ved 492 nm med en kompatibel pladelæseren.
- For hver nanopartikel koncentrationen, beregnes den gennemsnitlige absorbans fra tredobbelt absorbans værdier. Opdele den gennemsnitlige absorbans ved den værdi fra gennemsnit absorbans i wells indeholdende 0 µg/mL nanopartikler.
Bemærk: Disse brønde, der indeholder ingen AuNPs tjene som kontrolelementer til beregning af procentdelen cellernes levedygtighed som svar på nanopartikel behandling administreres i andre brønde.
- I en 96-godt klare bund sterile vævskultur behandlet plade, afpipetteres 100 µL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM, suppleret med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin/streptomycin) og 3.2 x 103 celler i hver brønd.
- Fluorescens konfokalmikroskopi vurdering af nanopartikel optagelse i vedhængende endotelceller med intakt eller dysfunktionelle glycocalyx11
- Frø 1,0 x 104 celler/cm2 rotte fedt pad endotelceller på sterile 12 mm glas coverslips og foder celler med DMEM suppleret med 10% føtal bovin serum og 1% penicillin/streptomycin. Tillad celler til at vokse til fuld confluency i fugtighed og CO2 kontrolleret væksthuse ved 37 ° C, for ca. 3 dage.
- Tilføje behandlinger for at ændre glycocalyx, hvis det er relevant. For eksempel, nedbryder 2 h behandling af kulturperler endotelceller med 2,5 x 10-6 IU heparinase III enzym glycocalyx af specielt holde sin heparan sulfat komponent.
Bemærk: Sund glycocalyx kan modelleres af voksende i endothelial celler som beskrevet i trin 5.5.1 uden tilsætning af nedbrydning enzymer. - Med i endothelial glycocalyx overladt intakt eller afsmeltet dysfunktionel, inkuberes i endothelial celler med fluorescerende AuNPs på 550 µg/mL for 16 h eller andre ønskede tid.
- Forsigtigt vaske cellerne med 2 mL af 37 ° C 1% bovint serumalbumin i fosfatbufferet saltopløsning (PBS, som indeholder 100 mg/L calcium og 100 mg/L magnesium). Dykke celler i 2 mL 2% PARAFORMALDEHYD og 0,1% glutaraldehyd i PBS, og tillader cellerne til at lave i 30 min. ved stuetemperatur.
- Fjerne aldehyd fastsættelse løsning og vaske cellerne med stuetemperatur PBS for tre 5-min cyklusser.
- Inden primære antistof anvendelse, Udsæt endotelceller til 2% ged serum i PBS i 30 min. ved stuetemperatur til at blokere ikke-specifik binding sites. Celler skal være fuldt dækket af den blokerende løsning.
- Inkuber endotelceller natten med 1% anti-heparan-sulfat primære antistof i 2% ged serum i PBS i 4 ° C til at mærke heparan sulfat komponent af glycocalyx. Sikre, at de faste celler er fuldt i kontakt med antistof løsning.
- Den næste dag, udviske antistof med stuetemperatur PBS for tre 10 min cyklusser.
- Inkuber i endothelial celler med 1:1,000 fortynding af den passende fluorescerende sekundær antistof i 30 min. ved stuetemperatur i mørke eller dækket med aluminiumsfolie.
- Vaske ud den sekundær antistof med stuetemperatur PBS for tre 10 min cyklusser.
- Montere coverslip på objektglas ved hjælp af et anti-fade montering medium indeholdende 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochlorid (DAPI) for kerner farvning. Forsegle kanterne af coverslip ved hjælp af neglelak.
- Billede fluorescerende immunostained endothelial celler prøver med Konfokal mikroskopi, ved hjælp af blå, grøn og langt rød kanaler til at visualisere kerner, heparan sulfat glycocalyx og nanopartikler, henholdsvis.
Representative Results
Den syntetiserede AuNPs, belagt med THPC eller PIND (figur 1A og figur 1B, henholdsvis), er afbildet med TEM og partiklerne størrelser er målt ved hjælp af TEM og DLS for at sikre ordentlig nanopartikel størrelse distribution. Figur 2 viser TEM billedet af en THPC-AuNP prøve på 80 kV og 150.000 x forstørrelse. Diameteren af THPC-AuNP partikler spænder fra 2-3 nm, baseret på linjen kalibrering i TEM billeder. Denne THPC-AuNP størrelse er også tydeligt i DLS størrelse måling histogram vist i figur 2, i hvilket THPC belagt AuNP er vist at have et højdepunkt på 2,5 nm. PEGylation er ikke synlig under TEM som polymerer ikke er elektron tæt. TEM billeddannelse af PEG-AuNP prøver blot bekræfter tilstedeværelsen af enkelte spredte partikler, som er forventet, fordi PIND polymer corona omkring nanopartikler støtte i forebyggelse af sammenlægning. Disse PEG-AuNP prøver, DLS størrelse måling histogrammet viser et skift i toppen, til ca 10.5 nm på DLS. Vedhæftede filer af yderligere ligander eller narkotika på funktionelle grupper vil påvirke størrelsen af nanopartikel, og bør tages i betragtning, når du måler diameter.
Fluorophore tilsætning (figur 1 c) bekræftes ved hjælp af en fluorometer til at måle fluorescens signal fra et udsnit af nanopartikler, som vist i figur 3. Når ophidset med en bølgelængde på 633 nm, emission er målt til at have en maksimal mellem 660 og 672 nm, som matcher producentens produktinformation for maksimal emission på 665 nm. Fastgørelse af andre fluorescerende sonder bør kontrolleres på en lignende måde at sikre fluorescerende svar.
Biokompatibilitet af partikler og relateret celle levedygtighed er vurderet bruger MTS analysen til at kontrollere relative celle metabolisme af MTS efter 16 h inkubation med forskellige koncentrationer af nanopartikler. Fluorophore konjugeret PEGylated AuNPs viser ingen betydelig toksicitet, som angivet af de tilsvarende niveauer af cellernes levedygtighed ved alle koncentrationer op til 1 mg/mL (figur 4A). Denne biokompatibilitet kan ændres afhængigt af den terapeutiske eller ligand knyttet til de resterende funktionelle grupper til yderligere tilpasning af partikler. Drug vedhæftede filer tendens til at øge toksicitet, men afhængigt af de arbejdende koncentrationer, kan det ikke påvirke levedygtigheden i betydeligt omfang.
Optagelse af fluorescerende, PEGylated AuNPs (figur 1 c) af vedhængende celler vurderes ved hjælp af kulturperler rotte fedt pad endothelial celler med intakte eller dysfunktionelle glycocalyx (figur 4B). Dysfunktionelle glycocalyx betingelser er opnået ved at tilføje heparinase III enzym til kultur, hvilket resulterer i en forringelse af heparan sulfat glycocalyx komponent og at kompromittere matrix12. Figur 4B viser de forskellige niveauer af optagelse af PEG-AuNPs, som røde prikker på tværsnits opfattelse af de repræsentative endotelceller. En sund glycocalyx afskrækker optagelsen af disse guld nanopartikler, men en væsentlig stigning er observeret, når enzymet er ansat11. Dette resultat fremhæver disse ultrasmå nanopartikler potentiale til at levere therapeutics i endothelial celler i en måde kontrolleret af forskellige interaktioner, der er baseret på glycocalyx sundhed.
Figur 1: guld nanopartikel skemaer. (A) THPC belagt AuNP nanosphere før PIND udskiftning. (B) PEGylated AuNP med 3 typer af PIND afslutninger, herunder COOH, NH2og CH3. Blå bølger repræsenterer polymeren. (C) konjugeret nanopartikler til fluorescens billeddannelse. Røde stjerner Vis fluorophores konjugeret til NH2 funktionelle grupper. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: størrelse målinger af guld nanopartikler. Venstre: TEM af guld nanopartikler før tilsætning af PIND på 80 kV og 150.000 X forstørrelse, med skala bar vist. Højre: Histogram af nanopartikel størrelse målt ved DLS før (AuNP) og efter (PEG-AuNP) THPC udskiftning med PIND. DLS resultaterne for THPC-belagte AuNP kvantificere, hvad er visualiseret ved TEM. DLS PIND-belagt AuNP resultater overvinde udfordringen med den manglende evne til at visualisere PIND af TEM på grund af polymerer ikke er elektron tæt. En TEM PIND-AuNP vil vise kun core guld nanopartikler og vil se det samme som en THPC-udjævnede AuNP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: fluorescens data af den fluorescerende PIND-AuNP. Fluorescens peak på 667 nm kampe emission af fluorophore konjugeret til PIND-AuNP. A.U.: arbitrære enheder.
Figur 4: celle interaktioner med den fluorescerende PIND-AuNP. (A) celle levedygtighed (MTS stofskifte) plot for rotte fedt pad endotelceller efter 16 h Co inkubation med fluorescerende PIND-AuNP. (B) Konfokal tværsnitsdata billeder af fast rotte fedt pad endotelceller farves med DAPI for kerner (blå) og antistof mod heparan sulfate, en glycocalyx komponent (grøn). Øverste billede er en sund glycocalyx og bunden er en forringet glycocalyx lag; der er betydeligt flere røde fluorescens fra nanopartikler i eksemplet med forringet glycocalyx. Skalalinjen er 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Denne teknik er en effektiv metode til syntese tilpasselig, ultrasmå PIND belagt AuNPs. En vigtig del af denne procedure er den første dannelse af THPC udjævnede guld nanopartikler, som kan bekræftes ved farveskift fra gul til brun der vil forekomme efter HAuCl4 er blevet tilføjet til indholdet i rund bund kolbe (protokol trin 2.3). Ingen farveændring angiver at der ingen nanopartikler dannet, og at de første skridt bør kontrolleres og gentaget, før du fortsætter. I tilfældet farven ændres til noget andet end brown såsom vin rød eller grå, de resulterende partikler vil sandsynligvis ikke være omkring mål 2,5 nm og et nyt parti skal gøres så godt.
Efter dannelsen af den guld kerne, udveksling af THPC for PIND og rensning procedurer indeholder flere vigtige skridt for en vellykket gennemførelse af protokollen. Blande natten giver mulighed for udskiftning reaktion til at gå til færdiggørelse. Mislykkede rensning kunne opstå, hvis vandets dialyse ikke er ændret med de foreskrevne frekvenser. Sammenlægning og udfældning af partikler kan også opstå, hvis partiklerne er tilbage i dialyse i mere end 72 timer. Andre potentielle problemer kunne konstateres under fryse tørring. Hvis de ultrasmå PIND belagt AuNP løsningen ikke var helt frosset eller hvis lyophilizer ikke blev oprettet korrekt, kan prøver gå tabt. Se i brugervejledningen til den lyophilizer, som nogle udstyr kan kræve forskellige prøve præparater.
Lethed af syntese og biokompatibilitet af de resulterende partikler repræsenterer fordele for at bruge disse PEG-AuNPs. Derudover har disse nanopartikler fordelen at være i stand til at interagere med nanoskala cellulære strukturer, som det fremgår af evnen til at identificere forringet glycocalyx ved optagelsen af disse nanopartikler. Denne fordel kan udnyttes til udvikling af nye åreforkalkning behandlingsformer og forebyggende foranstaltninger. Ud over hvad vi præsenterer her, en anden fordel ved denne protokol er at det giver mulighed for omfattende tilpasning af partikler samt øget stabilitet og opbevaring kapaciteter ved at knytte thiol indeholdende PIND på guld nanopartikler4. Anden enden af PIND kæden kan indeholde enhver funktionel gruppe, og et utal af molekyler kan være konjugeret til disse grupper. Denne protokol knyttes alle tre fælles funktionelle grupper (methyl, carboxyl, og amino). Forholdet mellem PIND er valgt at prioritere fluorescerende påvisning først, så muligheden for at indarbejde en sekundær målretning gruppe ved hjælp af gruppen carboxylsyre. Nøgletal for disse grupper kan være sammenknebne baseret på programmet, og længder og udformninger af polymerer kan justeres så godt.
For at måle partikel optagelse, konjugeret vi en fluorescerende sonde til en af de funktionelle grupper. Det skal bemærkes, at enhver konjugation ud over hvad vi har beskrevet vil resultere i en ændring af nanopartikel overflade egenskaber. Hver iteration af nanopartikler med hensyn til yderligere komponenter og konjugation reaktioner bør testes for de ønskede egenskaber.
Denne metode opretter ultrasmå guld nanopartikler beregnet til at overvinde de defensive egenskaber af i endothelial ekstracellulære glycocalyx, som hæmmer optagelsen af konventionelt mellemstore nanopartikler. Men den lille størrelse egner til vanskeligheder i både billedbehandling og narkotika lastning aspekt. Disse partikler er betydeligt mindre end det typiske nanopartikel størrelsesområde, og følgelig areal til vedhæftede filer i therapeutics og målretning fraspaltning formindskes stærkt. Dette kan føre til vanskeligheder afhente individuelle signaler i imaging programmer, selv om klynger af partikler kan stadig nemt identificeres, som vist i de Konfokal billeder. Den reducerede overflade for vedhæftede filer af målretning ligander og therapeutics kan kræve flere partikler skal indgives for at opnå målet dosis krav. Men de mindre partikler bliver mere effektiv i levering når tages hensyn til glycocalyx.
Disse roman ultrasmå partikler er i stand til levering i vanskelige at nå nanoskala områder inden for kroppen med minimal afbrydelse af mikromiljø. Tilsætning af STANGEN giver mulighed for øget biokompatibilitet og tilbyder funktionelle grupper for tunge tilpasning af partikler til forskellige applikationer. Den mindre størrelse i forhold til typiske nanopartikler kommer med nogle mangler, men hvis udarbejdes strategisk, de ultrasmå partikel er en lovende tilgang til indkvartering af de vanskeligt at trænge ind, indviklede, og skrøbelige glycocalyx i vaskulær målretning og drug delivery.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Northeastern University Chemical Engineering Department, give Start-up midler og en Tier 1 Pilot studie tilskud fra Northeastern University Provst Office, NIH K01 HL125499 og NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Forfatterne vil også gerne takke Thomas J. Webster og hans lab for deres bistand samt Nanomedicin Science og Technology Center og Pharmaceutical Sciences Department på Northeastern University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
| Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
| Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
| Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
| Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
| Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
| Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
| Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
| Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
| 10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |
References
- Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).
- Feng, X., et al. Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Kumar, R., et al. Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy. Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).
- Tarbell, J. M., Ebong, E. E. The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer. Sci. Signal. 1 (40), (2008).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).
- Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases. Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).
- Muzykantov, V., Muro, S. Targeting delivery of drugs in the vascular system. Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).
- Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. Targeted delivery of therapeutics to endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).
- Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier. Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).
- Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting. Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).
- Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).
