Articolo metodologico

Rilevamento in loco molecolare di fitopatogeni terricoli, utilizzando un sistema PCR in tempo reale portatile

DOI:

10.3791/56891

⸱

23 febbraio 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, Washington State University, 2Parma Research and Extension Center, University of Idaho

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rilevamento rapido e preciso di agenti patogeni in loco, soprattutto terricoli fitopatogeni, è fondamentale per impedire ulteriore produzione di inoculo e proliferazione di malattie delle piante in campo. Il metodo sviluppato qui utilizzando un sistema di rilevazione portatile in tempo reale di PCR consente la diagnosi in loco in condizioni di campo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In loco diagnosi delle malattie delle piante può essere un utile strumento per i coltivatori per decisioni tempestive che consente l'implementazione precedente di strategie di gestione di malattia che riducono l'impatto della malattia. Attualmente in molti laboratori diagnostici, la reazione a catena della polimerasi (PCR), in particolare Real-Time PCR, è considerato il più sensibile e preciso metodo per il rilevamento del patogeno di pianta. Tuttavia, basato su laboratorio PCRs in genere richiedono costosi laboratorio attrezzature e personale qualificato. In questo studio, patogeni terricoli di patate vengono utilizzati per illustrare il potenziale per rilevazione molecolare in loco. Questo è stato ottenuto utilizzando un protocollo semplice e rapido composto da estrazione di acidi nucleici magnetico della perlina-basato, PCR in tempo reale portatile (fluorogenic basata su probe assay). L'approccio PCR in tempo reale portatile rispetto favorevolmente con un sistema basato su laboratorio, rilevare da un minimo di 100 copie del DNA da Spongospora subterranea. Il metodo PCR in tempo reale portatile sviluppato qui può servire come un'alternativa ad approcci basati su laboratorio e un utile strumento in loco per la diagnosi del patogeno.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificazione rapida e accurata di agenti patogeni causativi influisce notevolmente le decisioni per quanto riguarda la gestione della malattia di pianta. Malattie del suolo sono particolarmente difficili da diagnosticare perché l'ambiente di suolo è estremamente grande rispetto impianto di massa e complesso, rendendolo una sfida per capire tutti gli aspetti delle malattie del suolo. Inoltre, malattie del suolo possono essere senza sintomi durante le prime fasi di infezione, dipendente da fattori di stress ambientale, e alcuni hanno lunghi tempi di latenza che provocano le diagnosi in ritardo1. Molti agenti patogeni terricoli hanno sviluppato strutture di sopravvivenza, come specializzate spore o IFE melanized, che possono sopravvivere nel terreno per molti anni anche in assenza dei loro ospiti. Gli approcci utilizzati per la gestione della malattia terricoli includono: evitando noti campi infestati, utilizzo di sementi certificate da organismi patogeni e piantine, mantenere attrezzature sanitarie e limitare il movimento del suolo e dell'acqua quando possibile. Conoscenza della presenza dell'agente patogeno attraverso strategie di rilevazione molecolare può anche svolgere un ruolo utile informando decisioni tempestive per quanto riguarda i trattamenti in fase iniziale o pre-impianto valutazioni dei campi. Test in loco fornisce ulteriori vantaggi di fornire un risultato rapido senza inviare il campione ad un laboratorio di diagnostico che forse qualche distanza distanza e anche possibile impegnarsi il coltivatore se è tale una diagnostica eseguita lato del campo in loro presenza.

Per la diagnosi in loco basata sulla rilevazione molecolare, sensibilità, specificità, robustezza (ripetibilità e riproducibilità) ed efficienza (cioè., semplicità e l'economicità) sono fattori cruciali per la considerazione. Laterale dispositivi di flusso (LFDs) come il Immunostrip e PocketDiagnostic, sono metodi popolari per rilevamento del patogeno in loco a causa della loro semplicità come un saggio di uno stadio. Tuttavia, LFDs non può essere lo strumento di diagnostica di destra in tutte le situazioni, perché manca la sensibilità e specificità e occasionalmente fornisce risultati ambigui se l'agente patogeno bersaglio e in basse concentrazioni possa cross-reagiscono con specie o generi simili 2. amplificazione isotermica mediata da Loop (lampada) è anche applicabile per il rilevamento del patogeno in loco ed è particolarmente poco costoso a causa del basso costo reagenti, condizioni di reazione che rimangono costanti e semplice analisi colorimetrica visiva. Tuttavia, lampada e LFDs vengono in genere utilizzati qualitativamente, sebbene entrambi gli approcci possono essere utilizzati quantitativamente con più costose attrezzature3. La reazione a catena della polimerasi (PCR) offre alta specificità, alta sensibilità e una possibilità quantitative rispetto ai metodi di rilevazione di cui sopra. Tuttavia, la tecnologia PCR basati su laboratorio convenzionale richiede costosi laboratorio attrezzature e personale qualificato, che è dei principali svantaggi nell'adozione di questa tecnologia come metodo di rilevazione per scopi in loco.

In questo protocollo, è dimostrato un metodo diagnostico in loco utilizzando uno strumento portatile di PCR in tempo reale. Tecnologia PCR in tempo reale offre vantaggi rispetto ad altri metodi in termini di accuratezza quantitativa, sensibilità e versatilità ed è stato ampiamente utilizzata per la rilevazione di una vasta gamma di pianta patogeni4,5, tra cui vari agenti patogeni della patata nel suolo6. A causa delle recenti tendenze del mercato competitivo, rapida crescita, attrezzature necessarie per la tecnologia PCR ha continuato a sviluppare per essere più compatto e meno costoso7. Il protocollo è composto come segue: estrazione dell'acido nucleico tallone-base magnetica, PCR in tempo reale portatile (fluorogenic basata su probe assay) e analisi quantitativa dei dati che può essere fatto in remoto utilizzando un computer portatile (Figura 1).

Utilizzando il protocollo PCR portatile sviluppato qui, campioni di terreno sono stati analizzati per rilevare l'agente patogeno terricoli, Spongospora subterranea. Spongospora è stato scelto in quanto è un agente patogeno importante patata come agente causale di scab farinosa8. Negli ultimi decenni, la presenza di questa malattia è considerata di avere diffuso in molte regioni dove le patate sono coltivate9,10. Crosta è farinosa, attraverso la presenza di brufolo come lesioni sui tuberi possono causare perdite di resa qualitativa considerevole ai coltivatori di patate. Inoltre, S. subterranea può vector patata Mop Top Virus (PMTV), che può causare sintomi di lesione interna in tuberi (conosciuti come spraing)11,12. Pertanto, è importante sapere se S. subterranea è presente nei campi prima della piantatura6. Inoltre dimostriamo l'utilità di questo protocollo per la rilevazione di Rhizoctonia solani anastomosi gruppo 3 (AG3) e PMTV. Anche se parecchi gruppi di anastomosi di Rhizoctonia solani causano malattie nelle patate, AG3 è senza dubbio il più importante in tutto il mondo13, causando cancro staminali e forfora nera con conseguente perdite di rendimento negoziabili fino al 30%14. PMTV provoca lesioni necrotiche all'interno i tuberi, che sono comunemente chiamati spraing. Questo virus recentemente è stato segnalato per la prima volta in diversi stati nel nord-ovest Pacifico15,16,17ed è di crescente preoccupazione per i coltivatori in questa regione in crescita importante della patata. Oltre a determinare l'efficacia del portatile PCR per queste malattie importanti, DNA estrazione metodologia e terreno campione dimensione ottimale inoltre sono stati studiati in questo studio.

I risultati indicano che il metodo PCR portatile è versatile e applicabile per la rilevazione di diversi patogeni. Il metodo di rilevamento in loco che abbiamo sviluppato può consentire ai lavoratori di frontline in agricoltura (ad esempio, i coltivatori) per prendere decisioni precedenti per quanto riguarda la gestione della malattia, quali le selezioni di varietà o rotazioni e possibile quantificare un pianta patogeno nel campione durante un'indagine di campo, prima dell'impianto, per evitare potenziali focolai di malattia.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. in loco rilevazione molecolare degli agenti patogeni utilizzando un sistema di PCR in tempo reale portatile

Nota: Vedere la Figura 1.

  1. Estrazione di DNA magnetico basato sul tallone
    Nota: Un branello-base DNA estrazione kit magnetico (ad es. da PCR) è stato utilizzato secondo le istruzioni del produttore. Tutti i reagenti devono essere conservati a temperatura ambiente (18-25 ° C). Una volta che il liofilizzato proteinasi K (bottiglia no. 1) è sospeso (con bottiglia no. 1a), conservare a-20 ° C.
    1. Mescolare 20-50 mg di campione di terreno con 500 µ l di soluzione di preparazione del campione in una microprovetta.
      Nota: Il rapporto del suolo: Prep soluzione è importante come mescolarli in altri rapporti può causare un errore di esperimenti a valle (ad es., contaminazione dagli inibitori della PCR).
    2. Macinare il suolo sul fondo del tubo con un piccolo pestello sterile fino a quando la soluzione è torbida. Ulteriormente sospendere particelle di suolo nella soluzione agitando i conetti e lasciar riposare, indisturbato, di lasciare il suolo particelle si depositano completamente (in genere tra 5-10 min).
    3. Trasferire 200 µ l del surnatante in una microprovetta fresca e aggiungere 200 µ l di tampone di lisi (bottiglia n ° 2: soluzione di cloridrato della guanidina) e 20 µ l di proteinasi K (bottiglia no. 1).
    4. Mescolare il lisato accuratamente capovolgendo la provetta e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
      Nota: Se il lisato viene trovato sul coperchio conetti, tocca il tubo o utilizzare una centrifuga, se disponibile per rimuovere il coperchio.
    5. Aggiungere 500 µ l di mix di perle buffer/magnetico l'associazione (bottiglia no. 3) al campione lisato. Miscelare bene pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti di distanza il portaprovette magnetico.
      Nota: Assicurarsi di mescolare la soluzione perlina bene prima dell'uso per garantire che le perle sono aliquotate in modo uniforme da bombola di stoccaggio.
    6. Posto nella microprovetta su portaprovette magnetico. Attendere almeno 2 min o fino a quando tutte le perline in provetta fissare alla parete lato magnetico. Quindi, rimuovere e scartare tutte del surnatante pipettando.
      Nota: Non disturbare le perline magnetizzate durante la rimozione e aspirare il supernatante. DNA in questo momento è stato catturato dai branelli magnetici.
    7. Togliere la provetta dal portaprovette magnetico, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio-1 (bottiglia n. 4: soluzione di sodio perclorato/etanolo) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Eseguire questo passaggio di lavaggio per rimuovere le proteine e sale dal campione. Lasciate il composto riposare per 30 s.
    8. Ripetere il punto 1.1.6.
    9. Togliere la provetta dal portaprovette magnetico, aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio-2 (bottiglia n ° 5: soluzione di sodio perclorato/etanolo) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Lasciate il composto riposare per 30 s.
    10. Ripetere il punto 1.1.6.
    11. Rimuovere la microprovetta da portaprovette magnetico e quindi aggiungere 500 µ l di etanolo di 80% (bottiglia no. 6).
      Nota: Questo passaggio è necessario per la rimozione di sali residui dal campione.
      1. Risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi. Lasciate che questo stand per 10 min con miscelazione occasionale di inversione.
    12. Ripetere il punto 1.1.6.
    13. Il pellet di biglie magnetiche per 10 min a temperatura ambiente con il coperchio di Conetti aperto asciugare all'aria.
      Nota: Le perle dovrebbero essere liberi da qualsiasi etanolo residuo visibile ma non completamente asciugato.
    14. Rimuovere la provetta dal portaprovette magnetico, 50-200 µ l di tampone di eluizione (bottiglia n. 7) e risospendere le perline pipettando ripetute fino a quando le perline sono uniformemente dispersi e lasciar riposare per 30 s.
      Nota: Nei passaggi precedenti, il DNA purificato è rilasciato dai branelli magnetici il tampone di eluizione.
    15. Posto nella microprovetta su portaprovette magnetico. Attendere almeno 2 min o fino a quando tutte le perline in provetta fissare alla parete lato magnetico.
    16. Trasferire il surnatante che ora contiene il DNA/RNA purificato ad una microprovetta 0,5 mL per uso nelle fasi a valle.
  2. PCR in tempo reale portatile
    Nota: Un termociclatore portatile e il kit di dosaggio PCR sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore (Vedi la Tabella materiali).
    1. Aprire ed eseguire il software thermocycler-collegato, selezionare test di rilevazione dei Target e tutte le informazioni di descrizione nei campi di immissione dati nome & dettagli, note, campioni e test di ingresso.
      Nota: Wells #1 e #2 sono designati con il software per il controllo negativo e positivo controllo, rispettivamente.
    2. Preparare prima i reagenti PCR dell'uso. Trasferire 500 µ l di buffer di risospensione di mix master nel mix master liofilizzato contenente di tubo e mescolare bene capovolgendo. Trasferire l'intero mix master in provetta marrone etichettato primer/sonda (tabella 2).
      1. Tappo e agitare la provetta per mescolare. Accurata miscelazione è necessario assicurarsi che tutti i componenti sono nuovamente sospeso completamente. Lasciate questo composto riposare per 5 minuti prima dell'uso.
        Nota: Conservare la miscela di reazione a-20 ° C dopo l'uso.
    3. Preparare un controllo negativo con il trasferimento di 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passaggio precedente in una provetta PCR 0,2 mL e aggiungere 10 µ l di acqua deionizzata sterile privo di nucleasi.
    4. Preparare un controllo positivo trasferendo 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passo 1.2.2 in una provetta PCR da 0,2 mL e aggiungere 10 µ l di modello di controllo positivo.
    5. Per ogni campione, trasferire 10 µ l della miscela di reazione preparato dal passaggio precedente in una provetta PCR 0,2 mL e quindi aggiungere 10 µ l di DNA campione preparato dal passaggio 1.1.16.
    6. Caricare i pozzetti del termociclatore con il contenuto da loro rispettivi tubi PCR come descritto al punto 2.1.1.
    7. Una volta che tutte le informazioni necessarie sono state inserite e confermate, selezionare Start, Esegui e scegliere lo strumento collegato a ethernet o un drive USB.
      Nota: Se è selezionata l'opzione di unità USB, l'esecuzione file deve essere salvato sul disco per essere utilizzato con il termociclatore (ad esempio, F:\genesig). La corsa inizierà immediatamente dopo l'unità è inserita nel termociclatore.
  3. Analisi dei dati del portatile PCR in tempo reale.
    1. Una volta terminata la corsa, aprire il file run (dongle) da unità USB utilizzando il software thermocycler-collegata o visualizzare direttamente i risultati di esecuzione del software facendo clic su risultati.
    2. Prima di analizzare i risultati, salvare la corsa completata per evitare di perdere dati.
    3. Nella scheda risultati , visualizzare lo stato dell'esecuzione, classificati da campioni.
      Nota: Dati che possono essere ottenuti in questa scheda sono lo stato di risultati e copiare il numero rilevato nel campione.
    4. Fare clic sulla scheda Dettagli per visualizzare le curve di amplificazione. Quando l'obiettivo viene rilevata correttamente, vengono visualizzati valori di Cq (ciclo di quantificazione) del bersaglio e del controllo interno.
      Nota: Questi valori sono calcolati nel rapporto finale e vengono utilizzati per determinare se un campione è positivo per la destinazione e se ci sono problemi con la reazione o i campioni di DNA.

2. altri protocolli

  1. Metodi alternativi basati su laboratorio DNA estrazione
    1. Metodi basati CTAB-fenolo-cloroformio
      1. Eseguire metodi CTAB-fenolo-cloroformio basato, seguendo il metodo Doyle18 e la Dellaporta metodo19 come descritto in precedenza.
    2. Metodo di mini-preparazione DNA
      Nota: Il metodo Edwards20 è stato effettuato come segue.
      1. Aggiungere 500 mg di terreno, seguito da 750 µ l di tampone di Edwards (200 millimetri Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) e cinque perle di ceramica di 1.4 mm per una microprovetta e mescolare bene.
      2. Incubare i conetti a 65 ° C per 5 min.
      3. Omogeneizzare il campione con un omogeneizzatore del battitore di tallone per 60 s (o utilizzando un mortaio e pestello).
      4. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 5 min.
      5. Trasferire 500 µ l del surnatante ad una microprovetta fresca e poi mescolare con 500 µ l di isopropanolo refrigerato. Mescolare capovolgendo la provetta 10 volte.
      6. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 15 min pelletizzare il DNA.
      7. Decantare il supernatante e lasciare che l'aria di pellet di DNA asciugare a temperatura ambiente fino a quando i rimanente etanolo evaporato.
      8. Lavare la pallina di DNA con 750 µ l di etanolo al 70% refrigerati.
      9. Il pellet asciugare all'aria prima di ri-sospendere in 50-100 µ l di buffer di TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 e 1 mM EDTA).
    3. Altri metodi alternativi
      1. Eseguire l'estrazione di DNA di silice-base utilizzando kit #1 (MP BIO Fast Spin del DNA) e kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) secondo le istruzioni dei fabbricanti.
  2. PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale.
    Nota: Un termociclatore convenzionale è stato utilizzato con mastermix per PCR basata su probe, vari primer e sonde del oligonucleotide (tabella 2).
    1. Usando la PCR a fondo non trasparente tubi o un piatto PCR, preparare 20 reazioni µ l per tutti i campioni di DNA da analizzare, così come un negativo di controllo (acqua deionizzata priva di nucleasi) e un controllo positivo modello preparate in casa.
    2. Per ogni PCR tubo o Beh, preparare una miscela tra cui 10 µ l del mastermix, 7 µ l di acqua deionizzata priva di nucleasi, 2 µ l di primer/sonda di 2 µM e 1 µ l di DNA campione (dal passaggio 1.1.16 o 2.1) o modello di controllo, per esempio.
    3. Chiudere le provette PCR o la piastra e iniziare la reazione selezionando il programma PCR appropriato.
  3. Analisi dei dati di PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale
    1. Utilizzare software thermocycler-collegato per analizzare i risultati dal termociclatore convenzionali. Per iniziare l'analisi dei dati, è possibile trasferire il file eseguito dal termociclatore su un'unità USB, inserire un'unità USB e selezionare Export.
    2. Aprire il file di dati (.pcrd) dall'esportato esecuzione nel software thermocycler-collegata.
    3. Evidenziare il pozzo di un campione individuando la corrispondente bene sullo strumento. Curve di amplificazione e curve standard (se applicabile) sono generate automaticamente. Se non viene immesso le informazioni di esempio, fare clic su Installazione piastra o una funzione simile per iniziare i dati di input prima di analizzare i dati.
    4. Visualizzare i dati sulla scheda di quantificazione; Questo può essere esportato per l'analisi dei dati con un software di terze parti come i lettori di file CSV, XML o HTML.
    5. Ottenere dati Cq basati su determinate soglie e confrontarlo con i controlli positivi e negativi.
      Nota: Se gli standard di DNA dell'obiettivo sono stati utilizzati nel test, confrontare i dati di Cq di campione a quella delle norme per determinare il cut-off di Cq

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confronto tra metodi di estrazione del DNA

Rilevando la quantità di DNA S. subterranea in un campione di terreno da campi infestati con l'agente patogeno è stata valutata la compatibilità di un metodo di estrazione del DNA basato su tallone magnetico con PCR in tempo reale. Come mostrato in supplementare nella figura 1, il metodo magnetico basato su tallone è stato confrontato con altri metodi compresi un CTAB-fenolo-cloroformio basato su metodo18, rapido DNA mini-preparazione metodi19,20e altri standard a base di silice le kit di estrazione del DNA. Campioni di DNA estratti utilizzando i sei diversi metodi sono stati sottoposti a PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale. I risultati hanno indicato che il metodo basato su tallone magnetico è paragonabile con altri metodi, anche se a base di silice kit di estrazione del DNA ha mostrato la migliore performance tra i metodi che abbiamo testato. Tutti i kit contengono tiocianato di guanidinium o cloridrato di guanidinium: entrambi sono agenti caotropici potente, che denaturano la maggior parte delle proteine cellulari compreso RNAsi e dnasi. Pertanto, utilizzando i metodi è adatto per le estrazioni di DNA e di RNA.

Confronto tra un portatile PCR in tempo reale e una PCR in tempo reale basati su laboratorio convenzionale

Per confrontare la sensibilità e la specificità di una PCR portatile per una PCR convenzionale di lab-basata, quantificazione assoluta dell'agente patogeno che DNA è stato effettuato usando diverse quantità del gene S. subterranea ITS, che è stato trasportato dal vettore pGEM-T21 . Una serie di diluizioni di 10 volte del gene di ITS (106 a 100 copie) sono stati analizzati utilizzando il set di primer/sonda SsTQ22. I risultati hanno dimostrato che il metodo PCR portatile rilevato l'agente patogeno bersaglio del DNA (~ 100 copie), anche se la sensibilità era 10 volte inferiore a quello che del metodo PCR basati su laboratorio convenzionale, che rilevato almeno 10 copie (Figura 2).

Per ulteriore convalida, terreni artificialmente infestati sono stati testati. Sporosori subterranea S. sono stati ottenuti da Galle di radice polvere scab dalle radici della patata. I terreni erano infestati di sospensioni sporosori ad una concentrazione finale di 105 sporosori/g di peso secco del terreno. Utilizzando il metodo magnetico basato su tallone, DNA è stato Estratto da campioni del terreno infestato, e 10 volte diluizioni seriali sono stati preparati per ottenere concentrazioni equivalenti a 105, 104, 103, 102, 101e 100 sporosori/g di peso del suolo secco. I campioni di DNA sono stati utilizzati per PCR usando il set di primer/sonda SPO23. I risultati hanno mostrato che il metodo PCR portatile ha capacità analitiche paragonabile a un metodo PCR convenzionale basato su laboratorio ma, ancora una volta, la sensibilità è stata ridotta di un fattore pari a ~ 10 (Figura 3).

Infine, abbiamo testato un campione di terreno da un campo che è stato naturalmente contaminato con S. subterranea. L'estrazione di DNA basato su tallone magnetica è stata effettuata su diverse quantità di terreni (10, 20, 50 e 100 mg di terreno a 500 µ l di soluzione tampone di estrazione). I risultati hanno indicato che il peso ottimale del suolo come materiale di partenza per l'estrazione di DNA era di 50-100 mg (Figura 4). Quantità di terreno di fuori della gamma ha provocato un errore dei passi PCR a valle. Questo effetto potrebbe essere perché quando una quantità eccessiva di terreno vengono utilizzata come materiale di partenza, contaminazioni (ad esempio, i composti fenolici) possono interferire con la PCR24. Nel caso di volumi inferiori del suolo, la quantità di DNA estratto può essere inferiore al limite di rilevazione di PCR (ad esempio, il rendimento totale è stato variato il DNA estratto dal suolo di 10-20 mg). La sensibilità era abbastanza paragonabile tra la PCR portatile e convenzionali metodi di PCR. Risultati simili sono stati ottenuti in campioni di DNA dai metodi differenti dell'estrazione (Supplemental figura 2)

Rilevamento di altri agenti patogeni dal sistema di rilevamento in loco usando una PCR in tempo reale portatile

Abbiamo testato il metodo PCR portatile per rilevare altri agenti patogeni importanti patata terricoli, r. solani AG3 e PMTV. In questo studio, abbiamo effettuato la PCR in tempo reale utilizzando la sonda primer/RQP1 set25 RsTq r. solani AG3 rilevazione con DNA da coltura pura. Abbiamo anche effettuato in tempo reale PCR utilizzando PMTV-D primer/sonda set26 rilevazione PMTV con RNA da un campione di tubero sintomatico spraing è stato usato. Come illustrato nella Figura 5, il metodo PCR portatile rilevato con successo entrambi gli agenti patogeni. I risultati erano comparabili fra gli strumenti portatili e convenzionali, suggerendo che il portatile metodo PCR è versatile e applicabile ad altri rilevamenti di agente patogeno se le sequenze dell'iniettore progettate per PCR in tempo reale sono disponibili.

figure-results-1
Figura 1. Procedura di un sistema PCR in tempo reale portatile per rilevamento del patogeno in loco. Il protocollo è composto da passaggi nell'ordine seguente: preparazione del lysate di omogeneizzazione breve (A), estrazione di acidi nucleici magnetico della perlina-base (B), PCR in tempo reale portatile (C) e analisi quantitativa dei dati utilizzando un computer portatile (D). Si noti che tutti i passaggi possono essere completati in loco.

figure-results-2
Figura 2 . Confronto della sensibilità tra un portatile PCR e una PCR convenzionale basato su lab. Quantificazione dell'agente patogeno del DNA è stata effettuata usando diverse quantità del gene di ITS S. subterranea (106 a 100 copie) con la SsTQ primer/sonda impostata. Regressione lineare tra il valore di registro di DNA del plasmide S. subterranea e valore reciproco di Log di Cq sul termociclatore convenzionale (A) e il termociclatore portatile (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3 . Confronto delle prestazioni di rilevamento in terreni artificialmente infestati con subterranea di S.. I terreni erano artificialmente infestati (105 a0 sporosori/10g peso del suolo secco) con S. subterranea sporosori sospensioni. Utilizzando il metodo magnetico basato su tallone, il DNA è stato Estratto da campioni del terreno infestato. PCRs sono stati eseguiti utilizzando i campioni del terreno con il set di primer/sonda SPO. Regressione lineare tra il valore di registro della quantità iniziale in sporosori per grammo di terreno e il valore di registro reciproco di Cq sul termociclatore convenzionale (A) e il termociclatore portatile (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4 . Confronto di avviamento quantità di campioni di suolo per estrazione del DNA. Il metodo basato su tallone magnetico è stato utilizzato per l'estrazione di DNA da 10, 20, 50 e 100 mg di campioni di terreno. PCR in tempo reale sono stati eseguiti utilizzando il termociclatore portatile. Le curve standard rappresentano il rapporto tra la quantità di DNA totale Estratto da campioni di suolo (asse x) e le quantità di prodotto di PCR (asse y) amplificate dal set di primer/sonda Sss. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5 . Rilevamento di altri agenti patogeni della patata, r. solani e PMTV. PCR in tempo reale sono stati eseguiti utilizzando il termociclatore portatile e il termociclatore convenzionali. R. solani AG3 è stata rilevata in DNA totale Estratto da coltura pura mediante RsTq primer e la sonda di RQP1 (A) PMTV è stato rilevato in RNA totale Estratto da un campione di tubero PMTV-infettato tramite che il primer PMTV-D/sonda impostata (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6 . Una pipeline di diagnostica per fitopatogeni. Diagramma di flusso Mostra un flusso di lavoro generale per la diagnosi di phytopathogen. Si noti che il passo tradizionale, ad esempio, identificazione visiva, può essere omesso se è utilizzata in loco rilevazione molecolare, che rende l'intero processo di diagnosi semplice e veloce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

PCR in tempo reale portatilePCR in tempo realeLAMPADAELISAFlusso laterale
Costo per reazione target$0,60-$8,47$0,60$0,75$0,60$4,74
Sensibilità100 copie10 copie10 copie1-10 sporosori33
1-10 ng/mL (proteina)33 		1-10 sporosori34
5 x 105CFU/mL35
Spesa di tempo90 minuti80-240 minuti50-90 minuti32 3-24 ore10-15 minuti
Preparazione necessariaEstrazione acido ●Nucleic
Disegno dell'iniettore di ●		Estrazione acido ●Nucleic
Disegno di Primer/sonda ●		Estrazione di acido nucleico ●
Disegno dell'iniettore di ●		Estrazione di proteine ●
● gli anticorpi		N/A
Altri materiali richiesti● thermocycler portatile● thermocycler convenzionaleMacchia di Colormetric ●
● Incubatore		Lettore di piastre ●
Attrezzatura di lavaggio del ●		N/A

Tabella 1. Tabella comparativa dei metodi di rilevazione sierologica e molecolare per fitopatogeni

PrimerSequenza (5 '-3 ')un Obiettivob
SsTQ-F13 CCGGCAGACCCAAAACCITS1-ITS2 in S. subterranea
SsTQ-R13 CGGGCGTCACCCTTCAITS1-ITS2 in S. subterranea
SsTQ-P13 [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM]ITS1-ITS2 in S. subterranea
Genesig S.subterranea primer/sondaN/AActina in S. subterranea
SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGAITS a S. subterranea
SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGAITS a S. subterranea
SPOPRO114 [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM]ITS a S. subterranea
RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTTITS1-ITS2 in r. solani
RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTTITS1-ITS2 in r. solani
RQP119 [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM]ITS1-ITS2 in r. solani
Genesig PMTV primer/sondaN/ACP-RT in PMTV
PMTV-D-F20 AGAATTGRCATCGAAACAGCACP in PMTV
PMTV-D-R20 GTCGCGCTCCAATTTCGTTCP in PMTV
PMTV-D-P20 [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM]CP in PMTV
un Primer oligo DNA sono stati modificati con FAM (6-carboxyfluorescein) o TAM (5-carboxytetramethylrhodamine)
b ITS: Interni trascritti distanziali, CP: cappotto della proteina; CP-RT: cappotto della proteina readthrough

Tabella 2. Primer usati in questo studio

Complementare figura 1. Confronto tra i metodi di estrazione del DNA per il rilevamento del patogeno farinosa scab. Sei diversi metodi di estrazione del DNA (A-F) sono stati confrontati per la rilevazione dell'agente patogeno farinosa scab, S. subterranea nei campioni di terreno. (B, D, F). DNA è stato estratto utilizzando a base di silice kit #1 (Vedi la tabella materiali per tutti i nomi di kit), a base di silice kit #2 e magnetico kit basati su tallone, repsectively. PCR è stata effettuata utilizzando le convenzionali basati su laboratorio PCR termociclatore. Le curve standard rappresentano il rapporto tra la quantità di DNA totale estratto dai campioni del terreno e la quantità del prodotto PCR amplificato dal set di primer/sonda SsTQ. Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare nella figura 2. Confronto tra il limite di rilevamento tra un portatile PCR e una PCR convenzionale basato su lab. DNA totale è stato isolato da un campione di terreno utilizzando tre metodi di estrazione differenti: (metodo A, B) Doyle, (C, D) a base di silice kit #2 e (E, F) il kit magnetico basato sul tallone. Grafici riportati a sinistra dati utilizza il termociclatore portatile con il set di primer/sonda Sss, mentre i grafici sulla destra rappresentano dati generati utilizzando il termociclatore convenzionali basate su laboratori con la SsTQ primer/sonda impostata. Per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Come illustrato nella tabella 1, i recenti progressi tecnologici nell'identificazione molecolare di agenti patogeni hanno aumentato l'efficacia, precisione e velocità della diagnosi, che hanno contribuito alla rilevazione di infezioni pre-sintomatiche27. Per quanto riguarda la diagnosi in loco, lampada e metodi di flusso laterale spesso vengono utilizzati perché sono portatili e fornire risultati immediati ad un costo inferiore. Tuttavia, nel caso di metodi sierologici, specie-rilevazione può essere difficile da raggiungere. In questo modo occasionalmente misdetection di microbi fuori bersaglio come abitanti di terreno comune. Ad esempio, ci possono essere cross-reattività tra i test sierologici di Phytophthora spp. e Pythium spp. nel caso di patate patogeni28, che indica che ci sono a volte difficoltà rilevare la pianta mirata agenti patogeni.

Nello studio presente, abbiamo sviluppato un protocollo ottimizzato per il rilevamento in loco molecolare degli agenti patogeni terricoli patate utilizzando il sistema PCR in tempo reale portatile confrontando le sue capacità con quella di un convenzionale sistema PCR in tempo reale basato su lab. Abbiamo trovato che il metodo in loco rileva specificamente gli agenti patogeni della patata nel campione di terreno, anche se la sensibilità è ~ 10 volte inferiore a quello di un'analisi di laboratorio-basata equivalente. Vale anche la pena considerare che in questo caso i test di laboratorio e di campo non ha utilizzato un campione di biologicamente rilevanti dimensioni. Campioni di grandi dimensioni sono necessari per l'utilizzo in terreni campo di screening ordinariamente come descritto in precedenza29,30, dove vengono elaborati dimensioni del campione di fra 250 g e 1 kg, anche se questi metodi richiedono operatori specializzati e sofisticati attrezzature per estrazione del DNA. In genere, un terreno su larga scala estrarre DNA è ripreso da un campione rappresentativo di singolo terreno di aggregazione dei numerosi sottocampioni da 1 a 4 ettari6,29,30. Tuttavia, il protocollo sviluppato qui è veloce, facile da usare per gli utenti con nessuna esperienza precedente nella diagnostica molecolare e può essere utilizzato di fuori di un laboratorio. Come il metodo è rapido e relativamente economico rispetto ad estrazione dal suolo su larga scala, esso potrebbe essere usato per schermo molti su piccola scala campioni prelevati da un'area di campionamento simile a campioni globali su larga scala. Questo potrebbe superare alcune delle carenze di un campione di piccole dimensioni e determinare ulteriori informazioni sulla distribuzione spaziale del patogeno nel campo. Inoltre, la portabilità e la velocità del metodo significa che può anche essere utilizzato in attività di dimostrazione ai coltivatori per didattica e scopi di fidanzamento.

Un'altra considerazione è che molti Real-Time PCR sono già stati pubblicati per una vasta gamma di agenti patogeni di impianto5. Questo sistema può fare uso di queste analisi esistenti senza la necessità di progettare nuovi primer lampada per abilitare in test sul campo. Una critica frequente di lampada saggi è che possono essere difficili da progettare31. PCR portatile, pertanto, consente l'implementazione relativamente facile di una vasta gamma di test di agente patogeno prontamente disponibili per la prova in loco.

Metodi tradizionali possono essere spesso costosa, laboriosa, inesatti e che richiede tempo. La semplicità del metodo in loco che abbiamo sviluppato consente i coltivatori e lavoratori del settore per eseguire il rilevamento del patogeno da soli e forse generare un risultato molto più velocemente che l'invio ad un laboratorio di diagnostico che potrebbe essere una certa distanza. La prontezza e la sensibilità del metodo PCR portatile può aiutare i coltivatori a fine di evitare possibili infezioni secondarie, che possono ulteriormente aumentano della popolazione dell'agente patogeno e involontaria diffusione (tramite apparecchiature o esseri umani). In conclusione, il metodo in loco sviluppato nello studio presente consente il rilevamento preciso e relativamente sensibile di importanti patogeni terricoli nel settore. La nostra speranza è che il metodo in loco sviluppato in questo studio contribuirà a una pipeline di diagnostica corrente (Figura 6), non solo fornendo risposte rapide e precise alle domande epidemiologiche sulle malattie delle piante in campo, ma anche fornendo comprensione aumentata della biologia e l'epidemiologia dei patogeni vegetali.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati al Dr. Neil C. Gudmestad North Dakota State University per la fornitura di S. subterranea plasmide DNA, Dr. Hanu Pappu a Washington State University (WSU) per la fornitura di PMTV RNA e Dr. Debra Inglis presso WSU per la fornitura di r. solani AG3. Grazie Dr. Jeremy Jewell presso WSU speciale per fornire commenti sul manoscritto e WSU CAHNRS Communications per videografia. Questa ricerca è stata sostenuta dal Consorzio di ricerca di patate di nord-ovest e Washington State Department of Agriculture - programma di specialità Crop Block Grant (grant no. K1764). PPNS n. 0741, dipartimento di fitopatologia, Università di agricoltura, delle risorse umane e naturali scienze, centro di ricerca agricolo, tratteggio progetto n ° WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, Stati Uniti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra PCR a guscio biancoBio-RadHSP9601
CFX ManagerBio-Rad1845000
SsoAdvanced Sonde universali Supermix Bio-Rad1725280
CFX96 Strumento touch qPCRBio-Rad 
Alcool etilico, puro 200 proofDecon Laboratories04-355-222
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Fisher BioReagentsBP118-500
Fenolo, saturo Fisher BioReagentsBP1750I-400
Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)Fisher BioReagentsBP152-5
q16 Genesig della macchina per PCR in tempo realeMBS486001
Sodio ultrapuro dodecil solfato (SDS)Invitrogen15525-017
2-propanolo (isopropanolo)JT Baker67-63-0
CloroformioJT Baker9180-03
Acido cloridrico, 36,5-38,0% (HCl)JT Baker9535-03
alcool iso-amilicoJT Baker9038-01
Kit di rotazione FastDNA.MP Biomedicals6560-200Kit di estrazione del DNA a base di silice #1
Kit universale Luna One-Step RT-qPCRNew England BiolabsE3005S
Provette PCR individuali a basso profilo da 0,1 mlPhenix ResearchMPC-100LP
Kit di estrazione facile del DNA/RNA PrimerdesigngenesigEASY-EK
genesig Easy 1.5 mL provettePrimerdesigngenesigEASY-1.5
Rack magnetico per provettePrimerdesigngenesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy KitPrimerdesignPath-S.subterranea-EASY
Hexedyltrimethylammonium bromide (CTAB)Sigma-AldrichH6269-100G
Pestelli a pelletThermo Fisher Scientific12-141-364
Cloruro di sodio (NaCl)Thermo Fisher Scientific7647-14-5
Kit DNA Miniprep ZymoBIOMICSD4300Kit di estrazione del DNA a base di silice #2
1855195

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
  2. Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
  3. Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
  4. Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
  5. Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
  6. Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
  7. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
  8. Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
  9. Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
  10. Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241(2008).
  11. Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
  12. Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
  13. Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
  14. Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
  15. Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
  16. Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
  17. Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337(2016).
  18. Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
  19. Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
  20. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349(1991).
  21. Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
  22. van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
  23. Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
  24. Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
  25. Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
  26. Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
  27. Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
  28. Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
  29. Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
  30. Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
  31. Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
  32. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
  33. Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
  34. Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Estrazione mediante sfere magnetichePatogeni telluriciRilevazione di malattie delle pianteSaggio con sonda fluorogenicaProtocollo di estrazione del DNADiagnosi in situSpongospora subterraneaPCR di laboratorioLaptop per l analisi dei dati

Articoli correlati