في فيفو رصد للتعبير الجيني الإيقاعية على مدار الساعة في نواة Suprachiasmatic الماوس استخدام الصحفيين الأسفار
Summary
تمكن هذه التكنولوجيا المطورة حديثا على أساس fluorescence الرصد طويل الأجل لنسخ جينات الإيقاعية على مدار الساعة في نواة suprachiasmatic (SCN) بحرية التحرك الفئران في الوقت الحقيقي وعالية دقة زمنية.
Abstract
يجمع هذا الأسلوب بين الألياف الضوئية بوساطة fluorescence التسجيلات مع إيصال الدقيق من الفيروسات المرتبطة بالغدة المؤتلف على أساس الجينات الصحفيين. هذا جديدة وسهلة الاستخدام في فيفو fluorescence رصد وضع النظام لتسجيل إيقاع النسخي الجينات على مدار الساعة، Cry1، في نواة suprachiasmatic (SCN) تتحرك بحرية الفئران. للقيام بذلك، صمم مراسل fluorescence نسخ Cry1 وتعبئتها في الفيروسات المرتبطة بالغدد. تم حقن المنقي، يتركز فيروس الماوس العقدة التي تليها الإدراج الألياف البصرية، التي كانت ثابتة ثم على سطح الدماغ. أعيدت إلى اقفاصها منزل الحيوانات ويسمح بفترة انتعاش بعد العمليات الجراحية 1-شهر لضمان التعبير مراسل كافية. ثم سجلت الأسفار في الانتقال بحرية الفئران عن طريق في فيفو رصد النظام الذي شيد في مؤسستنا. في فيفو نظام تسجيل، اقترن 488 نانومتر ليزر بشعاع 1 × 4-تقسيم التي تنقسم على ضوء الليزر الإثارة النواتج الأربعة من سلطة متساوية. هذا الإعداد مكنتنا من تسجيل من الحيوانات الأربعة في وقت واحد. كل الإشارات المنبعثة من الأسفار التي جمعت عن طريق أنبوب ضوئي وبطاقة الحصول على بيانات. وفي المقابل للإضاءة الحيوية السابقة في فيفو تقنية تسجيل الإيقاعية على مدار الساعة، هذه الأسفار في فيفو نظام تسجيل يسمح تسجيل التعبير الجيني الإيقاعية على مدار الساعة أثناء دورة خفيفة.
Introduction
في الثدييات، يحكم نواة suprachiasmatic (SCN) إيقاع circadian في الجسم كله لتنسيق استجابة الفرد للتغيرات البيئية الخارجية (مثلاً، والضوء، ودرجة الحرارة، والإجهاد، إلخ)1. المكونات الأساسية على مدار الساعة وتتكون من Per1-3, Cry1-2، على مدار الساعة، و Bmal1، وتلعب دوراً محوريا في تنظيم الإيقاعية عقارب الساعة لكل خلية. يحتوي كل خلية في اللجنة الفرعية للتغذية على المنشط النسخي، ساعة/BMAL1، الذي يعمل بوصفه هيتيروديمير للحث على التعبير عن في والبكاء. في/مجمع صرخة ثم يحول دون وظيفة على مدار الساعة/BMAL1 لتشكيل حلقة مفرغة نسخ-ترجمة التي تستغرق حوالي 24 ساعة ل إكمال2،3.
الدراسات السابقة في اللجنة الفرعية للتغذية قد استخدمت أساسا السابقين فيفو العقدة شريحة الثقافة الأسلوب4،،من56 ، وفي حين أن هذا النهج قد قدمت معلومات قيمة، القيود حالت دون قدرتنا على الحصول على بيانات بشأن تأثير نويات الدماغ الأخرى في اللجنة الفرعية للتغذية، فضلا عن تأثير المنبهات الخارجية (مثلالضوء) على خلايا المقيمين في هذه المنطقة الحرجة. وفي عام 2001، كان الفريق هيتوشي اوكامورا الأول من استخدام نظام الإضاءة الحيوية للتعبير الجيني في فيفو رصد الإيقاعية على مدار الساعة في اللجنة الفرعية للتغذية في الانتقال بحرية الفئران7. وأنفقت المجموعة كين-آشي Honma في السنوات القليلة الماضية زيادة تطوير الإضاءة الحيوية في فيفو نظام التسجيل في العقدة8،،من910. وقدمت هذه الدراسات معا، الباحثين مع القدرة على مراقبة على مدار الساعة الإيقاعية في الظلام المستمر أو بعد نبضة خفيفة. ومع ذلك، نظراً لأن الإضاءة الحيوية قاتمة جداً للسماح للمراقبة المستمرة خلال دورة الضوء/الظلام، إلى جانب حقيقة أن الضوء هو إشارة الغالبة المطلوبة للرائعة العقدة بوساطة من الساعات الإيقاعية11، هناك الطلب المتزايد على تطوير أساليب تجريبية والتغلب على القيود المرتبطة بتسجيل الإضاءة الحيوية. ويصف التقرير الحالي نظام قائم على الأسفار التي تم بناؤها لمراقبة على مدار الساعة الإيقاعية للعقدة في فيفو في الانتقال بحرية الفئران. هذه طريقة سهلة لاستخدام تصاريح المراقبة المستمرة خلال دورة الضوء/الظلام ويسمح للمراقبة الطويلة الأمد لنسخ جينات الإيقاعية على مدار الساعة في اللجنة الفرعية للتغذية في الوقت الحقيقي والزمنية بدقة عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
على النقيض من السابقين فيفو الأساليب، مثل شريحة الثقافة4،5، الرايت-بكر16و في الموقع التهجين17، التي تتطلب أن يكون قتل الحيوانات، في فيفو تسجيل أسلوب يسمح المحققين لدراسة التعبير الجيني الإيقاعية في الحيوانات حية. على…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء في مختبر تشانغ لتوفير حفز المناقشات وأعضاء في مختبر زان لتوفير المساعدة التقنية. وكان يؤيد هذا البحث بمنح 31500860 (إلى C.Z.) من تشرف، 2012CB837700 (إلى E.E.Z. و C.Z.) لبرنامج 973 من M.O.S.T. الصين، وتمويل من “حكومة بلدية بكين”. وأيد E.E.Z. الصينية “برنامج التوظيف للخبراء من الشباب العالمي”.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
Riferimenti
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
