Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

Summary

Rilevamento rapido e preciso di agenti patogeni in loco, soprattutto terricoli fitopatogeni, è fondamentale per impedire ulteriore produzione di inoculo e proliferazione di malattie delle piante in campo. Il metodo sviluppato qui utilizzando un sistema di rilevazione portatile in tempo reale di PCR consente la diagnosi in loco in condizioni di campo.

Abstract

In loco diagnosi delle malattie delle piante può essere un utile strumento per i coltivatori per decisioni tempestive che consente l’implementazione precedente di strategie di gestione di malattia che riducono l’impatto della malattia. Attualmente in molti laboratori diagnostici, la reazione a catena della polimerasi (PCR), in particolare Real-Time PCR, è considerato il più sensibile e preciso metodo per il rilevamento del patogeno di pianta. Tuttavia, basato su laboratorio PCRs in genere richiedono costosi laboratorio attrezzature e personale qualificato. In questo studio, patogeni terricoli di patate vengono utilizzati per illustrare il potenziale per rilevazione molecolare in loco. Questo è stato ottenuto utilizzando un protocollo semplice e rapido composto da estrazione di acidi nucleici magnetico della perlina-basato, PCR in tempo reale portatile (fluorogenic basata su probe assay). L’approccio PCR in tempo reale portatile rispetto favorevolmente con un sistema basato su laboratorio, rilevare da un minimo di 100 copie del DNA da Spongospora subterranea. Il metodo PCR in tempo reale portatile sviluppato qui può servire come un’alternativa ad approcci basati su laboratorio e un utile strumento in loco per la diagnosi del patogeno.

Introduction

Identificazione rapida e accurata di agenti patogeni causativi influisce notevolmente le decisioni per quanto riguarda la gestione della malattia di pianta. Malattie del suolo sono particolarmente difficili da diagnosticare perché l’ambiente di suolo è estremamente grande rispetto impianto di massa e complesso, rendendolo una sfida per capire tutti gli aspetti delle malattie del suolo. Inoltre, malattie del suolo possono essere senza sintomi durante le prime fasi di infezione, dipendente da fattori di stress ambientale, e alcuni hanno lunghi tempi di latenza che provocano le diagnosi in ritardo¹. Molti agenti patogeni terricoli hanno sviluppato strutture di sopravvivenza, come specializzate spore o IFE melanized, che possono sopravvivere nel terreno per molti anni anche in assenza dei loro ospiti. Gli approcci utilizzati per la gestione della malattia terricoli includono: evitando noti campi infestati, utilizzo di sementi certificate da organismi patogeni e piantine, mantenere attrezzature sanitarie e limitare il movimento del suolo e dell’acqua quando possibile. Conoscenza della presenza dell’agente patogeno attraverso strategie di rilevazione molecolare può anche svolgere un ruolo utile informando decisioni tempestive per quanto riguarda i trattamenti in fase iniziale o pre-impianto valutazioni dei campi. Test in loco fornisce ulteriori vantaggi di fornire un risultato rapido senza inviare il campione ad un laboratorio di diagnostico che forse qualche distanza distanza e anche possibile impegnarsi il coltivatore se è tale una diagnostica eseguita lato del campo in loro presenza.

Per la diagnosi in loco basata sulla rilevazione molecolare, sensibilità, specificità, robustezza (ripetibilità e riproducibilità) ed efficienza (cioè., semplicità e l’economicità) sono fattori cruciali per la considerazione. Laterale dispositivi di flusso (LFDs) come il Immunostrip e PocketDiagnostic, sono metodi popolari per rilevamento del patogeno in loco a causa della loro semplicità come un saggio di uno stadio. Tuttavia, LFDs non può essere lo strumento di diagnostica di destra in tutte le situazioni, perché manca la sensibilità e specificità e occasionalmente fornisce risultati ambigui se l’agente patogeno bersaglio e in basse concentrazioni possa cross-reagiscono con specie o generi simili ². amplificazione isotermica mediata da Loop (lampada) è anche applicabile per il rilevamento del patogeno in loco ed è particolarmente poco costoso a causa del basso costo reagenti, condizioni di reazione che rimangono costanti e semplice analisi colorimetrica visiva. Tuttavia, lampada e LFDs vengono in genere utilizzati qualitativamente, sebbene entrambi gli approcci possono essere utilizzati quantitativamente con più costose attrezzature³. La reazione a catena della polimerasi (PCR) offre alta specificità, alta sensibilità e una possibilità quantitative rispetto ai metodi di rilevazione di cui sopra. Tuttavia, la tecnologia PCR basati su laboratorio convenzionale richiede costosi laboratorio attrezzature e personale qualificato, che è dei principali svantaggi nell’adozione di questa tecnologia come metodo di rilevazione per scopi in loco.

In questo protocollo, è dimostrato un metodo diagnostico in loco utilizzando uno strumento portatile di PCR in tempo reale. Tecnologia PCR in tempo reale offre vantaggi rispetto ad altri metodi in termini di accuratezza quantitativa, sensibilità e versatilità ed è stato ampiamente utilizzata per la rilevazione di una vasta gamma di pianta patogeni^4,5, tra cui vari agenti patogeni della patata nel suolo⁶. A causa delle recenti tendenze del mercato competitivo, rapida crescita, attrezzature necessarie per la tecnologia PCR ha continuato a sviluppare per essere più compatto e meno costoso⁷. Il protocollo è composto come segue: estrazione dell’acido nucleico tallone-base magnetica, PCR in tempo reale portatile (fluorogenic basata su probe assay) e analisi quantitativa dei dati che può essere fatto in remoto utilizzando un computer portatile (Figura 1).

Utilizzando il protocollo PCR portatile sviluppato qui, campioni di terreno sono stati analizzati per rilevare l’agente patogeno terricoli, Spongospora subterranea. Spongospora è stato scelto in quanto è un agente patogeno importante patata come agente causale di scab farinosa⁸. Negli ultimi decenni, la presenza di questa malattia è considerata di avere diffuso in molte regioni dove le patate sono coltivate^9,10. Crosta è farinosa, attraverso la presenza di brufolo come lesioni sui tuberi possono causare perdite di resa qualitativa considerevole ai coltivatori di patate. Inoltre, S. subterranea può vector patata Mop Top Virus (PMTV), che può causare sintomi di lesione interna in tuberi (conosciuti come spraing)^11,12. Pertanto, è importante sapere se S. subterranea è presente nei campi prima della piantatura⁶. Inoltre dimostriamo l’utilità di questo protocollo per la rilevazione di Rhizoctonia solani anastomosi gruppo 3 (AG3) e PMTV. Anche se parecchi gruppi di anastomosi di Rhizoctonia solani causano malattie nelle patate, AG3 è senza dubbio il più importante in tutto il mondo¹³, causando cancro staminali e forfora nera con conseguente perdite di rendimento negoziabili fino al 30%¹⁴. PMTV provoca lesioni necrotiche all’interno i tuberi, che sono comunemente chiamati spraing. Questo virus recentemente è stato segnalato per la prima volta in diversi stati nel nord-ovest Pacifico^15,16,17ed è di crescente preoccupazione per i coltivatori in questa regione in crescita importante della patata. Oltre a determinare l’efficacia del portatile PCR per queste malattie importanti, DNA estrazione metodologia e terreno campione dimensione ottimale inoltre sono stati studiati in questo studio.

I risultati indicano che il metodo PCR portatile è versatile e applicabile per la rilevazione di diversi patogeni. Il metodo di rilevamento in loco che abbiamo sviluppato può consentire ai lavoratori di frontline in agricoltura (ad esempio, i coltivatori) per prendere decisioni precedenti per quanto riguarda la gestione della malattia, quali le selezioni di varietà o rotazioni e possibile quantificare un pianta patogeno nel campione durante un’indagine di campo, prima dell’impianto, per evitare potenziali focolai di malattia.

Protocol

1. in loco rilevazione molecolare degli agenti patogeni utilizzando un sistema di PCR in tempo reale portatile

Nota: Vedere la Figura 1.

1. Estrazione di DNA magnetico basato sul tallone
   Nota: Un branello-base DNA estrazione kit magnetico (ad es. da PCR) è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore. Tutti i reagenti devono essere conservati a temperatura ambiente (18-25 ° C). Una volta che il liofilizzato proteinasi K (bottiglia no. 1) è sospeso (con bottiglia no. 1a), conservare a-20 ° C.
   1. Mescolare 20-50 mg di campione di terreno con 500 µ l di soluzione di preparazione del campione in una microprovetta.
      Nota: Il rapporto del suolo: Prep soluzione è importante come mescolarli in altri rapporti può causare un errore di esperimenti a valle (ad es., contaminazione dagli inibitori della PCR).
   2. Macinare il suolo sul fondo del tubo con un piccolo pestello sterile fino a quando la soluzione è torbida. Ulteriormente sospendere particelle di suolo nella soluzione agitando i conetti e lasciar riposare, indisturbato, di lasciare il suolo particelle si depositano completamente (in genere tra 5-10 min).
   3. Trasferire 200 µ l del surnatante in una microprovetta fresca e aggiungere 200 µ l di tampone di lisi (bottiglia n ° 2: soluzione di cloridrato della guanidina) e 20 µ l di proteinasi K (bottiglia no. 1).
   4. Mescolare il lisato accuratamente capovolgendo la provetta e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
      Nota: Se il lisato viene trovato sul coperchio conetti, tocca il tubo o utilizzare una centrifuga, se disponibile per rimuovere il coperchio.
   5. Aggiungere 500 µ l di mix di perle buffer/magnetico l’associazione (bottiglia no. 3) al campione lisato. Miscelare bene pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti di distanza il portaprovette magnetico.
      Nota: Assicurarsi di mescolare la soluzione perlina bene prima dell’uso per garantire che le perle sono aliquotate in modo uniforme da bombola di stoccaggio.
   6. Posto nella microprovetta su portaprovette magnetico. Attendere almeno 2 min o fino a quando tutte le perline in provetta fissare alla parete lato magnetico. Quindi, rimuovere e scartare tutte del surnatante pipettando.
      Nota: Non disturbare le perline magnetizzate durante la rimozione e aspirare il supernatante. DNA in questo momento è stato catturato dai branelli magnetici.
   7. Togliere la provetta dal portaprovette magnetico, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio-1 (bottiglia n. 4: soluzione di sodio perclorato/etanolo) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Eseguire questo passaggio di lavaggio per rimuovere le proteine e sale dal campione. Lasciate il composto riposare per 30 s.
   8. Ripetere il punto 1.1.6.
   9. Togliere la provetta dal portaprovette magnetico, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio-2 (bottiglia n ° 5: soluzione di sodio perclorato/etanolo) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Lasciate il composto riposare per 30 s.
   10. Ripetere il punto 1.1.6.
   11. Rimuovere la microprovetta da portaprovette magnetico e quindi aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% (bottiglia no. 6).
       Nota: Questo passaggio è necessario per la rimozione di sali residui dal campione.
       1. Risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Lasciate che questo stand per 10 min con miscelazione occasionale di inversione.
   12. Ripetere il punto 1.1.6.
   13. Il pellet di biglie magnetiche per 10 min a temperatura ambiente con il coperchio di Conetti aperto asciugare all’aria.
       Nota: Le perle dovrebbero essere liberi da qualsiasi etanolo residuo visibile ma non completamente asciugato.
   14. Rimuovere la provetta dal portaprovette magnetico, 50-200 µ l di tampone di eluizione (bottiglia n. 7) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi e lasciar riposare per 30 s.
       Nota: Nei passaggi precedenti, il DNA purificato è rilasciato dai branelli magnetici il tampone di eluizione.
   15. Posto nella microprovetta su portaprovette magnetico. Attendere almeno 2 min o fino a quando tutte le perline in provetta fissare alla parete lato magnetico.
   16. Trasferire il surnatante che ora contiene il DNA/RNA purificato ad una microprovetta 0,5 mL per uso nelle fasi a valle.
2. PCR in tempo reale portatile
   Nota: Un termociclatore portatile e il kit di dosaggio PCR sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore (Vedi la Tabella materiali).
   1. Aprire ed eseguire il software thermocycler-collegato, selezionare test di rilevazione dei Target e tutte le informazioni di descrizione nei campi di immissione dati nome & dettagli, note, campioni e test di ingresso.
      Nota: Wells #1 e #2 sono designati con il software per il controllo negativo e positivo controllo, rispettivamente.
   2. Preparare prima i reagenti PCR dell’uso. Trasferire 500 µ l di buffer di risospensione di mix master nel mix master liofilizzato contenente di tubo e mescolare bene capovolgendo. Trasferire l’intero mix master in provetta marrone etichettato primer/sonda (tabella 2).
      1. Tappo e agitare la provetta per mescolare. Accurata miscelazione è necessario assicurarsi che tutti i componenti sono nuovamente sospeso completamente. Lasciate questo composto riposare per 5 minuti prima dell’uso.
         Nota: Conservare la miscela di reazione a-20 ° C dopo l’uso.
   3. Preparare un controllo negativo con il trasferimento di 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passaggio precedente in una provetta PCR 0,2 mL e aggiungere 10 µ l di acqua deionizzata sterile privo di nucleasi.
   4. Preparare un controllo positivo trasferendo 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passo 1.2.2 in una provetta PCR da 0,2 mL e aggiungere 10 µ l di modello di controllo positivo.
   5. Per ogni campione, trasferire 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passaggio precedente in una provetta PCR 0,2 mL e quindi aggiungere 10 µ l di DNA campione preparato dal passaggio 1.1.16.
   6. Caricare i pozzetti del termociclatore con il contenuto da loro rispettivi tubi PCR come descritto al punto 2.1.1.
   7. Una volta che tutte le informazioni necessarie sono state inserite e confermate, selezionare Start, Esegui e scegliere lo strumento collegato a ethernet o un drive USB.
      Nota: Se è selezionata l’opzione di unità USB, l’esecuzione file deve essere salvato sul disco per essere utilizzato con il termociclatore (ad esempio, F:\genesig). La corsa inizierà immediatamente dopo l’unità è inserita nel termociclatore.
3. Analisi dei dati del portatile PCR in tempo reale.
   1. Una volta terminata la corsa, aprire il file run (dongle) da unità USB utilizzando il software thermocycler-collegata o visualizzare direttamente i risultati di esecuzione del software facendo clic su risultati.
   2. Prima di analizzare i risultati, salvare la corsa completata per evitare di perdere dati.
   3. Nella scheda risultati , visualizzare lo stato dell’esecuzione, classificati da campioni.
      Nota: Dati che possono essere ottenuti in questa scheda sono lo stato di risultati e copiare il numero rilevato nel campione.
   4. Fare clic sulla scheda Dettagli per visualizzare le curve di amplificazione. Quando l’obiettivo viene rilevata correttamente, vengono visualizzati valori di Cq (ciclo di quantificazione) del bersaglio e del controllo interno.
      Nota: Questi valori sono calcolati nel rapporto finale e vengono utilizzati per determinare se un campione è positivo per la destinazione e se ci sono problemi con la reazione o i campioni di DNA.

2. altri protocolli

1. Metodi alternativi basati su laboratorio DNA estrazione
   1. Metodi basati CTAB-fenolo-cloroformio
      1. Eseguire metodi CTAB-fenolo-cloroformio basato, seguendo il metodo Doyle¹⁸ e la Dellaporta metodo¹⁹ come descritto in precedenza.
   2. Metodo di mini-preparazione DNA
      Nota: Il metodo Edwards²⁰ è stato effettuato come segue.
      1. Aggiungere 500 mg di terreno, seguito da 750 µ l di tampone di Edwards (200 millimetri Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) e cinque perle di ceramica di 1.4 mm per una microprovetta e mescolare bene.
      2. Incubare i conetti a 65 ° C per 5 min.
      3. Omogeneizzare il campione con un omogeneizzatore del battitore di tallone per 60 s (o utilizzando un mortaio e pestello).
      4. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 5 min.
      5. Trasferire 500 µ l del surnatante ad una microprovetta fresca e poi mescolare con 500 µ l di isopropanolo refrigerato. Mescolare capovolgendo la provetta 10 volte.
      6. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 15 min pelletizzare il DNA.
      7. Decantare il supernatante e lasciare che l’aria di pellet di DNA asciugare a temperatura ambiente fino a quando i rimanente etanolo evaporato.
      8. Lavare la pallina di DNA con 750 µ l di etanolo al 70% refrigerati.
      9. Il pellet asciugare all’aria prima di ri-sospendere in 50-100 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM EDTA).
   3. Altri metodi alternativi
      1. Eseguire l’estrazione di DNA di silice-base utilizzando kit #1 (MP BIO Fast Spin del DNA) e kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) secondo le istruzioni dei fabbricanti.
2. PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale.
   Nota: Un termociclatore convenzionale è stato utilizzato con mastermix per PCR basata su probe, vari primer e sonde del oligonucleotide (tabella 2).
   1. Usando la PCR a fondo non trasparente tubi o un piatto PCR, preparare 20 reazioni µ l per tutti i campioni di DNA da analizzare, così come un negativo di controllo (acqua deionizzata priva di nucleasi) e un controllo positivo modello preparate in casa.
   2. Per ogni PCR tubo o Beh, preparare una miscela tra cui 10 µ l del mastermix, 7 µ l di acqua deionizzata priva di nucleasi, 2 µ l di primer/sonda di 2 µM e 1 µ l di DNA campione (dal passaggio 1.1.16 o 2.1) o modello di controllo, per esempio.
   3. Chiudere le provette PCR o la piastra e iniziare la reazione selezionando il programma PCR appropriato.
3. Analisi dei dati di PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale
   1. Utilizzare software thermocycler-collegato per analizzare i risultati dal termociclatore convenzionali. Per iniziare l’analisi dei dati, è possibile trasferire il file eseguito dal termociclatore su un’unità USB, inserire un’unità USB e selezionare Export.
   2. Aprire il file di dati (.pcrd) dall’esportato esecuzione nel software thermocycler-collegata.
   3. Evidenziare il pozzo di un campione individuando la corrispondente bene sullo strumento. Curve di amplificazione e curve standard (se applicabile) sono generate automaticamente. Se non viene immesso le informazioni di esempio, fare clic su Installazione piastra o una funzione simile per iniziare i dati di input prima di analizzare i dati.
   4. Visualizzare i dati sulla scheda di quantificazione; Questo può essere esportato per l’analisi dei dati con un software di terze parti come i lettori di file CSV, XML o HTML.
   5. Ottenere dati Cq basati su determinate soglie e confrontarlo con i controlli positivi e negativi.
      Nota: Se gli standard di DNA dell’obiettivo sono stati utilizzati nel test, confrontare i dati di Cq di campione a quella delle norme per determinare il cut-off di Cq

Representative Results

Discussion

Come illustrato nella tabella 1, i recenti progressi tecnologici nell’identificazione molecolare di agenti patogeni hanno aumentato l’efficacia, precisione e velocità della diagnosi, che hanno contribuito alla rilevazione di infezioni pre-sintomatiche²⁷. Per quanto riguarda la diagnosi in loco, lampada e metodi di flusso laterale spesso vengono utilizzati perché sono portatili e fornire risultati immediati ad un costo inferiore. Tuttavia, nel caso di metodi sierologici, specie-rilevazione può essere difficile da raggiungere. In questo modo occasionalmente misdetection di microbi fuori bersaglio come abitanti di terreno comune. Ad esempio, ci possono essere cross-reattività tra i test sierologici di Phytophthora spp. e Pythium spp. nel caso di patate patogeni²⁸, che indica che ci sono a volte difficoltà rilevare la pianta mirata agenti patogeni.

Nello studio presente, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per il rilevamento in loco molecolare degli agenti patogeni terricoli patate utilizzando il sistema PCR in tempo reale portatile confrontando le sue capacità con quella di un convenzionale sistema PCR in tempo reale basato su lab. Abbiamo trovato che il metodo in loco rileva specificamente gli agenti patogeni della patata nel campione di terreno, anche se la sensibilità è ~ 10 volte inferiore a quello di un’analisi di laboratorio-basata equivalente. Vale anche la pena considerare che in questo caso i test di laboratorio e di campo non ha utilizzato un campione di biologicamente rilevanti dimensioni. Campioni di grandi dimensioni sono necessari per l’utilizzo in terreni campo di screening ordinariamente come descritto in precedenza^29,30, dove vengono elaborati dimensioni del campione di fra 250 g e 1 kg, anche se questi metodi richiedono operatori specializzati e sofisticati attrezzature per estrazione del DNA. In genere, un terreno su larga scala estrarre DNA è ripreso da un campione rappresentativo di singolo terreno di aggregazione dei numerosi sottocampioni da 1 a 4 ettari^6,29,30. Tuttavia, il protocollo sviluppato qui è veloce, facile da usare per gli utenti con nessuna esperienza precedente nella diagnostica molecolare e può essere utilizzato di fuori di un laboratorio. Come il metodo è rapido e relativamente economico rispetto ad estrazione dal suolo su larga scala, esso potrebbe essere usato per schermo molti su piccola scala campioni prelevati da un’area di campionamento simile a campioni globali su larga scala. Questo potrebbe superare alcune delle carenze di un campione di piccole dimensioni e determinare ulteriori informazioni sulla distribuzione spaziale del patogeno nel campo. Inoltre, la portabilità e la velocità del metodo significa che può anche essere utilizzato in attività di dimostrazione ai coltivatori per didattica e scopi di fidanzamento.

Un’altra considerazione è che molti Real-Time PCR sono già stati pubblicati per una vasta gamma di agenti patogeni di impianto⁵. Questo sistema può fare uso di queste analisi esistenti senza la necessità di progettare nuovi primer lampada per abilitare in test sul campo. Una critica frequente di lampada saggi è che possono essere difficili da progettare³¹. PCR portatile, pertanto, consente l’implementazione relativamente facile di una vasta gamma di test di agente patogeno prontamente disponibili per la prova in loco.

Metodi tradizionali possono essere spesso costosa, laboriosa, inesatti e che richiede tempo. La semplicità del metodo in loco che abbiamo sviluppato consente i coltivatori e lavoratori del settore per eseguire il rilevamento del patogeno da soli e forse generare un risultato molto più velocemente che l’invio ad un laboratorio di diagnostico che potrebbe essere una certa distanza. La prontezza e la sensibilità del metodo PCR portatile può aiutare i coltivatori a fine di evitare possibili infezioni secondarie, che possono ulteriormente aumentano della popolazione dell’agente patogeno e involontaria diffusione (tramite apparecchiature o esseri umani). In conclusione, il metodo in loco sviluppato nello studio presente consente il rilevamento preciso e relativamente sensibile di importanti patogeni terricoli nel settore. La nostra speranza è che il metodo in loco sviluppato in questo studio contribuirà a una pipeline di diagnostica corrente (Figura 6), non solo fornendo risposte rapide e precise alle domande epidemiologiche sulle malattie delle piante in campo, ma anche fornendo comprensione aumentata della biologia e l’epidemiologia dei patogeni vegetali.

Materials

White shell PCR plate	Bio-Rad	HSP9601
CFX Manager	Bio-Rad	1845000
SsoAdvanced Universal Probes Supermix 	Bio-Rad	1725280
CFX96 Touch qPCR instrument	Bio-Rad 	1855195
Ethylalcohol, pure 200 proof	Decon Laboratories	04-355-222
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Fisher BioReagents	BP118-500
Phenol, Saturated 	Fisher BioReagents	BP1750I-400
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Fisher BioReagents	BP152-5
q16 real-time PCR machine	genesig	MBS486001
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Invitrogen	15525-017
2-Propanol (Isopropanol)	JT Baker	67-63-0
Chloroform	JT Baker	9180-03
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl)	JT Baker	9535-03
iso-Amyl Alcohol	JT Baker	9038-01
FastDNA Spin kit 	MP Biomedicals	6560-200	Silica-based DNA extraction kit #1
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit	New England Biolabs	E3005S
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes	Phenix Research	MPC-100LP
Easy DNA/RNA Extraction Kit 	Primerdesign	genesigEASY-EK
genesig Easy 1.5 mL tubes	Primerdesign	genesigEASY-1.5
Magnetic tube rack	Primerdesign	genesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit	Primerdesign	Path-S.subterranea-EASY
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)	Sigma-Aldrich	H6269-100G
Pellet pestles	Thermo Fisher Scientific	12-141-364
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
DNA Miniprep kit 	ZymoBIOMICS	D4300	Silica-based DNA extraction kit #2