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Developmental Biology

सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति का प्रयोग करते हुए Prometaphase और Metaphase में आर्म सामंजस्य की स्थिति पर नजर रखने के लिए मैं Drosophila अंडाणुओं

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56802
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Dartmouth College

Summary

इस पांडुलिपि एक्सगुणसूत्र बांह जांच और सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति प्रदर्शन पैदा करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करने के लिए prometaphase और metaphase में बहन chromatid सामंजस्य की स्थिति की जांच मैं गिरफ्तार Drosophila अंडाणुओं । यह प्रोटोकॉल निर्धारित करने के लिए उपयुक्त है कि meiotic आर्म सामंजस्य अलग पादी में बरकरार है या बाधित है ।

Abstract

मनुष्यों में गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों अंडाणुओं में गर्भपात और जंम दोष के बहुमत के लिए जिंमेदार हैं । इसके अलावा, महिलाओं की उंर के रूप में, एक aneuploid भ्रूण गर्भ धारण के अपने जोखिम नाटकीय रूप से बढ़ जाती है और इस घटना को मातृ आयु प्रभाव के रूप में जाना जाता है । meiotic डिवीजनों के दौरान सही गुणसूत्र अलगाव के लिए एक आवश्यकता विस्तारित दौर अवधि के दौरान बहन chromatid सामंजस्य का रखरखाव है कि अंडाणुओं अनुभव । दोनों मनुष्यों और मॉडल जीवों में कोशिकाविज्ञान सबूत से पता चलता है कि meiotic सामंजस्य उंर बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान खराब करता है । इसके अलावा, मानव अंडाणुओं में अलगाव त्रुटियों अर्धसूत्रीविभाजन मैं, एआरएम सामंजस्य के समय से पहले नुकसान के अनुरूप के दौरान सबसे अधिक प्रचलित हैं । मॉडल जीवों के उपयोग तंत्र है कि आबाद उंर सामंजस्य के आश्रित नुकसान को खंडित करने के लिए महत्वपूर्ण है । Drosophila melanogaster अंडाणुओं में meiotic सामंजस्य के नियमन का अध्ययन करने के लिए कई लाभ प्रदान करता है । हालांकि, हाल ही में जब तक, केवल आनुवंशिक परीक्षण अलग पादी के अंडाणुओं में या विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत हाथ सामंजस्य के नुकसान के लिए परख के लिए उपलब्ध थे । यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए सीधे prometaphase में हाथ सामंजस्य में दोषों की कल्पना करने के लिए प्रदान की जाती है मैं और metaphase मैं Drosophila अंडाणुओं गिरफ्तार कर लिया । एक मछली जांच है कि एक्स गुणसूत्र के बाहर की बांह और फोकल जेड के ढेर का संग्रह करने के लिए hybridizes पैदा करके, एक शोधकर्ता तीन आयामों में व्यक्तिगत मछली संकेतों की संख्या कल्पना और निर्धारित कर सकते है कि क्या बहन chromatid हथियार है अलग. रेखांकित प्रक्रिया यह संभव है कि Drosophila अंडाणुओं के सैकड़ों में हाथ सामंजस्य दोष यों तो बनाता है । जैसे, इस विधि तंत्र है कि सामंजस्य रखरखाव के लिए योगदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कारकों है कि उंर बढ़ने की प्रक्रिया के दौरान अपने निधन के लिए नेतृत्व की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।

Introduction

बँटवारा और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान गुणसूत्रों के उचित अलगाव की आवश्यकता है कि बहन chromatid सामंजस्य स्थापित किया, बनाए रखा, और एक समंवित फैशन1,2में जारी की । सामंजस्य एस चरण के दौरान स्थापित किया गया है और cohesin जटिल है, जो शारीरिक संबंध है कि बहन chromatids एक साथ पकड़ रूपों द्वारा मध्यस्थता है । अर्धसूत्रीविभाजन में, सामंजस्य एक अंतरराष्ट्रीय भी कार्य करने के लिए बाहर संयोजक homologs एक साथ पकड़ और इस शारीरिक एसोसिएशन में मदद करता है bivalent मैं धुरी (चित्रा 1)3,4पर metaphase का उचित अभिविंयास सुनिश्चित करने के लिए, 5. anaphase में एआरएम सामंजस्य के रिलीज मैं homologs विपरीत धुरी डंडे को अलग करने की अनुमति देता है । हालांकि, अगर एआरएम सामंजस्य समय से पहले खो दिया है, संयोजक homologs अपने शारीरिक कनेक्शन खो देंगे और बेतरतीब ढंग से अलग है, जो aneuploid gametes में परिणाम कर सकते है (चित्रा 1) ।

मानव अंडाणुओं में, गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों गर्भपात और जंम दोष के प्रमुख कारण हैं, जैसे नीचे सिंड्रोम6, और उनकी घटना मातृ आयु7के साथ तेजी से बढ़ जाती है । सिस्टर chromatid सामंजस्य भ्रूण अंडाणुओं में स्थापित है और meiotic पुनर्संयोजन के पहले जंम पूरा हो गया है । अंडाणुओं तो मध्य दौर में गिरफ्तारी मैं ovulation तक और इस गिरफ्तारी के दौरान, संयोजक homologs के जारी शारीरिक एसोसिएशन बहन chromatid सामंजस्य पर निर्भर करता है । इसलिए, अर्धसूत्रीविभाजन और सामांय गर्भावस्था के परिणामों के दौरान सटीक अलगाव की आवश्यकता है कि सामंजस्य के लिए पांच दशकों तक बरकरार रहेगा ।

मानव अंडाणुओं के लंबे समय तक meiotic गिरफ्तारी के दौरान सामंजस्य के समयपूर्व नुकसान के लिए मातृ आयु प्रभाव और सबूत की एकाधिक पंक्तियों का समर्थन इस परिकल्पना8,9में योगदान करने का प्रस्ताव किया गया है । हालांकि, मानव अंडाणुओं में meiotic सामंजस्य अध्ययन की चुनौतियों को देखते हुए, इस घटना की हमारी समझ के बहुत मॉडल जीवों के उपयोग पर निर्भर करता है5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila melanogaster अंडाणुओं meiotic सामंजस्य और गुणसूत्र अलगाव के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं । एक साधारण आनुवंशिक परख एक aneuploid gametes से संतान को ठीक करने और एक बड़े पैमाने पर11,16,17पर एक्सगुणसूत्र अलगाव की निष्ठा को मापने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, एक यह भी निर्धारित कर सकते है कि गुणसूत्र अलगाव त्रुटियों उठता है क्योंकि संयोजक homologs अर्धसूत्रीविभाजन मैं, एक phenotype है कि हाथ की समयपूर्व नुकसान के साथ संगत है के दौरान अलगाव सामंजस्य11,18, 19. Drosophila अंडाणुओं में meiotic सामंजस्य के राज्य का प्रत्यक्ष अवलोकन भी सीटू प्रतिदीप्ति (मछली) में संकरण का प्रयोग संभव है. हालांकि फ्लोरोसेंट oligonucleotides है कि दोहराए उपग्रह दृश्यों के लिए संकरण के लिए इस्तेमाल किया गया है एक दशक से अधिक के लिए परिपक्व Drosophila अंडाणुओं4,20, एआरएम के विश्लेषण में pericentromeric सामंजस्य मॉनिटर सामंजस्य ज्यादा चुनौतीपूर्ण रहा है । एआरएम सामंजस्य के राज्य के दृश्य एक जांच की आवश्यकता है कि एक प्रतिलिपि दृश्यों का एक बड़ा क्षेत्र फैलाती है और काफी उज्ज्वल व्यक्तिगत बहन chromatids के लिए दिखाई संकेतों में परिणाम जब बांह सामंजस्य अनुपस्थित है । इसके अलावा, oocyte निर्धारण शर्तों और लेबल DNAs के आकार बड़े परिपक्व Drosophila oocyte (२०० µm चौड़ा द्वारा ५०० µm लंबे) में प्रवेश21 की सुविधा होनी चाहिए । हाल ही में, एक हाथ जांच सफलतापूर्वक anaphase मैं के दौरान Drosophila oocyte chromatids कल्पना का उपयोग किया गया था, लेकिन लेखकों ने कहा कि वे prometaphase या metaphase में एक संकेत का पता लगाने मैं22अंडाणुओं गिरफ्तार नहीं कर सका । यहां हम X-गुणसूत्र हाथ मछली जांच और oocyte तैयारी की स्थिति है कि हम prometaphase मैं और metaphase मैं अंडाणुओं में बहन chromatid सामंजस्य के समय से पहले नुकसान के लिए परख करने की अनुमति दी है की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इन तकनीकों, जो हमें सक्षम है जीन उत्पादों है कि meiotic सामंजस्य के रखरखाव के लिए आवश्यक है की पहचान करने के लिए, दूसरों की अनुमति होगी बहन chromatid सामंजस्य दोषों के लिए परख करने के लिए विभिंन Drosophila के परिपक्व अंडाणुओं पादी में ।

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Protocol

1. तैयारी

  1. सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति के लिए समाधान तैयार करें । ultrapure पानी का उपयोग कर सभी समाधान तैयार करें ।
    1. 5x संशोधित लूट का बफर तैयार: २७५ मिमी पोटेशियम एसीटेट, २०० मिमी सोडियम एसीटेट, ५०० मिमी सुक्रोज, ५० मिमी ग्लूकोज, 6 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड, 5 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, ५०० मिमी HEPES पीएच = ७.४. 10 N NaOH का उपयोग कर ७.४ के लिए पीएच लाओ । फ़िल्टर बंध्याकरण और स्टोर-20 ° c । गल और जरूरत के रूप में 1x को पतला और-20 डिग्री सेल्सियस पर 1x aliquots की दुकान ।
    2. १.३ मीटर NaCl, ७० mm Na2HPO4, 30 mm णः2PO4का उपयोग करके 10x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) तैयार करें । 10 N NaOH का उपयोग कर ७.० के लिए पीएच लाओ । autoclaving या फिल्टर नसबंदी द्वारा निष्फल ।
  2. जरूरत पड़ने से एक दिन पहले पॉली-एल-Lysine coverslips तैयार करें ।
    1. पिपेट ७०% एक 18 मिमी x 18 मिमी #1 .5 coverslip और मशीन 5 मिनट की सतह पर 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड युक्त इथेनॉल तरल को दूर करने के लिए वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करें । बाँझ ultrapure पानी के साथ दोहराएँ । ०.१ मिलीग्राम/एमएल पाली-एल-lysine के साथ coverslip की सतह कवर और 10 मिनट के लिए मशीन ।
    2. महाप्राण के लिए तरल और हवा सूखी हटाने के लिए 10 मिनट. Store coverslips पाली-एल-lysine एक प्लास्टिक कंटेनर में एक तंग फिटिंग ढक्कन के साथ धूल से बचने के लिए ऊपर ।
  3. तैयार पाश्चर पिपेट अंडाणुओं को हटाने के बिना तरल समाधान को दूर करने के लिए खींच लिया । एक Bunsen बर्नर लौ पर, एक लंबे गिलास पाश्चर पिपेट के बीच गर्मी जबकि धीरे से प्रत्येक छोर पर खींच जब तक गिलास पिघला देता है और अलग खींचती है ।

2. मछली के लिए एआरएम जांच के जनरेशन

नोट: सभी केंद्रापसारक कदम पर प्रदर्शन कर रहे है ~ १६,०००-२१,००० x g (अधिकतम गति सबसे तालिका शीर्ष microcentrifuges पर) । संक्षिप्त केंद्रापसारक spins 5-15 एस भंवर के लिए कताई इंगित करता है के लिए भंवर इंगित करता है ~ 15 अधिकतम गति से एस जब तक अंयथा उल्लेख किया ।

नोट: एआरएम जांच के लिए BACs बीएसी पीएसी संसाधनों से प्राप्त किया जा सकता है । दो एक्स गुणसूत्र euchromatic एआरएम जांच सफलतापूर्वक इस विधि के साथ प्रयोग किया गया है । एक हाथ जांच कोशिकाविज्ञान बैंड 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11) के लिए इसी छह बीएसी क्लोनों से बना था । दूसरे हाथ जांच कोशिकाविज्ञान बैंड 2F-3 सी (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13) के लिए इसी छह बीएसी क्लोनों के शामिल थे । BACs अन्य Drosophila गुणसूत्र क्षेत्रों में ब्राउज़ किया जा सकता है: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html । X गुणसूत्र के ३५९ बीपी सैटेलाइट दोहराने की पहचान करने वाली दो pericentric जांच इस विधि के साथ सफलतापूर्वक की गई हैं । एक 22 न्यूक्लियोटाइड जांच बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है और अच्छी तरह से काम करता है (5 '-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23। एक 28 न्यूक्लियोटाइड जांच हाल ही में परीक्षण किया गया था और भी अच्छा काम किया (5 '-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24। HPLC शुद्ध oligonucleotides 5 ' एक विशिष्ट fluorophore के साथ लेबल एक वाणिज्यिक स्रोत से आदेश दिया गया (उदा, एकीकृत डीएनए प्रौद्योगिकियों) ।

  1. प्रस्तुत बीएसी क्लोन डीएनए निंनलिखित किट निर्देश के रूप में सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट । २०० µ l ते में १०० मिलीलीटर संस्कृति से प्राप्त डीएनए गोली reसस्पेंड; अंतिम डीएनए एकाग्रता 5-40 एनजी/µ एल के बीच सीमा बीएसी क्लोन के आधार पर होना चाहिए ।
  2. प्रत्येक बीएसी प्रवर्धन किट का उपयोग कर के लिए डीएनए प्रवर्धन प्रदर्शन, के रूप में सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट है, और निंनलिखित प्रोटोकॉल । व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक क्लोन के लिए बीएसी डीएनए प्रक्रिया । एंजाइमों और 2.2.3 के माध्यम से 2.2.1 चरणों में किट के साथ आपूर्ति की बफ़र्स का उपयोग करें ।
    1. बीएसी डीएनए के यादृच्छिक विखंडन: प्रत्येक बीएसी के लिए उपयोग करने के लिए एक २०० µ एल पीसीआर ट्यूब में एक 1 एनजी/µ एल डीएनए समाधान के 10 µ एल तैयार करने के लिए । 10x फ़्रेग्मेंटेशन बफ़र के 1 µ l जोड़ें । एक पीसीआर मशीन में ट्यूब ९५ डिग्री सेल्सियस पर ठीक 4 मिनट के लिए जगह है । तुरंत बर्फ के पानी में नमूना ठंडा और संक्षेप में केंद्रापसारक । मशीन समय संवेदनशील है और किसी भी विचलन परिणाम बदल सकता है ।
    2. पुस्तकालय की तैयारी
      नोट: इस विधि प्रवर्धित अंशों का एक पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करता है.
      1. डीएनए युक्त ट्यूब करने के लिए निंनलिखित जोड़ें: 2 µ के एल 1x पुस्तकालय की तैयारी बफर, 1 पुस्तकालय स्थिरीकरण समाधान के µ एल । भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण, संक्षेप में, और पीसीआर मशीन में ट्यूब जगह 2 मिनट के लिए ९५ ° c. तुरंत बर्फ के पानी में नमूना ठंडा और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
      2. पीसीआर ट्यूब के लिए पुस्तकालय की तैयारी एंजाइम के 1 µ एल जोड़ें, मिश्रण और संक्षेप में केंद्रापसारक । पीसीआर मशीन में जगह पीसीआर ट्यूब और इस प्रकार के रूप में मशीन: 20 मिनट के लिए 16 ° c, 20 मिनट के लिए 24 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट के लिए ३७ ° c, 5 मिनट के लिए ७५ ° c, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
      3. पीसीआर मशीन से नमूने निकालें और संक्षेप में केंद्रापसारक । नमूनों को तुरंत परिलक्षित किया जा सकता है या तीन दिनों तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
    3. बीएसी डीएनए लाइब्रेरी का प्रवर्धन
      1. पूरे 15 µ l यादृच्छिक टुकड़ा प्रतिक्रिया करने के लिए निम्न एजेंट जोड़ें: ७.५ µ एल 10x प्रवर्धन मास्टर मिक्स, ४७.५ µ l Nuclease मुफ्त पानी, 5 µ l WGA डीएनए पोलीमरेज़. भंवर से अच्छी तरह से मिश्रण और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
      2. पीसीआर मशीन में जगह पीसीआर ट्यूब और इस प्रकार है: प्रारंभिक विकार ९५ ° c 3 मिनट के लिए, विकार के 14 चक्रों के लिए ९४ ° c पर 15 s, एनीलिंग/विस्तार के लिए ६५ ° c पर 5 मिनट के लिए, उसके बाद 4 ° c पर पकड़ो ।
      3. साइकिलिंग पूरी होने के बाद ही डीएनए एकाग्रता को परख पाता है । डीएनए की एकाग्रता होना चाहिए कम से ८०० एनजी/µ l नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें या पाचन के लिए तैयार होने तक-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । वैकल्पिक रूप से, एक 2% agarose जेल पर डीएनए के ४०० एनजी चलाने के द्वारा डीएनए टुकड़ा आकार का आकलन । अंशों को २०० bp से लेकर 3 kb (चित्र 2) तक होना चाहिए ।
  3. प्रतिबंध एंजाइम प्रवर्धित डीएनए के पाचन
    1. एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में पिछले अनुभाग से प्रवर्धित डीएनए के 20 µ जी प्लेस । Alul की 20 इकाइयों जोड़ें, Haelll, Msel, Mspl, ७साल, BfuCl की 25 इकाइयों, ०.५ µ एल 100x BSA, 5 µ एल 10x प्रतिबंध एंजाइम पाचन बफर, और मात्रा को समायोजित करने के लिए ५० µ l की उचित मात्रा में जोड़कर ultrapure एच2ओ.
    2. एक मशीन में ३७ ° c पर रात भर डाइजेस्ट को ढक्कन पर रोक लगाने के लिए । इथेनॉल पचा डीएनए हाला । डाइजेस्ट में जोड़ें: 1 µ एल ग्लाइकोजन, 1/10 volume 3m सोडियम एसीटेट, २.५ वॉल्यूम १००% आणविक ग्रेड इथेनॉल । 1 ज या रात भर के लिए-८० ° c पर मशीन ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कमरे में अस्थाई ७०% इथेनॉल और स्पिन के 1 मात्रा के साथ डीएनए गोली धो लो । supernatant निकालें और चलो डीएनए गोली हवा शुष्क या धीरे हवा की एक सतत स्ट्रीम के साथ सूखी ।
    4. ३६ µ l बाँझ ultrapure ज2O में डीएनए गोली पुनः निलंबित और डीएनए के 1 µ एल का उपयोग करने के लिए परख dna एकाग्रता, जो लगभग होना चाहिए २८५ एनजी/µ एल-20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की दुकान ।
    5. वैकल्पिक डीएनए के एक 2% agarose जेल में डीएनए के एनजी ४०० चल आकार का आकलन । सबसे टुकड़े १००-२०० बीपी से लेकर, एक बेहोशी संकेत के साथ होना चाहिए ५०० bp (चित्रा 2) ।
  4. 3 ' पूंछ प्रतिक्रिया
    1. एक गर्मी ब्लॉक में 1 मिनट के लिए १०० ° c पर पचा डीएनए स्वभाव । तुरंत बर्फ के पानी में ठंडा । डीएनए के ३५ µ एल करने के लिए, निम्न जोड़ें: ५० µ एल ४०० मिमी सोडियम cacodylate, 1 µ एल 10 मिमी डीटीटी, और भंवर अच्छी तरह से. जोड़ें 4 µ एल 25 मिमी CoCl2, २.५ µ एल 2 मिमी 5-(3-aminoallyl)-dUTP से ARES लेबलिंग किट सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट के रूप में, 5 µ l 1mM dTTP, 18 µ l 5x TdT बफर, और 1 µ l टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ (TdT) ४०० यू/µ एल भंवर और संक्षेप में ।
      चेतावनी: CoCl2 विषाक्त है, उचित संरक्षण पहनते हैं ।
    2. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए एक मशीन में मशीन के लिए संघनित्र को रोकने के । मिश्रण करने के लिए संक्षेप में प्रतिक्रिया और भंवर को रोकने के लिए २५० mM EDTA के 1 µ एल जोड़ें । इथेनॉल ऊपर वर्णित के रूप में पूंछ डीएनए हाला (steps 2.3.2-2.3.4) । 10 µ में सूख रही डीएनए गोली को फिर से सस्पेंड l बाँझो ultrapure H2O. जब तक तैयार जारी रखने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की दुकान ।
  5. फ्लोरोसेंट डाई विकार सामग्री तालिका में निर्दिष्ट के रूप में डीएनए लेबलिंग किट का उपयोग कर आचरण ।
    नोट: एक बार डाई अंधेरे में नमूने रखने जोड़ा जाता है.
    1. एक गर्मी ब्लॉक में 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर पूंछ डीएनए स्वभाव । तुरंत बर्फ के पानी में डीएनए शांत और संक्षेप में केंद्रापसारक । किट निर्देशों के अनुसार लेबलिंग बफर तैयार करें और प्रत्येक डीएनए नमूने के लिए 6 µ l जोड़ें । किट से DMSO के 4 µ एल में डाई की प्रत्येक ट्यूब reसस्पेंड । भंवर और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
    2. प्रत्येक लेबलिंग प्रतिक्रिया के लिए डाई का एक ट्यूब का प्रयोग करें । डीएनए, भंवर के लिए डाई समाधान जोड़ें, और संक्षेप में केंद्रापसारक । अंधेरे में 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर लेबलिंग प्रतिक्रिया की मशीन । ७७ के बाद प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 3m hydroxylamine के 3 µ l जोड़ें किट से nuclease-free H2O का µ l । भंवर और संक्षेप में केंद्रापसारक ।
  6. सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट के रूप में पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग कर गैर संयुग्मित डाई निकालें । निर्माता के निर्देशों का पालन करें । Elute डीएनए के कॉलम से दो बार ४० µ एल का उपयोग करते हुए रेफरेंस बफर का हर बार प्रयोग करते हैं.
  7. इथेनॉल पहले वर्णित के रूप में लेबल डीएनए हाला (steps 2.3.2-2.3.4) । 10 µ एल रेफरेंस बफर में सूख रही डीएनए गोली को फिर से सस्पेंड ।
  8. जांच मिश्रण तैयार
    1. लेबल डीएनए के लिए, pmol/µ एल में fluorochrome डाई की एकाग्रता का निर्धारण । fluorophore एकाग्रता 30-100 pmol/µ एल से लेकर, बीएसी के आधार पर हो सकता है । डीएनए एकाग्रता से रेंज मई ३००-८०० एनजी/µ एल
      नोट: microarray सेटिंग किसी microvolume spectrophotometer, जैसे कि सामग्री तालिका में निर्दिष्ट पर अच्छी तरह से काम करता है । microarray विंडो में, का चयन करें डीएनए-५०, और निर्दिष्ट fluorochrome ।
    2. प्रत्येक बीएसी जांच के equimolar मात्रा (pmol fluor) के संयोजन के द्वारा एक मास्टर मिश्रण बनाएं । भंवर 30 के संयोजन से पहले एस । फ्रीज/गल चक्र से बचने के लिए, मास्टर मिश्रण के aliquots तैयार, वाष्पीकरण को रोकने के लिए ट्यूबों के लिए आयल फिल्म लागू, और-20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर ।
      नोट: 30-50 µ एल की कुल मात्रा में 6 व्यक्तिगत बीएसी जांच में से प्रत्येक के २५० pmol युक्त एक mastermix अच्छी तरह से काम करता है । प्रत्येक बीएसी के लिए 25 pmol (fluor) युक्त एक aliquot २ ४० µ एल संकरण प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त होगा, ०.३१ pmol fluor के एक अंतिम जांच एकाग्रता के साथ/µ एल प्रत्येक बीएसी के लिए ।

3. अंडाणुओं का विच्छेदन और निर्धारण

  1. उपयुक्त जीनोटाइप के 30 वयस्क कुंवारी महिलाओं लीजिए । देर स्टेज अंडाणुओं के लिए समृद्ध करने के लिए, विच्छेदन25से पहले 3-5 दिनों के लिए मक्खी खाद्य और शुष्क खमीर के साथ एक शीशी में पुरुषों के बिना महिलाओं पकड़ो । विच्छेदन से पहले दिन, खमीर के साथ एक ताजा शीशी को गैस के बिना महिलाओं के हस्तांतरण ।
  2. विच्छेदन करते हैं ।
    नोट: आवश्यक उपकरण के लिए चित्र 3 देखें । समाधान एक खींच पाश्चर पिपेट का उपयोग कर हटा रहे है जब तक अंयथा उल्लेख किया । जब स्थानांतरित अंडाशय हमेशा एक पिपेट टिप एक 10% BSA समाधान के साथ लेपित का उपयोग करें ।
    1. संशोधित लूट बफर युक्त एक उथले विदारक पकवान में, एक महिला से अंडाशय को दूर करने के लिए संदंश का उपयोग करें । संदंश या एक टंगस्टन सुई का प्रयोग धीरे से प्रत्येक अंडाशय splay, समाधान की अनुमति भीतरी ovarioles संपर्क करने के लिए । एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब के लिए splayed अंडाशय की जोड़ी हस्तांतरण 1 मिलीलीटर संशोधित है लूट बफर युक्त ।
    2. दोहराएँ चरण 3.2.1 १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब में 20-25 महिलाओं से अंडाशय जमा करने के लिए. 10 मिनट के भीतर 20-25 महिलाओं के विच्छेदन समाप्त ।
  3. निर्धारण निम्नानुसार करते हैं ।
    1. एक खींचा पाश्चर पिपेट के साथ, microfuge ट्यूब में तरल निकालें, जल्दी से ५०० µ एल ३७ के अंडाशय को ठीक करने के लिए जोड़ने के लिए एक P1000 का उपयोग करें, और फिर तुरंत के कमरे के तापमान µ के लिए ५०० हेप् जोड़ें ।
    2. शेक microfuge ट्यूब मिश्रण करने के लिए और एक nutator पर जगह के लिए 3 मिन. nutator से microfuge ट्यूब निकालें और 1 मिनट के लिए एक ट्यूब रैक में जगह अंडाणुओं को नीचे बसने के लिए अनुमति देते हैं । कुल निर्धारण का समय 4 min.
      सावधानी: ठीक समाधान और हेप् विषाक्त कर रहे हैं, उपयुक्त संरक्षण पहनते हैं ।
    3. फिक्स समाधान निकालें और अंडाशय कुल्ला 3 ५०० µ एल में तीन बार ०.५% BSA और ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० (PBSBTx) युक्त
  4. शेष पादी के लिए दोहराएँ ।

4. चोरियों और Vitelline झिल्ली को हटाने

नोट: आवश्यक उपकरण के लिए चित्र 3 देखें ।

  1. पृथक देर स्टेज अंडाणुओं
    1. एक उथले विदारक पकवान के लिए 1 मिलीलीटर PBSBTx जोड़ें । एक BSA लेपित टिप के साथ एक P200 का प्रयोग करने के लिए तय अंडाशय हस्तांतरण (~ १५० µ एल में) उथले पकवान में । पिपेट अंडाशय ऊपर और नीचे BSA लेपित पिपेट टिप के साथ कम परिपक्व अंडाणुओं से परिपक्व अंडाणुओं बेदखल करने के लिए ।
    2. जब देर स्टेज अंडाणुओं पर्याप्त रूप से अलग कर रहे हैं, एक ५०० µ एल microfuge ट्यूब के लिए सभी ऊतक हस्तांतरण । एक खींच पाश्चर पिपेट के साथ अतिरिक्त तरल निकालें, ट्यूब में के बारे में १५०-२०० µ एल जा । शेष पादी के लिए धारा ४.१ को दोहराएँ.
  2. रोलिंग के लिए तैयार
    1. पूर्व गीला PBSBTx के २०० µ एल के साथ एक गहरी अच्छी तरह से पकवान. Cover और अलग सेट । 3 फ्रॉस्टेड ग्लास स्लाइड प्राप्त करें और एक तरफ #3 स्लाइड सेट करें । धीरे #1 स्लाइड के फ्रॉस्टेड ग्लास क्षेत्रों रगड़ और एक साथ #2 । उंहें पानी में कुल्ला करने के लिए किसी भी कांच का ठीकरा और एक डिस्पोजेबल पोंछ के साथ सूखी हटाने के लिए ।
    2. कोट #1 स्लाइड के फ्रॉस्टेड क्षेत्रों और एक स्लाइड करने के लिए PBSBTx के ५० µ l जोड़कर PBSBTx के साथ #2 और अन्य स्लाइड के साथ इस क्षेत्र रगड़. एक डिस्पोजेबल पोंछ के साथ तरल निकालें ।
    3. स्लाइड को चित्र 4aमें दिखाए गए कॉंफ़िगरेशन में एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत रखें । स्लाइड #3 समर्थन स्लाइड #2 के साथ स्लाइड्स #1 और #2 के फ्रॉस्टेड क्षेत्रों को संपर्क में रखें ।
  3. रोल अंडाणुओं; सुनिश्चित करें कि रोलिंग की दिशा हमेशा एक सीधी रेखा में है और एक परिपत्र गति कभी नहीं ।
    1. Prewet एक P200 पिपेट टिप PBSBTx और अंडाणुओं ट्यूब में microfuge ऊपर और नीचे से फैलाने में pipetting । स्थानांतरण ५० µ एल तरल युक्त अंडाणुओं स्लाइड #1 के फ्रॉस्टेड ग्लास भाग के केंद्र के लिए । यह करने के लिए #2 स्लाइड उठाएं ।
    2. धीरे कम स्लाइड #2 जब तक तरल की सतह तनाव दो ठंढ कांच क्षेत्रों के बीच एक सील बनाता है । वहां पर्याप्त करने के लिए फ्रॉस्टेड क्षेत्र को कवर तरल होना चाहिए, लेकिन कोई भी बाहर रिसाव होना चाहिए । तरल बह रहा है, तो अतिरिक्त तरल को दूर करने के लिए एक खींचा पाश्चर पिपेट का उपयोग करें ।
    3. नीचे स्लाइड (#1) को एक हाथ से रखें और शीर्ष स्लाइड (#2) को क्षैतिज दिशा में आगे और पीछे ले जाने के लिए, स्लाइड #2 स्तर रखते हुए और स्लाइड #3 पर समर्थित करें । oocyte आंदोलनों और प्रगति के आसान दृश्य के लिए एक खुर्दबीन के नीचे प्रदर्शन ।
      नोट: यह आंदोलन घर्षण पैदा करेगा और अंडाणुओं के कारण "रोल" और अपनी चोरियों को खोना होगा । न्यूनतम दबाव का इस्तेमाल किया जाना चाहिए और आंदोलनों कम और जल्दी होना चाहिए ।
    4. क्षैतिज दिशा में कुछ आंदोलनों के बाद, थोड़ा आंदोलन के कोण बदल (चित्रा 4B) । एकाधिक वेतन वृद्धि में, धीरे से ९० ° करने के लिए इस कोण वृद्धि शीर्ष स्लाइड (#2) के आंदोलन तक सीधा है शुरू दिशा (चित्रा 4B) । ध्यान रखें कि खाली चोरियों में दिखाई देगा तरल और अंडाणुओं कमी चोरियों अब और पतले दिखाई देगा ।
    5. दोहराएं चरण 4.3.3-4.3.4 के बारे में 7-10 बार जब तक समाधान थोड़ा बादल हो जाता है । रोलिंग बंद करो जब अंडाणुओं के बहुमत (७५-८५%) प्रकट करने के लिए अपने vitelline झिल्ली खो दिया है ।
      नोट: एक विशिष्ट बिंदु अंत अक्सर अंडाणुओं कमी vitelline झिल्ली पर दिखाई है । Vitelline झिल्ली अधिक चोरियों से दूर करने के लिए मुश्किल हैं । प्रकाश दबाव vitelline झिल्ली के हटाने को प्राप्त करने के लिए रोलिंग, जबकि शीर्ष स्लाइड (स्लाइड #2) के लिए लागू किया जा सकता है । सभी अंडाणुओं से vitelline झिल्ली को हटाने की कोशिश कर रहा है अक्सर अंय अंडाणुओं के विनाश में परिणाम ।
    6. धीरे शीर्ष स्लाइड (#2) उठा, नीचे स्लाइड (#1) के फ्रॉस्टेड क्षेत्र के केंद्र के लिए अपने कोनों में से एक खींचना इतना है कि लुढ़का अंडाणुओं फ्रॉस्टेड क्षेत्र के केंद्र में जमा । PBSBTx के साथ PBSBTx युक्त गहरी अच्छी डिश में दोनों स्लाइड से अंडाणुओं कुल्ला ।
    7. साफ स्लाइड #1 और ultrapure पानी के साथ #2, एक डिस्पोजेबल पोंछ के साथ सूखी, और रीसेट करें । दोहराएं चरण 4.3.1-4.3.6 तक सभी अंडाणुओं एक ही जीनोटाइप के रोल किए गए हैं । यह आमतौर पर जीनोटाइप प्रति रोलिंग के 3-4 राउंड की आवश्यकता है ।
  4. रोलिंग के बाद मलबे को निकालें
    1. 1 मिलीलीटर PBSBTx को 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में डालें । भंवर ट्यूब के पक्ष कोट करने के लिए तरल ।
    2. एक PBSBTx लेपित P1000 पिपेट टिप का प्रयोग, PBSBTx के 1 मिलीलीटर युक्त शंकु ट्यूब के लिए गहरी अच्छी तरह से पकवान से लुढ़का अंडाणुओं हस्तांतरण । PBSBTx युक्त शंकु ट्यूब करने के लिए अंडाणुओं के एक अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. अंडाणुओं को नीचे बसने के लिए शुरू करते हैं, तो एक P1000 और त्याग के साथ मलबे (चोरियों, vitellines, आदि) युक्त समाधान के शीर्ष 2 मिलीलीटर को हटा दें । यदि आवश्यक हो, तो वे सिंक के रूप में अपारदर्शी अंडाणुओं देखने के लिए एक अंधेरी पृष्ठभूमि के खिलाफ शंकु ट्यूब पकड़ो ।
    4. अंडाणुओं करने के लिए PBSBTx के अतिरिक्त 2 मिलीलीटर जोड़ें, और चरण 4.4.3 दोहराएँ । दोहराएँ 4.4.3. मलबा हटाने के कुल 3 राउंड के लिए ।
    5. एक PBSBTx लेपित P1000 पिपेट टिप, मूल ५०० µ एल microfuge ट्यूब को वापस अंडाणुओं हस्तांतरण का उपयोग करना । 20-25 महिलाओं के लगभग ५० लुढ़का परिपक्व अंडाणुओं के µ एल उपज चाहिए ।
  5. ताजा ठंढ स्लाइड का उपयोग कर शेष पादी के लिए खंड 4 को दोहराएँ, एक साफ गहरी अच्छी तरह से पकवान, और प्रत्येक जीनोटाइप के लिए एक नया शंकु ट्यूब.
  6. यदि भंडारण आवश्यक है, ०.१% TritionX-१०० के साथ 1x पंजाबियों के लिए अंडाणुओं हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की दुकान । लंबी अवधि के भंडारण की सिफारिश नहीं है क्योंकि formaldehyde crosslinking गैर ईओण डिटर्जेंट द्वारा उलट जा सकता है ।

5. मछली

नोट: सभी बहाकर एक nutator पर कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे है जब तक अंयथा उल्लेख किया । microfuge ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अब ले लिया गया है कि अंडाणुओं, विशेष रूप से समाधान में formamide होते हैं । समाधान बदलते समय धैर्यवान होना जरूरी है ताकि अंडाणुओं प्रक्रिया में न खोए । यह अंडाणुओं कुल्ला और बहाकर बाद बसने जाने के लिए 5-15 मिनट प्रतीक्षा की आवश्यकता हो सकती है । यह भी ध्यान दें कि formamide में अंडाणुओं कम अपारदर्शी हैं ।

  1. निष्कर्षण और RNAse उपचार
    1. 1% ट्राइटन X-१०० (PBSTx) वाले पंजाबियों के ५०० µ l के साथ कुल्ला अंडाणुओं । तरल निकालें और जोड़ें ५०० µ l निष्कर्षण बफर (PBSTx युक्त RNAse). 2 एच के लिए कमरे के तापमान पर nutator पर मशीन ।
  2. प्री-संकरण बहाकर
    1. कुल्ला अंडाणुओं ५०० µ एल 2x खारा सोडियम साइट्रेट के बीच 20 (SSCT) युक्त के साथ 3 बार । पहले से गरम करना एक aliquot (~ ५०० µ एल/जीनोटाइप) 2x SSCT + ५०% formamide ३७ ° c के लिए ।
      सावधानी: formamide विषाक्त है, उपयुक्त सुरक्षा पहनते हैं ।
    2. धो अंडाणुओं ५०० µ एल 2x SSCT में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार । धो अंडाणुओं के लिए 10 मिनट में ५०० µ l 2x SSCT + 20% formamide । धो अंडाणुओं के लिए 10 मिनट में ५०० µ l 2x SSCT + ४०% formamide । धो अंडाणुओं के लिए 10 मिनट में ५०० µ l 2x SSCT + ५०% formamide ।
    3. तरल निकालें और ३७ ° c 2x SSCT के ५०० µ एल जोड़ें + ५०% formamide कदम 5.2.1 से नमूना और 2 ज के लिए ३७ ° c रोटेशन के साथ में मशीन ।
      नोट: एक रोटेटर से सुसज्जित संकरण ओवन इस के लिए अच्छी तरह से काम करता है । एक फोम microfuge ट्यूब रोटेटर से जुड़ी "फ्लोट" ट्यूबों को सुरक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. विकार और संकरण
    1. अंडाणुओं की प्रत्येक ट्यूब के लिए, का उपयोग ४० µ l 1x संकरण बफर युक्त २.५ एनजी/µ एल centromeric जांच और ०.३१ pmol fluor/µ एल प्रत्येक बीएसी जांच की । सभी पादी के लिए पर्याप्त संकरण बफर में जांच का एक समाधान तैयार करें । भंवर जांच जोड़ने से पहले 30 एस मिश्रण ।
    2. एक BSA-लेपित P200 पिपेट टिप, स्थानांतरण अंडाणुओं एक २०० µ एल पीसीआर ट्यूब का उपयोग करना । ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूने रखें और अंडाणुओं नीचे करने के लिए व्यवस्थित करते हैं, तो संभव के रूप में ज्यादा तरल के रूप में निकालने के लिए एक खींचा पाश्चर पिपेट का उपयोग करें ।
    3. जांच युक्त संकरण समाधान के ४० µ एल जोड़ें (खंड 2 में तैयार) अंडाणुओं के लिए । पीसीआर मशीन में अंडाणुओं युक्त पीसीआर ट्यूब प्लेस और इस प्रकार के रूप में मशीन: ३७ ° c के लिए 5 मिनट, ९२ ° c 3 मिनट के लिए, तो ३७ ° c रातोंरात । जांच के बाद अंडाणुओं में जोड़ दिया जाता है, उन्हें जितना हो सके अंधेरे में रखें ।
  4. पद-संकरण बहाकर
    1. पहले से गरम करना 2x SSCT + ५०% formamide ३७ ° c करने के लिए और संकरण मशीन में रखना । एक BSA लेपित P200 पिपेट टिप के साथ, ३७ ° c 2x SSCT + ५०% formamide के अंडाणुओं के साथ पीसीआर ट्यूब के लिए १०० µ एल जोड़ें और अंडाणुओं एक नया ५०० µ एल microfuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    2. एक ही ट्यूब के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस 2x SSCT + ५०% formamide के एक अतिरिक्त ४०० µ एल जोड़ें और अंडाणुओं मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर बसा दो ।
      नोट: बसने अक्सर इस कदम पर लंबे समय लगता है । यह 15 मिनट या अधिक समय लेने के लिए असामांय नहीं है । धैर्य की कमी अंडाणुओं के महत्वपूर्ण नुकसान में परिणाम होगा ।
    3. ५०० µ l ३७ ° c 2x SSCT + ५०% formamide में ३७ ° c रोटेशन के साथ में प्रत्येक के लिए अंडाणुओं 3 बार धो लें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर अंडाणुओं रखें, जबकि वे बसा ।
    4. ५०० µ l ३७ ° c 2x SSCT + ५०% formamide में ३७ ° c रोटेशन के साथ में प्रत्येक के लिए अंडाणुओं 3 बार धो लें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर अंडाणुओं रखें, जबकि वे बसा ।
    5. कमरे के तापमान पर, एक nutator पर ५०० µ l 2x SSCT + ४०% formamide में 10 मिनट के लिए अंडाणुओं धो लो । ५०० µ l 2x SSCT + 20% formamide में 10 मिनट के लिए अंडाणुओं धो लें । ५०० µ एल 2x SSCT में 10 मिनट के लिए अंडाणुओं धो लो ।
  5. DAPI के साथ दाग
    चेतावनी: DAPI विषाक्त है, उपयुक्त संरक्षण पहनते हैं ।
    1. SSCT पर 2x nutator में ५०० µ l DAPI समाधान (1 µ g/एमएल) में 20 मिनट के लिए धो अंडाणुओं । कुल्ला अंडाणुओं 3 ५०० µ एल 2x SSCT में बार । धो अंडाणुओं 10 मिनट के लिए 2 बार ५०० µ l 2x nutator पर SSCT में प्रत्येक के लिए । नमूनों को अंधेरे में कमरे के तापमान पर 4 ज तक के लिए संग्रहीत किया जा सकता है जब तक वे coverslips पर माउंट करने के लिए तैयार हैं ।
  6. बढ़ते
    नोट: आवश्यक उपकरण के लिए चित्र 3 देखें ।
    1. एक पाली-एल-lysine लेपित coverslip को विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे रखें । अंडाणुओं की ट्यूब से तरल निकालें, कुल मात्रा के बारे में समायोजित करने के बारे में १५० µ l एक BSA लेपित P200 पिपेट टिप के साथ, पिपेट ऊपर और नीचे समाधान भर में अंडाणुओं फैलाने के लिए, और फिर एक पाली-L-µ लेपित अंडाणुओं के लिए lysine/समाधान के ४० coverslip एल हस्तांतरण ।
    2. coverslip से तरल के कुछ निकालें एक खींचा पाश्चर पिपेट का उपयोग कर जब तक अंडाणुओं coverslip के लिए छड़ी लेकिन अभी भी तरल से घिरे हैं । संदंश के साथ, एक तरफ कवर स्लिप नीचे पकड़ो और धीरे अंडाणुओं के अलग के झुरमुट को एक टंगस्टन सुई का उपयोग करने के लिए, उंहें गैर अतिव्यापी अंडाणुओं की एक परत को प्राप्त करने के लिए चलती ।
    3. एक खींचा पाश्चर पिपेट के साथ अंडाणुओं चारों ओर तरल के शेष निकालें । एक साफ गिलास स्लाइड ले लो और किसी भी धूल से उड़ाने के लिए संपीड़ित गैस का उपयोग करें । बढ़ते मीडिया के 22 µ एल जोड़ें (उदा., लम्बा-गोल्ड) स्लाइड के बीच में । धीरे coverslip की ओर स्लाइड कम, बढ़ते नमूना का सामना करना पड़ मीडिया के साथ, जब तक मीडिया को छू नमूना । सतह तनाव coverslip स्लाइड का पालन करने के लिए कारण होगा ।
    4. स्लाइड को एक प्लास्टिक कंटेनर में एक टाइट-ढाले ढक्कन के साथ रखें जिसमें ताजी dessicant की परत हो (उदा, drierite) । आइए स्लाइड इमेजिंग से पहले अंधेरे में 3-5 दिनों के लिए सूखी । सुखाने समय कमरे की आर्द्रता के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।

6. इमेजिंग

  1. dessicant के बॉक्स से सूखी स्लाइड हटाने पर, उन्हें साफ करने के लिए किसी भी धूल कणों को दूर करने के लिए । नेल पॉलिश के साथ सील coverslips । मुहरबंद स्लाइड्स-20 डिग्री सेल्सियस पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. अधिग्रहण लेजर स्कैनिंग फोकल छवियों 6X डिजिटल ज़ूम के साथ एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर 40X तेल उद्देश्य का उपयोग कर ।
    नोट: आदर्श रूप में, सिस्टम सॉफ्टवेयर एक को खोजने के लिए और कई अंडाणुओं के लिए meiotic गुणसूत्रों के एक्स-वाई स्थान चिह्नित करते हुए उन्हें epifluorescence का उपयोग करते हुए देखने की अनुमति देगा. यह क्षमता एक इमेजिंग सत्र के दौरान समय बचाता है । एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर 60X उद्देश्य के साथ रैपिड ब्लीचिंग चुना फोकल सिस्टम के साथ अपने अनुपयुक्त उपयोग किया है, लेकिन यह अंय प्रणालियों के लिए काम कर सकते हैं ।
  3. प्रत्येक oocyte के लिए एक जेड श्रृंखला पर कब्जा, DAPI संकेत का उपयोग कर श्रृंखला के ऊपर और नीचे की स्थापना ।
    नोट: लाभ, ऑफसेट, और लेजर शक्ति अंडाणुओं के एक सबसेट का उपयोग empirically निर्धारित किया जा करने की आवश्यकता होगी । एक बार उपयुक्त पैरामीटर पाए जाते हैं, केवल मामूली समायोजन किए जाने की आवश्यकता होनी चाहिए ।
    यदि बदल अधिग्रहण सेटिंग्स की आवश्यकता है, पहले एकत्र छवि स्टैक का उपयोग करने के लिए आवश्यक परिवर्तन का अनुमान है । ब्लीचिंग से बचने के लिए, जेड श्रृंखला पर कब्जा करने से पहले पूर्व इमेजिंग एआरएम जांच से बचना । ०.२५ µm के एक कदम आकार के साथ, जेड श्रृंखला आम तौर पर 25 से 30 कदम उंमुखीकरण और गुणसूत्रों के स्थान के आधार पर से लेकर । एक छोटे कदम का आकार दो मछली धब्बे अक्षीय आयाम में अलग कर रहे हैं कि क्या आकलन करने की क्षमता में सुधार कर सकते हैं, लेकिन छोटे कदम और ब्लीचिंग के कारण संकेत तीव्रता के नुकसान पर कब्जा करने के लिए आवश्यक समय के साथ एक व्यापार बंद है । 6X डिजिटल ज़ूम और एक १,०२४ x ५१२ छवि क्षेत्र के साथ एक 40X उद्देश्य ०.०५ µm के एक पिक्सेल आकार के साथ छवियों को उत्पंन करता है ।

7. छवि विश्लेषण और सामंजस्य दोषों के लिए स्कोरिंग

  1. Deconvolve Z श्रृंखला प्रत्येक oocyte19के लिए शोर अनुपात के लिए संकेत का अनुकूलन करने के लिए ।
    नोट: जैसे एक सॉफ्टवेयर पैकेज सामग्री तालिका में निर्दिष्ट एक के रूप में एक एकीकृत बहाली का उपयोग कर deconvolve करने के लिए अनुमति देता है, साथ ही फसल और इसके विपरीत-छवियों को बढ़ाने. महत्वपूर्ण बात, एक सॉफ्टवेयर पैकेज है कि एक छवियां और तीन आयामों में सामंजस्य दोषों के लिए स्कोर को देखने के लिए अनुमति देता है जरूरी है ।
  2. प्रत्येक oocyte के लिए, सारणीबद्ध और centromeric घावों की संख्या है कि DAPI संकेत के साथ colocalize । एक विशिष्ट जांच के लिए तीन या चार अलग और अलग संकेतों में सामंजस्य परिणाम की हानि । यह असामांय नहीं है कि एक पतली धागे से जुड़े रहे है दो घावों का निरीक्षण । सबसे कड़े मानदंडों के द्वारा, इन घावों को "अलग" नहीं माना जाएगा ।

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Representative Results

चित्रा 5 एक हाथ जांच के साथ प्राप्त छवियों को प्रस्तुत करता है कि कोशिकाविज्ञान क्षेत्र के लिए hybridizes एक्स गुणसूत्र पर 6E-7B । इस जांच में एक संकेत है कि DAPI के साथ सह-information, आसानी से पृष्ठभूमि से अलग है, और सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है के लिए अलग पादी में हाथ सामंजस्य दोष यों तो19। सामंजस्य दोषों का ठहराव prometaphase मैं और metaphase मैं चरणों के लिए प्रतिबंधित था; अंडाणुओं से पहले परमाणु लिफाफा टूटने से19विश्लेषण से बाहर रखा गया था । एक बरकरार परमाणु लिफाफा स्पष्ट है जब DAPI चैनल में स्कैनिंग क्योंकि oocyte गुणसूत्रों एक असतत परिपत्र क्षेत्र है कि आसपास के कोशिका की तुलना में गहरा है से घिरा हो जाएगा ।

चित्रा 5B deconvolution और इसके विपरीत वृद्धि के बाद व्यक्तिगत जेड श्रृंखला के अधिकतम तीव्रता अनुमानों से पता चलता है. सामंजस्य दोषों के ठहराव प्रत्येक जांच मछली संकेतों की संख्या के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है कि DAPI संकेत के साथ ओवरलैप । इस तरह के एक विश्लेषण के लिए, तीन आयामों में विलय छवियों के दृश्य आवश्यक है । केवल मछली स्पॉट है कि स्पष्ट रूप से सभी तीन आयामों में DAPI संकेत के साथ जुड़े रहे है विश्लेषण में शामिल किया जाना चाहिए ।

बरकरार बहन chromatid सामंजस्य दोनों बांह और pericentric जांच के लिए दो मछली स्पॉट के रूप में सबूत है (चित्रा 5B, छोड़ दिया) । या तो जांच के लिए तीन या चार अलग मछली स्थानों से युक्त अंडाणुओं सामंजस्य दोष (चित्रा 5B, सही) माना जाता है । व्यक्तिगत स्थानों के रूप में वर्गीकृत किया जा करने के लिए, दो मछली संकेतों ंयूनतम सबसे छोटी जगह के व्यास के लिए इसी से एक दूरी से सभी तीन आयामों में अलग किया जाना चाहिए । पतली बेहोश दो मछली धब्बे जोड़ने के धागे असामांय नहीं हैं । इस तरह के संकेतों को पूरी तरह से अलग नहीं माना जाता है और इसलिए सामंजस्य दोषों के उदाहरणों के रूप में गिना नहीं हैं ।

6E-7B बांह संकरण जांच के साथ, अंडाणुओं के लगभग 15-20% छवि पूरी तरह से संकेत का अभाव है या संकेत भी आत्मविश्वास से स्कोर कमजोर था । इसके अलावा, अंडाणुओं के लगभग 5% फैलाना गुणसूत्र संकेत के एक बड़े क्षेत्र का प्रदर्शन imaged और इन विश्लेषण से खारिज कर दिया गया । इसके विपरीत, यह अंडाणुओं जो के लिए pericentric संकरण संकेत याद आ रही थी या भी स्कोर को फैलाना था मुठभेड़ दुर्लभ था ।

6E-7B एआरएम जांच बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है prometaphase में हाथ सामंजस्य दोष यों तो और metaphase मैं अलग Drosophila19के अंडाणुओं पादी गिरफ्तार कर लिया । जब cohesin उपइकाई SMC3 नीचे मध्य दौर, परिपक्व अंडाणुओं के १६.३% के दौरान खटखटाया था दो हाथ स्थानों से अधिक समाहित विश्लेषण, हाथ सामंजस्य के समय से पहले नुकसान का संकेत है । इसके विपरीत, हम अंडाणुओं के केवल ५.१% है कि SMC319के सामांय स्तर निहित में अलग बांह स्थानों मनाया । दिलचस्प है, हालांकि हाथ सामंजस्य दोषों की आवृत्ति एकाधिक पछाड़ना पादी में ऊंचा था, बहन chromatids शायद ही कभी उनके pericentric क्षेत्रों में अलग थे19।

Figure 1
चित्रा 1: सामंजस्य के विस्तारित दौर मैं महिला अर्धसूत्रीविभाजन की गिरफ्तारी के दौरान उंर के आश्रित नुकसान गुणसूत्र अलगाव और अंडे में aneuploidy में त्रुटियों में परिणाम कर सकते हैं । सामंजस्य बहन chromatids के बीच काली पट्टियों का प्रतिनिधित्व करती है । एआरएम सामंजस्य कार्यों के लिए एक साथ संयोजक homologs पकड़ और anaphase मैं पर सटीक अलगाव के लिए आवश्यक है । यदि एआरएम सामंजस्य समय से पहले खो दिया है, गुणसूत्र पृथक्करण हो सकता है, एक aneuploid अंडे में जिसके परिणामस्वरूप । यह आंकड़ा संदर्भ19से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: बीएसी विखंडन और प्रवर्धन (बाएं) के बाद और तीन अलग BACs के लिए प्रतिबंध एंजाइम पाचन (दाएं) के बाद डीएनए अणुओं का आकार । ४०० परिवर्धित डीएनए उत्पादों के एनजी पहले तीन गलियों में दिखाए जाते हैं । पिछले तीन लेन रातोंरात प्रतिबंध डाइजेस्ट के बाद डीएनए टुकड़े दिखा । परिवर्धित डीएनए उत्पादों को २०० बीपी से लेकर 3 केबी तक है । प्रतिबंध डाइजेस्ट के बाद, अधिकांश अंशों १००-२०० bp से लेकर, लेकिन बड़ा अंश (५०० bp तक) दिखाई दे रहे थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: कोशिका उपकरण. प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरण: (1) संदंश की जोड़ी (#5 Dumont); (2) टंगस्टन सुई; (3) आवरण के साथ दीप अच्छी तरह से पकवान; (4) उथले कांच विदारक पकवान; (५) खींची पाश्चर पिपेट. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. व्यवस्था और रोलिंग अंडाणुओं के लिए स्लाइड की आवाजाही । (A) उस स्लाइड का आरेख जिसे प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में अंडाणुओं के रोलिंग के लिए सेट किया गया है । गहरा क्षेत्र स्लाइड के फ्रॉस्टेड ग्लास भाग का अर्थ है । (ख) oocyte रोलिंग के दौरान स्लाइड #2 के लिए आंदोलन वैक्टर की दिशा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. मछली परख परिणाम । (क) योजनाबद्ध रूप से Drosophila X गुणसूत्र को दर्शाया गया है और जहां दो भुजाओं की जांच (6 BACs प्रत्येक) और 22 oligonucleotide pericentromeric जांच प्रोटोकॉल संकरण में वर्णित है । सादगी के लिए, 6E-7B जांच 7B लेबल है और 2F-3 सी जांच 3 सी लेबल है । (ख) (6E-7B जांच) बरकरार बांह सामंजस्य के लिए (दो हाथ जांच स्पॉट, homolog प्रति एक) और बाधित बांह सामंजस्य (तीन से चार एआरएम जांच स्पॉट) के लिए मछली परिणामों के प्रतिनिधि छवियां । डीएनए नीला है, एआरएम जांच संकेत पीला है, और pericentric जांच संकेत लाल है । छवियां deconvolution और इसके विपरीत वृद्धि के बाद जेड श्रृंखला के अधिकतम तीव्रता अनुमानों के अनुरूप हैं । स्केल बार = 2 µm । यह आंकड़ा संदर्भ19से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

मछली जांच का उपयोग prometaphase में आर्म सामंजस्य की स्थिति का आकलन करने के लिए मैं और metaphase मैं Drosophila अंडाणुओं Drosophila अर्धसूत्रीविभाजन के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उन्नति है. ऐतिहासिक, Drosophila शोधकर्ताओं आनुवंशिक परीक्षणों के लिए सीमित किया गया है परिपक्व अंडाणुओं11,18,19में हाथ सामंजस्य के समय से पहले नुकसान का अनुमान । अब, यहां प्रस्तुत तरीकों के साथ, एआरएम सामंजस्य के राज्य सीधे मछली का उपयोग परख किया जा सकता है । हाथ सामंजस्य के समय से पहले नुकसान के लिए भौतिक सबूत प्राप्त करने की क्षमता बहुत से तंत्र है कि हाथ सामंजस्य और गुणसूत्र अलगाव की समय से पहले के नुकसान के लिए नेतृत्व का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध दृष्टिकोण की प्रदर्शनियों को विस्तृत करता है Drosophila अंडाणुओं में ।

महत्वपूर्ण कदम
हालांकि हम महत्वपूर्ण एक फ्लोरोसेंट जांच के सफल दृश्य के लिए आवश्यक मानकों का एक व्यवस्थित विश्लेषण किया है कि hybridizes के गुणसूत्र बांह के साथ परिपक्व Drosophila अंडाणुओं में एक प्रति दृश्यों के लिए, हम प्रस्ताव कारकों है कि इस तकनीक की सफलता के लिए योगदान दिया है मई के बाद की सूची । एआरएम जांच उत्पंन करने के लिए, हम छह अतिव्यापी बीएसी जांच का एक संयोजन है कि एक्सगुणसूत्र बांह पर लगभग ०.८ Mb के एक अंतराल को कवर किया करते थे । हमारे प्रारंभिक प्रयास कम BACs है कि एक छोटे क्षेत्र में फैले का उपयोग सफल नहीं थे । इसके अलावा, हम टुकड़ा और अंत Alexa-६४७ के साथ लेबलिंग से पहले बीएसी डीएनए बढ़ाना एक विधि का इस्तेमाल किया है । जो लेबल किए गए प्रतिबंध अंशों के बहुमत १००-२०० बीपी लंबे (चित्रा 2), जो १५० न्यूक्लियोटाइड के लक्ष्य आकार है कि मोटी ऊतकों के माध्यम से कुशल प्रसार के लिए आवश्यक है के साथ अच्छी तरह से सहमत है21। निर्धारण की स्थिति है कि बड़े Drosophila oocyte की आकृति विज्ञान की रक्षा, लेकिन यह भी जांच प्रवेश की अनुमति आवश्यक हैं । हम एक तय समाधान करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम कमरे के तापमान हेप् जोड़कर हमारे पहले से इस्तेमाल किया निर्धारण विधि23 संशोधित किया है । हमें लगता है कि यह संभव है कि दोनों हेप् के अलावा vitelline झिल्ली के माध्यम से पैठ बढ़ाने के लिए और साथ ही निर्धारण के लिए कम तापमान हाथ सामंजस्य के दृश्य के लिए सफल निर्धारण की स्थिति में योगदान दिया ।

जब सामंजस्य के समय से पहले नुकसान के लिए परख, एक एक नमूना आकार है कि दोष है कि कम से मध्यम स्तर पर मौजूद है की ठहराव की अनुमति देता है की आवश्यकता है । परिपक्व अंडाणुओं की बड़ी संख्या को प्राप्त करने के लिए, दूसरों के साथ संयुक्त वयस्क महिलाओं के ब्लेंडर व्यवधान का इस्तेमाल किया है 26,27sieving । यहाँ हम 20-25 महिलाओं से टुकड़े अंडाशय हाथ करने के लिए एक विधि का वर्णन, pipetting द्वारा देर स्टेज अंडाणुओं के मैनुअल जुदाई के साथ. जबकि ब्लेंडर/sieving विधि भी इस प्रोटोकॉल के साथ काम करना चाहिए, हाथ विच्छेदन का एक लाभ यह है कि sieving कदम के बिना, अंडाणुओं निर्धारण से पहले बफर में कम समय खर्च करते हैं, जो anaphase मैं कृत्रिम अंडे की वजह से शुरुआत की संभावना कम हो जाती है सक्रियण. इसके अलावा, इस पद्धति को शुरू करने के रूप में कम महिलाओं की आवश्यकता है सामग्री, रिएजेंट के छोटे संस्करणों का उपयोग करता है, और एक सरल कार्यप्रवाह है, जो सभी के प्रसंस्करण की सुविधा एकाधिक पादी ।

हाथ विच्छेदन और परिपक्व अंडाणुओं के मैनुअल जुदाई अंडाणुओं की पर्याप्त मात्रा में चोरियों के लिए "रोल" और vitelline झिल्ली हटाने और परिणाम संकरण बहाकर के अंत में लगभग ७५-१५० अंडाणुओं में प्रदान करता है । एक चाल metaphase मैं गिरफ्तार अंडाणुओं की उपज को अधिकतम करने के लिए विच्छेदन25से पहले पुरुषों के अभाव में खमीर शीशियों में कुंवारी महिलाओं को पकड़ है । चोरियों को दूर करने के लिए Oocyte रोलिंग और vitelline झिल्ली अंडाणुओं को नष्ट करने से बचने के लिए एक सौंय स्पर्श के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । हालांकि, अंडाणुओं के १००% से चोरियों और vitelline झिल्ली को हटाने एक यथार्थवादी लक्ष्य और अंडाणुओं के नुकसान में अत्यधिक रोलिंग केवल परिणाम नहीं है । इसलिए, प्रत्येक रोलिंग चक्र बंद कर दिया जाना चाहिए जब लगभग ७५-८५% अंडाणुओं कमी चोरियों और vitelline झिल्ली की ।

सीमाओं
पैदा करने में हमारी सफलता के बावजूद और हाथ जांच का उपयोग करने के लिए परिपक्व Drosophila अंडाणुओं में सामंजस्य के राज्य की निगरानी, प्रक्रिया अभी भी सीमाओं से ग्रस्त है । जब तक हम शायद ही कभी pericentromeric जांच के लिए एक संकेत का पता लगाने में विफल, एआरएम जांच संकेत कमजोर था या अनुपस्थित अंडाणुओं है कि हम छवि के लगभग 15-20% में । एक योगदान कारक बड़ा हाथ जांच बनाम pericentric oligonucleotide जांच (22-28 न्यूक्लियोटाइड) के अंतर प्रवेश हो सकता है (१००-२०० न्यूक्लियोटाइड) । इसके अलावा, बड़े दोहराव अनुक्रम एक संकेत है कि एआरएम जांच के लिए कि तुलना में उज्जवल है में pericentric जांच परिणामों द्वारा मांयता प्राप्त है । oocyte और oocyte के भीतर meiotic गुणसूत्रों के स्थान के उंमुखीकरण भी एक चुनौती पेश जब इमेजिंग । हालांकि meiotic गुणसूत्रों अपेक्षाकृत सेल प्रांतस्था के करीब हैं, यह oocyte के उंमुखीकरण पर नियंत्रण जब coverslip पर बढ़ते असंभव है । इसलिए, अंडाणुओं के कुछ अंश में, meiotic गुणसूत्रों coverslip से १००-२०० µm हो सकता है और संकेत तीव्रता और गुणवत्ता नकारात्मक प्रभाव हो सकता है जब oocyte के थोक के माध्यम से छवि की कोशिश कर रहा । इन सीमाओं का अर्थ है कि अंतिम मात्रात्मक विश्लेषण में शामिल अंडाणुओं की संख्या प्रोटोकॉल में संसाधित अंडाणुओं की संख्या से काफी कम है. १०० अंडाणुओं में एआरएम सामंजस्य के राज्य का निर्धारण सबसे अधिक संभावना दो स्वतंत्र तैयारी की आवश्यकता होगी । एक अतिरिक्त सीमित कारक सामंजस्य दोष को बढ़ाता है एक लेज़र का उपयोग करते हुए फोकल माइक्रोस्कोप स्कैनिंग एक ठेठ जेड श्रृंखला पर कब्जा करने के लिए आवश्यक समय है (लगभग 5 मिनट), यहां तक कि जब कब्जा कर लिया क्षेत्र १,०२४ x ५१२ पिक्सल तक ही सीमित है. इसका मतलब यह है कि नियंत्रण और प्रायोगिक पादी (१०० अंडाणुओं प्रत्येक) में सामंजस्य की तुलना छवि संग्रह समय के लगभग 16 ज जरूरत होगा ।

संशोधन और समस्या निवारण
हम कोशिकाविज्ञान स्थिति 6E-7B19में एक्स गुणसूत्र पहचानता है कि एक जांच का उपयोग कर एआरएम सामंजस्य की स्थिति पर नजर रखने में सक्षम है । ऐसी जांच जो X गुणसूत्र पर अधिक बाहर के स्थान पर hybridizes chiasma रखरखाव की विफलता का पता लगाने के लिए अधिक वांछनीय हो सकती है । इसके अतिरिक्त अन्य अनुसंधानकर्ता अन्य गुणसूत्रों पर बाँह सामंजस्य का विश्लेषण करना चाह सकते हैं. जब तक हम कुछ भी जांच करने का प्रयास नहीं किया है, प्रारंभिक डेटा संकेत मिलता है कि एक जांच है कि X गुणसूत्र के 2F-3 सी क्षेत्र को पहचानता है एक जासूसी संकेत में परिणाम है । हालांकि, सीमित प्रारंभिक डेटा के आधार पर, 2F-3 सी जांच के संकेत कम हो सकता है "कॉंपैक्ट" 6E-7B जांच के लिए । यद्यपि मछली के संकेत कुछ oocyte गुणसूत्रों के लिए चुस्त और कुरकुरे हैं, लेकिन अन्य अंडाणुओं के गुणसूत्रों पर संकरण संकेत काफी अधिक फैलाना है. क्या संकेत में ये अंतर दो कोशिकाविज्ञान स्थानों के बीच गुणसूत्र आकृति विज्ञान में वास्तविक अंतर को प्रतिबिंबित, दो जांच की संकरण दक्षता में परिवर्तनशीलता, या सिर्फ अलग अंडाणुओं के बीच stochastic परिवर्तनशीलता होगा अधिक गहन विश्लेषण की आवश्यकता है ।

महत्वपूर्ण बात, यहां तक कि 6E-7B जांच के लिए, हम कुछ अंडाणुओं में एक फैलाना गुणसूत्र संकेत मनाया, और यह अक्सर विश्लेषण से उनके अपवर्जन आवँयक है । इसके अलावा, हम 6E-7B जांच की विभिंन तैयारियों के बीच संकेत गुणवत्ता और चमक में भिंनता देखा है और यह आवश्यक है कि इमेजिंग मापदंडों तदनुसार समायोजित किया जाना है । ४२ ° c करने के लिए संकरण तापमान स्थापना फैलाना संकेत के साथ अंडाणुओं की संख्या को कम नहीं किया था, लेकिन यह pericentric oligonucleotide जांच के लिए संकेत बुरी तरह से प्रभावित किया था । एक बेहतर गुणसूत्र आकृति विज्ञान24संरक्षित करने के प्रयास में, हम भी एक कम तापमान (८० डिग्री सेल्सियस) पर अब विकार कदम की कोशिश की, लेकिन पाया कि इस उपचार न तो संकेत तीव्रता बढ़ गई और न ही प्रसार के साथ अंडाणुओं की संख्या कम गुणसूत्र फिश सिग्नल. हम भी कोशिकाविज्ञान क्षेत्र 5E-7B फैले एक लगभग १.५ Mb अंतराल के लिए संगत 12 अतिव्यापी BACs का उपयोग करके एक उज्जवल एआरएम संकेत प्राप्त करने का प्रयास किया । जब एक 12 बीएसी जांच का उपयोग कर, संकेत तीव्रता में भिंनता की डिग्री के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंडाणुओं कमी संकेत के प्रतिशत से अलग नहीं था जब छह BACs बांह जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया । यह भी सामंजस्य दोषों के लिए स्कोर करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण था जब 12 बीएसी जांच का उपयोग कर क्योंकि मछली संकेतों को बड़ा किया गया, यह और अधिक मुश्किल व्यक्तिगत chromatids के लिए इसी धब्बे को हल करने के लिए बना । मामलों में, जिसमें कोई संकेत एक नए तैयार जांच के साथ प्राप्त की है, शोधकर्ताओं के आकार की जांच करनी चाहिए परिवर्धित और प्रतिबंध पचा बीएसी डीएनए की पुष्टि करने के लिए कि अंत लेबलिंग के लिए इस्तेमाल टुकड़े १००-२०० बीपी रेंज के भीतर मुख्य रूप से कर रहे हैं । यह सफल जांच तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक होने की संभावना है ।

भविष्य के निर्देश
भविष्य के काम के लिए छवि अधिग्रहण बढ़ाने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटोकॉल अनुकूलन immunostaining शामिल करने के प्रमुख सुधार है कि अंय शोधकर्ताओं को लाभ होगा । छवि संग्रह के दौरान, अक्षीय आयाम में छवियों की एक बड़ी संख्या का संग्रह के रूप में अच्छी तरह के रूप में तेजी से छवि अधिग्रहण सामंजस्य दोषों को बढ़ाता के लिए लाभप्रद होगा । फोकल स्कैनिंग लेजर के लिए इमेजिंग मापदंडों के अनुकूलन में, हमने पाया कि ०.२५ µm सबसे छोटा कदम आकार है कि Z श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि मछली संकेतों के प्रशंसनीय ब्लीचिंग से बचने के लिए । हालांकि, के लिए मछली संकेतों कि से कम से अलग कर रहे है ०.२५ µm Z स्टैक में, इस चरण के आकार के बीच "स्थान" को कैप्चर करने के लिए विफलता में परिणाम हो सकता है और इसलिए सामंजस्य दोषों की संख्या मूल्यवान समझना हो सकता है । एक स्पिनिंग डिस्क फोकल की तेजी से छवि अधिग्रहण गति छोटे कदम आकार ब्लीचिंग संकेत के बिना इस्तेमाल किया जा करने की अनुमति हो सकती है । यह अक्षीय आयाम में और अधिक सटीक छवि पुनर्निर्माण प्रदान करेगा और साथ ही सामंजस्य दोषों के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए अंडाणुओं की बड़ी संख्या की अनुमति । इसके अलावा, हाथ सामंजस्य के राज्य के मछली दृश्य के साथ immunostaining गठबंधन करने की क्षमता काफी प्रोटोकॉल में वृद्धि होगी । तैयारी की एक संख्या के लिए, हम संकरण प्रक्रिया के बाद immunostaining धुरी प्रदर्शन करने की कोशिश की । हालांकि, मजबूत धुरी धुंधला अंडाणुओं के केवल एक छोटे से अंश में दिखाई दे रहा था । इसके अलावा, कारण है कि स्पष्ट नहीं कर रहे है के लिए, नकली मछली संकेतों के उच्च स्तर meiotic गुणसूत्रों घेर जब मछली और immunostaining संयुक्त थे । आगे के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए immunostaining या तो पहले या बाद में मछली प्रक्रिया बहुत इस तकनीक की क्षमता का विस्तार होगा अनुमति काम करते हैं ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम NIH ग्रांट GM59354 ने शेरोन ई. Bickel को सम्मानित कर समर्थन किया था. हम Huy Q. गुयेन फ्लोरोसेंट बांह जांच पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने में सहायता के लिए धंयवाद, फोकल माइक्रोस्कोप के साथ मदद के लिए एन Lavanway, और जे Emiliano रीड तकनीकी सहायता के लिए । हम भी Drosophila समुदाय में सहायक विचार विमर्श और सलाह के लिए कई सहयोगियों को धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kits
Midi Prep kit Qiagen 12143 Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit Sigma WGA2 Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit Invitrogen A21676 Label BAC clone DNA
PCR purification kit Qiagen 28104 Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher Scientific BP1600-100 Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chloride Fisher Scientific C75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfate Sigma D-8906
Drierite Drierite Company 23001
Dithiothreitol (DTT) Invitrogen 15508-013 Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl) Boehringer Mannheim 1277049 Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) Fisher Scientific S311-500 Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof) Decon Laboratories 2716
Tris (Ultra Pure) Invitrogen 15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) Sigma E-3889
16% formaldehyde Ted Pella, Inc. 18505 Toxic: wear appropriate protection
Formamide Invitrogen AM9342 Toxic: wear appropriate protection
Glucose Fisher Scientific D16-1
Glycogen Roche 901393
HEPES Boehringer Mannheim 737-151
Heptane Fisher Scientific H350-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acid Millipore HX0603-4 Toxic: wear appropriate protection.
Hydroxylamine Sigma 438227 Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chloride Sigma 104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2O Fisher Scientific S373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2O Fisher Scientific S369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml) Sigma P8920-100
Potassium acetate Fisher Scientific BP364-500
Sodium acetate Fisher Scientific S209-500 Prepare 3M stock
Sodium cacodylate Polysciences, Inc. 1131 Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrate Fisher Scientific BP327-1
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3 Sodium chloride
Sucrose Fisher Scientific S5-500
10% Tween 20 Thermo Scientific 28320 Surfact-Amps
10% Triton X-100 Thermo Scientific 28314 Surfact-Amps
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate) 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solution Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solution Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx 1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase) 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT 2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamide Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
AluI New England Biolabs R0137S
HaeIII New England Biolabs R0108S
MseI New England Biolabs R0525S
MspI New England Biolabs R0106S
RsaI New England Biolabs R0167S
BfuCI New England Biolabs R0636S
100X BSA New England Biolabs Comes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2 New England Biolabs Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl Roche/Sigma 3333566001
TdT buffer Roche/Sigma Comes with TdT enzyme
Cobalt chloride Roche/Sigma Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL) Thermo-Scientific EN0531
Name Company Catalog Number Comments
Cytology Tools etc.
Forceps Dumont #5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettes Fisher 13-678-20C Autoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dish Custom made
Deep well dish (3 wells) Pyrex 7223-34
Fisherfinest Premium microscope slides Fisher Scientific 22-038-104 Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mm VWR Scientific 48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick Thermo-Scientific 3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 Thermo-Scientific 3405
Tungsten needle homemade
Prolong GOLD mounting media Molecular Probes P36930
Compressed-air in can Various
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PCR machine Various
Nanodrop 2000, spectrophotometer Thermo-Scientific microvolume spectrophotometer
Vortexer Various
Table top microfuge at room temperature Various
Table top microfuge at 4 °C Various
Heat block Various
Hybridization oven or incubator with rotator Various
Nutator Various
A1RSi laser scanning confoal Nikon 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
Name Company Catalog Number Comments
Consumables etc.
50 mL conical tubes Various
15 mL conical tubes Various
1.5 mL microfuge tubes Various
500 µl microfuge tubes Various
200 µl PCR tubes Various
Plastic container with tight fitting lid Various To hold Drierite
Kimwipes Various disposable wipes
Parafilm Various paraffin film
Name Company Catalog Number Comments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides Integrated DNA Technologies Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer Version 6.3

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References

  1. Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
  2. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  3. Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
  4. Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
  6. Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
  7. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
  8. Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
  9. Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
  10. Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
  11. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
  12. Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
  13. Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
  14. Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
  15. Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
  16. Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genetics. 181, 1207-1218 (2009).
  17. Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
  18. Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
  19. Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
  20. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
  21. Dernburg, A. F., Sedat, J. W. Method Cell Biol. 53, Academic Press. 187-233 (1998).
  22. Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
  23. Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genetics. 203 (1), 173-189 (2016).
  24. Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
  25. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  26. Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
  27. Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).

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विकास जीव विज्ञान अंक १३० Drosophila अर्धसूत्रीविभाजन oocyte सिस्टर chromatid सामंजस्य एआरएम सामंजस्य प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (मछली)
सीटू संकरण (मछली) <em>में</em> प्रतिदीप्ति का प्रयोग करते हुए Prometaphase और Metaphase में आर्म सामंजस्य की स्थिति पर नजर रखने के लिए मैं <em>Drosophila</em> अंडाणुओं
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Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using… More

Perkins, A. T., Bickel, S. E. Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes. J. Vis. Exp. (130), e56802, doi:10.3791/56802 (2017).

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