Articolo metodologico

Misura simultanea di perossido di idrogeno/del superossido e produzione di NADH di Flavin-contenente deidrogenasi mitocondriale

DOI:

10.3791/56975

⸱

24 febbraio 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland

In questo articolo

Sommario

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I mitocondri contengono parecchi enzimi flavina-dipendenti in grado di produrre le specie reattive dell'ossigeno (ROS). Monitoraggio ROS rilascio dai singoli siti nei mitocondri è difficile a causa di reazioni collaterali indesiderate. Presentiamo un metodo semplice e poco costoso per valutazione diretta delle tariffe native per rilascio ROS mediante flavoenzymes purificata e micropiastre fluorometria.

Abstract

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È stato segnalato che i mitocondri possono contenere fino a 12 sorgenti enzimatiche di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Una maggioranza di questi siti sono dipendenti da flavina complessi respiratori e deidrogenasi che producono una miscela di superossido (O2● -) e perossido di idrogeno (H2O2). Quantificazione accurata del potenziale produzione di ROS di singoli siti in mitocondri isolati può essere difficile a causa della presenza di sistemi di difesa antiossidanti e reazioni secondarie che formano anche O2●-/ h2O2. Uso di inibitori non specifici che possono interferire con bioenergetica mitocondriale può anche compromettere misure alterando rilascio ROS da altri siti di produzione. Qui, presentiamo un metodo semplice per la misura simultanea di nicotinamide adenindinucleotide (NADH) produzione e rilascio di H2O2 da purificato legata flavina deidrogenasi. Per i nostri scopi qui, abbiamo usato complesso di purificato piruvato deidrogenasi (PDHC) e α-chetoglutarato deidrogenasi complessa (KGDHC) di origine porcina cuore come esempi. Questo metodo consente una misurazione accurata del nativo H2O2 tariffe rilascio di singoli siti di produzione eliminando altri potenziali fonti di sistemi ROS e antiossidante. Inoltre, questo metodo consente un confronto diretto del rapporto tra rilascio di H2O2 e l'attività enzimatica e la proiezione dell'efficacia e la selettività degli inibitori per la produzione di ROS. Nel complesso, questo approccio può consentire la valutazione approfondita dei nativi tassi di rilascio ROS per singoli enzimi prima conducendo esperimenti più sofisticati con mitocondri isolati o permeabilized della fibra di muscolo.

Introduzione

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L'obiettivo finale del metabolismo dei nutrienti è di rendere l'adenosina trifosfato (ATP). In cellule di mammifero, ciò si verifica nei mitocondri, organelli a membrana doppia che convertono l'energia immagazzinata in carbonio in ATP. Quando il carbone viene bruciato dai mitocondri formando due trasportatori di elettroni, NADH e flavina adenina dinucleotide (FADH2)1inizia la produzione di ATP. NADH e FADH2 sono quindi ossidato da complessi respiratori multi-unità secondaria I e II, rispettivamente, e gli elettroni liberati sono traghettati al terminale dell'elettrone accettore molecolare ossigeno (O2) al complesso IV1. Il thermodinamicamente favorevole "in discesa" trasferimento di elettroni a O2 all'estremità della catena è accoppiato all'esportazione di protoni nel intermembrane spazio dai complessi I, III e IV. Questo crea un gradiente elettrochimico transmembrana di protoni (Forza Protonomotrice), una forma temporanea di energia libera di Gibbs che è sfruttato da V complessa fare ATP2. Reazioni di trasferimento di elettroni nei mitocondri non sono perfettamente accoppiate alla produzione di ATP. In vari punti del ciclo di Krebs e catena respiratoria, elettroni prematuramente possono interagire con O2 al modulo ROS3. Il più biologicamente rilevante ROS generato dai mitocondri è O2● - e H2O2. Anche se O2● - è spesso considerato il ROS prossimale formato dai mitocondri, è ora evidente che siti di produzione formano una miscela di O2● - e H2O2, che è associato con il libero radicale chimica di flavin protesica dei gruppi4,5. Ad alti livelli, il ROS può essere pericoloso, danneggiando costituenti biologici necessari per la funzione delle cellule con conseguente stress ossidativo6. Tuttavia, a basse quantità, ROS mitocondriale soddisfare funzioni vitali di segnalazione. Per esempio, rilascio di H2O2 dai mitocondri è stata implicata nel controllo di attivazione delle cellule T, sforzo segnalazione (ad es., induzione delle vie di segnalazione Nrf2), l'induzione della proliferazione e differenziazione, segnalazione dell'insulina e rilascio e alimentazione comportamento7. Notevoli progressi nella comprensione della funzione di segnalazione di ROS. Tuttavia, importanti domande rimangono ancora rispetto alla quale gli enzimi nei mitocondri servono come le fonti più importanti e come produzione è controllata.

Rilascio ROS da un sito di produzione dipende da diversi fattori: 1) la concentrazione di donare l'elettrone del sito, 2) lo stato redox del sito donare elettroni, 3) accesso ad ossigeno e 4) la concentrazione e il tipo di substrato di ossidazione3, 8 , 9. nei mitocondri, altri fattori come la concentrazione di forza potenziale di membrana e NADH inoltre influenzare ROS produzione8,10. Ad esempio, il tasso di O2●-/ h2O2 produzione di purificato PDHC o KGDHC aumenta con crescente NADH disponibilità5,11. In questo scenario, gli elettroni scorrono all'indietro dal NADH al centro FAD nella subunità E3 di PDHC o KGDHC, il sito per O2●-/ h2O2 produzione12. Allo stesso modo, la fornitura di NAD+ ha l'effetto opposto, diminuire il rilascio ROS da KGDHC12. Così, controllo entrata o uscita di elettroni dai siti di produzione di ROS può alterare quanto O2●-/ h2O2 è formata. Per esempio, bloccando la subunità di2 E di PDHC o KGDHC con CPI-613, un analogico, risulta in un quasi il 90% diminuzione O2●-/ h2O2 produzione13l'acido lipoico. Risultati simili possono essere ottenuti con la chimica S-glutationilazione catalizzatori, diammide e disulfiram, che quasi abolire O2●-/ h2O2 produzione di PDHC o KGDHC tramite la coniugazione del glutatione e 2 subunità14. Il trade-off per bloccare il flusso di elettroni attraverso la subunità di2 E di PDHC e KGDHC è una diminuzione nella produzione di NADH che diminuisce la formazione di ROS dalla catena di trasporto dell'elettrone (per esempio, complesso III). Questo può anche diminuire ATP uscita dalla catena di trasporto degli elettroni. Nel complesso, bloccando l'entrata di elettroni ai siti di produzione di ROS può essere un mezzo molto efficace di controllare O2●-/ h2O2 produzione.

I mitocondri possono contenere fino a 12 potenziali O2●-/ h2O2 fonti6. Flavin-contenente la maggior parte di questi siti sono enzimi che generano una miscela di O2● - e H2O2. Uso di qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno permesso l'identificazione di cui complessi respiratori e deidrogenasi mitocondriale servono come ad alta capacità O2●-/ h2O2 formando siti in diversi tessuti3. PDHC e KGDHC sono stati indicati per servire come ad alta capacità O2●-/ h2O2 siti che emettono in muscolo e mitocondri del fegato13,15. Restano tuttavia alcune difficoltà per quanto riguarda l'esame dell'O2●-/ h2O2 di singoli siti nei mitocondri e l'impatto che qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno il potenziale di formazione l'attività degli enzimi. Questo è dovuto alla presenza di reazioni collaterali indesiderate (ad es., la formazione di O2●-/ h2O2 da siti diversi dall'enzima di interesse), contaminando endogene nutrienti (ad es.,grassi acidi) o organelli (ad es., peroxisomes che formano anche O2●-/ h2O2) e l'uso di inibitori che la mancanza di selettività e all'impiego di composti che completamente non inibiscono la produzione di ROS. Alcuni inibitori possono anche alterare la bioenergetica mitocondriale e la direzione di flusso dell'elettrone, e questo altera il rilascio ROS da altri siti di produzione e confonde i risultati. Tariffe di assoluta per O2●/h2O2 rilascio dai singoli siti in mitocondri sono anche difficili da quantificare dovuta all'alta concentrazione di O2● - e H2O2 eliminando gli enzimi nello spazio matrice e intermembrane. Pertanto, eliminazione di eventuali reazioni concorrenti che possono interferire con O2●-/ h2O2 rilascio misure può essere utile quando si identificano ad alta capacità O2●-/ h2O2 formando siti.

Qui, presentiamo un metodo semplice che permette l'esame simultaneo di O2●-/ h2O2 produzione e formazione di NADH di purificato dipendenti da flavina deidrogenasi. Utilizzando enzimi purificati, ROS formando reazioni collaterali indesiderate e ROS enzimi degradativi può essere eliminato consentendo una misura più accurata della nativa O2●-/ h2O2 tassi di produzione per singoli flavoenzymes. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente l'O2●-/ h2O2 formando la capacità di diversi deidrogenasi purificati o per potenziali inibitori site-specific schermo per O2●-/ h2O versione 2 . Infine, misura O2●-/ h2O2 e la produzione di NADH contemporaneamente può consentire una valutazione in tempo reale della relazione tra l'attività dell'enzima e la capacità di rilascio ROS.

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Protocollo

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1. i prodotti chimici ed enzimi purificati

  1. Procurarsi i seguenti materiali: PDHC e KGDHC di origine porcina cuore (o un altro flavoenzyme mitocondriale purificato); H2O2 (soluzione al 30%), piruvato, α-chetoglutarato, NAD+, NADH, CoASH, pirofosfato della tiamina (TPP), saccarosio mannitolo, HEPES, EGTA, acido valerianico 3-metil-2-oxo (KMV), superossido dismutasi (SOD), perossidasi di rafano (HRP), 10-acetile-3,7-dihydroxyphenoxazine reagente (AUR) e CPI-613.

2. pianificazione delle analisi e preparazione dei reagenti

  1. Impostare il dosaggio secondo la tabella 1 in una piastra a 96 pozzetti.
    Nota: Il volume totale per ogni reazione è 200 µ l. concentrazioni di Stock sono in modo tale che 20 µ l di reagente viene aggiunto ad ogni pozzetto. Questo assicura la rapida aggiunta di cofattori e substrati per ciascuna reazione ben prima di iniziare il dosaggio.
  2. Preparare il tampone di reazione contenente mannitolo 220mm, saccarosio 70 mM, 1 mM EGTA e 20 mM HEPES (pH 7.4 con HCl).
    Nota: Questo potrebbe cambiare a seconda delle proprietà fisiche di diversi enzimi purificati.
  3. Esaminare il purificato KGDHC o PDHC per contaminazione utilizzando enzima attività saggi14,16,17 , o da immunoblot o Coomassie macchia5.
  4. Preparare tutti i reattivi nel buffer di reazione secondo le concentrazioni della soluzione di lavoro nella tabella 1.
  5. Conservare tutti i reagenti come aliquote di 1 mL a-20 ° C. Archivio piruvato e α-chetoglutarato a-80 ° C in aliquote di 100-µ l per evitare la degradazione spontanea a causa di auto-ossidazione e ripetuti di congelamento-scongelamento.
  6. Preparare il reagente AUR master stock in 1 mL di DMSO e diluire a 100 µM in tampone di reazione. Conservare al riparo dalla luce.
    Nota: Qui, la soluzione di lavoro 100 µM è fatta fresca ogni 2-3 settimane e al riparo dalla luce.

3. impostazione del modello di analisi

  1. Impostare la routine di analisi su un lettore di micropiastre monocromatico con capacità doppia di misurazione.
  2. Definire la procedura di lettura selezionando "Protocollo". Fare clic su "PROCEDURE".
  3. Impostare "Temperatura" a 25 ° C (Figura 1A).
  4. Fare clic su "START KINETIC" per impostare condizioni di lettura (Figura 1A). Impostare l'ora e il numero di intervalli/esperimenti di lettura.
  5. Fare clic su "Leggi" (Figura 1B).
    Nota: I campioni vengono lette dalla posizione superiore con un guadagno di 50. Tempo: 5 min, leggere a intervalli di 30 s. Canale 1: Fluorescenza Resorufina - eccitazione/emissione = 565 nm nm:600, larghezza di lunghezza d'onda di 13,5 nm. Canale 2: NADH autofluorescence - eccitazione/emissione = 376 nm:450 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 20 nm.
  6. Selezionare "READ", pozzi per monitor (ad esempio, A1-A4 e B1-B4).
  7. Selezionare "Fine cinetica".

4. standard curve

  1. Scongelare i reagenti e conservare il ghiaccio fino a quando necessario.
  2. Curva standard di NADH (Figura 2A)
    1. Preparare le soluzioni di lavoro per NADH nella gamma di concentrazione di 0,5-10 mM di tampone di reazione.
    2. Aggiungere 20 aliquote µ l da ogni NADH lavorando la concentrazione della soluzione di pozzetti contenenti 180 µ l di tampone di reazione. La concentrazione finale del NADH in ogni bene è 0.05-1 mM.
    3. Fare clic su "Leggi" e impostare eccitazione/emissione = 376 nm:450 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 20 nm.
      Nota: Si tratta di un endpoint di sola lettura - i parametri cinetici non sono necessari.
  3. Curva standard di AUR (Figura 2B)
    1. Preparare le scorte di lavoro di perossido di idrogeno in tampone di reazione; gamma di concentrazioni stock da 200-4.000 nM.
    2. Aggiungere 120 µ l di tampone di reazione ad ogni pozzetto.
    3. Aggiungere 20 µ l di HRP (concentrazione stock di lavoro = 30 U/mL, concentrazione finale nel pozzo = 3 U/mL), 20 µ l di SOD (concentrazione stock di lavoro = 250 U/mL, concentrazione finale nel pozzo = 25 U/mL) e 20 µ l di AUR (stock concentrazione di lavoro = 100 µM concentrazione finale nel pozzo = 10 µM) per ciascun bene contenente tampone di reazione.
    4. Aggiungere 20 µ l di ogni H2O2 soluzione di riserva a ciascuno contenente ben buffer e dosaggio reagenti di lavoro. Il volume di reazione finale è di 200 µ l e la concentrazione finale di H2O2 in ciascun pozzetto è 20-400 nM.
    5. Incubare le piastre per 1 min nel lettore della piastra a 25 ° C.
    6. Fare clic su "Leggi" e impostare eccitazione/emissione = 565 nm/600 nm, larghezza di lunghezza d'onda di 13,5 nm. Si noti che si tratta di un endpoint di sola lettura - i parametri cinetici non sono necessari.

5. misurazione O2●- / h2 O2 Release e produzione di NADH di KGDHC e PDHC

  1. Vedere la tabella 1 per l'ordine di aggiunta dei reagenti differenti, la concentrazione di ogni soluzione di lavoro e il volume aggiunto a ciascun pozzetto.
  2. Aggiungere 40 µ l di tampone di reazione ad ogni pozzetto. Per le analisi usando KMV o CPI-613, aggiungere 20 µ l di tampone in ciascun pozzetto.
  3. Aggiungere 20 µ l di PDHC o KGDHC (lavoro stock di 1 U/mL, concentrazione finale per pozzetto = 0,1 U/mL) ad ogni pozzetto.
  4. Incubare PDHC e KGDHC a 25 ° C per 2 min.
  5. Aggiungere 20 µ l di KMV (stock di lavoro = 100 mM, concentrazione finale = 10 mM) o 20 µ l di CPI-613 (concentrazione stock di lavoro = 1,5 mM, concentrazione finale = 150 µM) (tabella 2).
    Nota: Questo passaggio può essere escluso se inibitori non vengono utilizzati per le analisi.
  6. Incubare per 1 min a 25 ° C.
    Nota: Questo passaggio può essere escluso se inibitori non vengono utilizzati per le analisi.
  7. Aggiungere 20 µ l di HRP (concentrazione stock di lavoro = 30 unità/mL, concentrazione finale nel pozzo = 3 unità/mL) e 20 µ l di SOD (concentrazione stock di lavoro = 250 unità/mL, concentrazione finale nel pozzo = 25 unità/mL) ad ogni pozzetto.
  8. Aggiungere 20 µ l del coenzima A (concentrazione stock di lavoro = 1 mM, concentrazione finale = 0,1 mM), 20 µ l di TPP (stock concentrazione di lavoro = 3 mM, concentrazione finale = 0,3 mM) e 20 µ l di NAD+ (concentrazione stock di lavoro = 10 mM, concentrazione finale = 1 mM) per ogni w ell.
  9. Rimuovere il reagente AUR dal rivestimento di carta stagnola protettiva e aggiungere 20 µ l a ciascun pozzetto.
  10. Aggiungere 20 µ l di piruvato (concentrazione d'archivio che vanno da 1 a 100 mM, concentrazione finale per saggi di lavoro = 0,1-10 mM) per pozzetti contenenti PDHC e α-chetoglutarato (concentrazione d'archivio che vanno da 1 a 100 mM, concentrazione finale per saggi di lavoro = 0,1-10 mM) per pozzetti contenenti KGDHC.
  11. Clicca su "Leggi" per avviare la misurazione della cinetica.

6. analisi dei dati

  1. Tenere premuto il tasto 'CTRL' sulla tastiera e fare clic su pozzi per generare un grafico contenente tutte le misure cinetiche corrispondente al canale 1 (Figura 3A).
  2. Fare clic su "dati" nell'icona Visualizza in alto a destra per valori non elaborati per unità relativa fluorescenza (RFU) misurata a intervalli di tempo differenti (Figura 3B).
  3. Esportare i valori per l'analisi (tabella 3).
  4. Fare clic sul menu in alto a destra (Figura 3B) a discesa "Grafico" per accedere ai valori RFU associati al canale di fluorescenza 2.
  5. Ripetere i passaggi da 6.1 a 6.3 per il canale 2.

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Risultati

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Figura 3A fornisce una traccia rappresentativa per la RFU raccolta durante la misurazione simultanea di H2O2 e la produzione di NADH di KGDHC purificato. I dati grezzi RFU per ogni intervallo di tempo sono raffigurati nella Figura 3B. I dati grezzi RFU sono poi esportati per analisi. Estrapolando da curve standard presentate nella Figura 2, può essere determinato l'importo assol...

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Discussione

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Questo protocollo è vantaggioso poiché, 1) Elimina eventuali reazioni concorrenti che altrimenti potrebbero interferire con il rilevamento di H2O2 (ad esempio, i sistemi antiossidanti o altre fonti di ROS), 2) fornisce una valutazione diretta del tasso nativo di ROS di rilascio di una deidrogenasi mitocondriale di flavin-contenente, 3) permette il confronto del nativo ROS rilasciare tariffe di due o più purificato basati su flavina deidrogenasi, 4) può consentire un confronto diretto del ta...

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Dichiarazioni

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Non c'è niente di divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quest'opera è stata finanziata dalle scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC). Produzione video è stato realizzato in collaborazione con il centro per l'innovazione nell'insegnamento e apprendimento (CITL) al Memorial University of Newfoundland.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Complesso piruvato deidrogenasiSIGMAP7032-10UNpurificato di flavoenzima
alfa-chetoglutarato deidrogenasiSIGMAK1502-20UNflavoenzima purificato
soluzione di perossido di idrogeno al 30%,SIGMAHX0640-5, curve standard,
NAD+SIGMAN0632-1G, saggio di rilascio/attività
Reagente NADHSIGMAN4505-100MG, curve standard
piruvatoReagente SIGMAP2256-5G, saggio di rilascio/ROS
alfa-chetoglutaratoSIGMA75892-25G, saggio di rilascio/attività/ROS
CoASHSIGMAC3019-25MG, saggio di rilascio/ROS
Tiamina pirofosfatoSIGMAC8754-1Greagente, saggio di attività/rilascio di ROS
mannitoloSIGMAM4125-100Gcomponente tampone
HepesSIGMAH3375-25Gcomponente tampone
saccarosioSIGMAS7903-250Gcomponente tampone
EGTASIGMAE3889-10Gcomponente tampone
KMVSIGMA198978-5Greagente, inibitore del rilascio di ROS
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagente, inibitore del rilascio di ROS
SODSIGMAS9697-15KUreagente, rilevamento del rilascio di ROS
perossidasi di rafanoSIGMAP8375-1KUreagente, rilevamento del rilascio di ROS
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagente, rilevamento del rilascio di ROS
Lettore di micropiastre Biotech Synergy 2BioTek Instrumentslettore di micropiastre per saggi
Software Gen5BioTek Instruments, utilizzato per la raccolta di RFU grezze
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, analisi dati
Microsoft EXCELMicrosoft, analisi dati
, complesso , , , reagente reagentereagenteReagente Software Software

Riferimenti

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