Summary
Fenotipos de células de cáncer latente y activa se caracterizaron usando proyección de imagen de fase cuantitativa. Estudios de proliferación, la migración y la morfología de células fueron integrados y analizados en un método simple.
Abstract
La adquisición del fenotipo angiogénico es un componente esencial de la dormancia del tumor a escapar. Aunque varios ensayos clásicos en vitro (p. ej., proliferación, migración y otros) y en vivo los modelos se han desarrollado para investigar y caracterizar los fenotipos de células angiogénicas y no angiogénico, estos métodos son tiempo intensivo de mano de obra y a menudo requieren reactivos caros instrumentos, como conocimientos significativos. En un reciente estudio, se utilizó una fase cuantitativa nueva imagen técnica (QPI) realizar caracterizaciones Time-lapse y etiquetado libre de células KHOS de osteosarcoma humano angiogénicos y no angiogénico. Un panel de parámetros celulares, incluyendo la morfología celular, la proliferación y movilidad, cuantitativamente fueron medidos y analizados usando QPI. Esta novela y el enfoque cuantitativo proporciona la oportunidad de forma continua y no invasiva estudiar procesos celulares importantes, comportamientos y características de las células cancerosas y otros tipos de células de una manera simple e integrada. Este informe describe el protocolo experimental, incluyendo la preparación de la célula, QPI adquisición y análisis de datos.
Introduction
Uno de los primeros puestos de control en el desarrollo y progresión de un tumor sólido es la adquisición del fenotipo angiogénico, un sello distintivo del cáncer. Esta progresión consiste en una variedad de procesos bioquímicos y moleculares1,2,3. Un desafío técnico en el estudio de esta etapa clave en la progresión tumoral es la falta de herramientas que continuamente y cuantitativamente caracterizar y diferenciar fenotipos angiogénicos y no angiogénico de las células de cáncer vivas de una manera imparcial. Los análisis tradicionales se utilizan para investigar los comportamientos celulares de células angiogénicas y no angiogénico generalmente requieren instrumentos y reactivos costosos, por ejemplo, ensayos de proliferación y migración de célula4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 o complementarios en vivo evaluaciones4,5,6,8,15,16, así como que requieren uso intensivo y considerable experiencia consumo de tiempo y mano de obra.
Recientemente, fase cuantitativa imaging (QPI) ha emergido como una técnica novedosa que permite la evaluación de lapso de tiempo y libre de etiquetado de una variedad de célula morfología y comportamiento parámetros17,18,19, 20 , 21 , 22. a diferencia de la microscopía óptica convencional, QPI cuantifica las variaciones de desplazamiento de fase píxel por píxel después la luz pasa a través de un objeto óptico y reconstruye un holograma con espesor óptico se puede convertir y volumen, permitiendo así la directa Análisis de células vivas y las siguientes características: la proyección de imagen (1) cuantitativa, proyección de imagen (2) no-invasivo y Time-lapse, la proyección de imagen (3) libre de etiqueta y proyección de imagen (4) simultánea de múltiples parámetro. Estas características hacen de QPI una poderosa herramienta para evaluar y comprender los procesos patológicos a nivel celular.
En un reciente estudio, se utilizó QPI para caracterizar cuantitativamente y diferenciar angiogénicos KHOS-A y no angiogénico KHOS-N fenotipos de células de osteosarcoma humano de una manera sistemática y cuantitativa, la combinación de análisis de la morfología de la célula, proliferación y motilidad23. Usando software de análisis de imágenes, un panel de células morfológica y comportamiento parámetros fueron comparados cuantitativamente entre las células de osteosarcoma humano angiogénicos y no angiogénico y se identificaron cinco diferencias características entre estos dos fenotipos. Este nuevo enfoque ofrece una plataforma integrada y cuantitativa para evaluar una variedad de características celulares biológicamente relevantes.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité de bioseguridad institucional Hospital infantil de Boston.
1. preparación de la célula
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Descongelación KHOS-A y células -N
- Medio de cultivo, es decir, en calor Dulbecco modificado medio de Eagle suplementado con 10% de suero de ternero fetal (vol/vol) (FBS) y 1% (vol/vol) penicilina/estreptomicina.
- Tomar los viales criogénicos de células desde el tanque de nitrógeno líquido, sumerja el fondo de los frascos en agua caliente en un baño de agua de 37 ° C y agitar suavemente los frascos criogénicos para acelerar el proceso de descongelación. Mantenga la tapa de los frascos criogénicos de ponerse en contacto con agua para evitar la contaminación. Tan pronto como las células son descongeladas, esterilizar el frasco criogénico por rociar solución de etanol 70% y limpiar la cubeta.
- En campana de flujo laminar, aspirar inmediatamente la suspensión de células del frasco criogénico y suspender suavemente en medio de cultivo 10 mL calentado (descrito en la 1.1.1). De centrífuga suspensiones celulares a 200 x g durante 5-7 minutos.
- Resuspender el precipitado de células con medio de cultivo 10 mL calentado y transvasar a un matraz T75. Pipetee suavemente varias veces para suspender las células con una pipeta de 10 mL.
- Coloque el matraz en una incubadora de 37 ° C con 5% (vol/vol) CO2 y un ambiente humidificado. Permitir que las células a conectar durante al menos 12 h.
- Incube las células durante aproximadamente 3-7 días hasta 80-100% confluente. Cambiar el medio de cultivo cada 2-3 días.
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División KHOS-A y células -N
- Quitar los medios de cultivo del frasco.
- Lavar las células con PBS estéril 5 mL (1 x) sin calcio y magnesio, para eliminar las células no adherentes o fracción.
- Añadir solución de tripsina-EDTA de 0,05% 1 mL en el matraz y agitar brevemente el frasco para asegurar que la tripsina-EDTA se dispersa uniformemente.
- Incube el frasco para 2-3 minutos en un incubador de 37 º C o 3-5 min a temperatura ambiente. Compruebe las células bajo un microscopio con aproximadamente 400 aumentos para asegurarse de que las células son redondeadas para arriba y separadas.
- Una vez que las células son separadas, añadir 10 mL medio de cultivo y pipetee suavemente el medio de arriba y abajo varias veces para romper los agregados de células en una suspensión unicelular utilizando una pipeta de 10 mL.
- Contar las células usando un contador de células. La suspensión de células de la semilla en frascos de T75 nueva en una densidad de 2 × 106 células o una proporción de 1:4.
- Permitir a las células a crecer hasta 80-100% de confluencia antes de sembrar para el experimento QPI.
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Siembra KHOS-A y -N celdas QPI
- Semilla de KHOS-A y -N células en placas de 6 pozos en la densidad de 50.000 300.000 células/pozo con medio de cultivo 5 mL después de contar con un contador de células.
Nota: La densidad de siembra depende de la tasa de proliferación celular y el período de proyección de imagen para < 100% confluencia durante la adquisición de imágenes. - Incube las células durante al menos 12 h permitir el accesorio.
- Cambiar el medio con medios frescos antes de QPI.
- Semilla de KHOS-A y -N células en placas de 6 pozos en la densidad de 50.000 300.000 células/pozo con medio de cultivo 5 mL después de contar con un contador de células.
2. QPI adquisición
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Cubreobjetos, establecer
- Limpiar el cubreobjetos por enjuague varias veces con agua desionizada y esterilizar con solución de etanol 75% por inmersión durante 15 minutos, poner el cubreobjetos en una campana de flujo laminar estéril para secar.
- Coloque cuidadosamente el cubreobjetos sobre una placa de 6 pozos para evitar burbujas obvio. Asegúrese de que la parte inferior de la hoja de cubierta se encuentra inmerso en los medios de cultivo (mínimo 5 mL/pocillo).
- Coloque la placa en la incubadora (37 ° C, 5% CO2y ambiente humidificado) se equilibren para por lo menos 15 minutos. Si la niebla se forma en la hoja de cubierta, use un hisopo de algodón estéril para limpiar limpio.
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Proyección de imagen de células con un microscopio
- Abra el software al iniciar el sistema, incluyendo la calibración del uno mismo del tiempo de exposición, contraste del patrón y el ruido de holograma. Asegúrese de que los valores son aceptables (se muestra en la gama del verde o amarillo).
- Coloque la placa de 6 pozos en el escenario del microscopio QPI.
- Haga clic en "Capturar vivo" y seleccione "Manual" en "Enfoque de Software". Grueso se centran las imágenes de la fase de células mediante el ajuste de la distancia de trabajo en "Ajuste del microscopio" para obtener líneas de células en imágenes de fase. Cambiar a "Automático" en "Enfoque de Software".
- Haga clic en "Nuevo experimento" para crear un nuevo experimento. Comience con la selección de las posiciones de adquisición de imagen utilizando el ratón o las flechas en el teclado numérico. Después de cada selección, haga clic en "Recordar". Normalmente se seleccionan localidades de 3 a 5 para cada muestra.
- Configurar los intervalos de proyección de imagen y período de tiempo en la sección de "Timelapse".
Nota: Para seguir claramente las células cancerosas, los intervalos deben ser menos que 5 min 48 horas se define como el período de tiempo para la combinación de análisis QPI. - Iniciar el experimento haciendo clic en "Capture", que automáticamente se centrará y adquieren las imágenes en los puntos de tiempo de ajuste.
3. Análisis de los datos
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Análisis de la morfología de células
- Haga clic en "Identificar las células". Ajustar el ajuste numérico de "Umbral de fondo" para que áreas de la célula se separan bien del ruido de fondo. Ajustar el número de configuración de "Tamaño del objeto" para asegurarse de que cada célula tiene un núcleo. Mantener parámetros constantes para las muestras que deben compararse, ya que pueden afectar las mediciones de área y volumen finales. Modificar manualmente los segmentos de la célula mediante el uso de "Cambios manuales," si es necesario.
- Utilizar la función "Analizar los datos" en el software para analizar las células. Iniciar un nuevo análisis de datos haciendo clic en "Nuevo análisis". Arrastre las imágenes seleccionadas en los "Marcos de la fuente" ficha célula morfología parámetros y area de célula (μm2), espesor óptico (μm) y volumen (μm3) para cada célula individual. Elegir scatter parcela o histograma modo y exportar los datos como tablas o figuras.
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Análisis de la proliferación de células
- Seleccione por lo menos 5 imágenes para los diferentes puntos temporales de interés (por ejemplo, inicial, 12 h, 24 h, 36 h y 48 h). Número récord de células que es proporcionado por el software.
- Para estimar el tiempo de duplicación, parcela número de células después de la normalización con los números iniciales y ajuste con las curvas de crecimiento exponencial.
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Análisis de movimiento de la célula
- Utilice la función de "Seguimiento de las células" en el software. Haga clic en "Nuevo análisis" para iniciar un nuevo análisis de datos. Serie de arrastre de imágenes durante un período de tiempo seleccionado (p. ej., 4 h después de la incubación de 24 h) en la ficha de "Marcos de la fuente" elija al azar 10-30 células pulsando células bajo la modalidad de selección "Añadir células". Excluir las celdas de los bordes y los del campo de visión.
- Revise cuidadosamente el seguimiento de la serie de imágenes. En caso de que el sistema pierde la pista de una célula o pistas de la celda equivocada, ajustar manualmente la célula de seguimiento haciendo clic en "Identify" para identificar las células o hacer clic en "Modificar ubicación" bajo la modalidad de "Select" para modificar la ubicación de la célula.
- Elegir entre trama rosa de trayectorias de la célula en "Movimiento solar" o parcela para los otros parámetros relacionados con el movimiento en "Características de la trama," como la velocidad de la motilidad (μm/h), motilidad (μm), migración (μm) y la franqueza de migración. Exportar datos a tablas o figuras.
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Representative Results
La figura 1 muestra una caracterización de la morfología de célula típica. Las imágenes se presentan como hologramas (figura 1A-B) y de imágenes 2D (figura 1-D). Espesores de célula óptica (calculadas a partir del índice de refracción y la longitud del camino óptico) se cuantifican mediante Perfil de línea o una medición de células enteras. Dispersión de parcelas de la zona y el espesor de KHOS-A y se trazaron las células KHOS-N medidas para una célula entera, como en Figura 1E-G, donde estos dos fenotipos muestran patrones de distribución diferentes. El número promedio de histograma (figura 1 H-M) o los archivos exportados demostró que las células KHOS-A tienen áreas más pequeñas de la célula y mayor grosor que las células KHOS-N.
Usando la función de contador de células, perfiles de proliferación celular se obtuvieron (figura 2). Éstos no mostraron una diferencia significativa entre KHOS-A y -N células. Además, el tiempo de duplicación de la célula podría ser estimada de la curva de proliferación (es decir, 24-26 h), que también no mostraron diferencias significativas.
Figura 3A -D muestra el típico seguimiento de KHOS-A y -N células en no direccional (al azar) de movimiento modo y las correspondientes trayectorias. La motilidad celular promedio (figura 3E-F), velocidad de la motilidad ()figura 3-H), distancia de migración ()figura 3I-J)y la franqueza de migración ()figura 3 K-L) se representan gráficamente frente al tiempo de grabación. En comparación con las células KHOS-N, KHOS-A células mostraron mayor velocidad de la motilidad, lo que resulta en una distancia más larga de la movilidad y la migración.
Figura 1: caracterización de la morfología de la célula. (A-B) Representante hologramas de KHOS-A (A) -N células y (B) por cuantitativa fase de proyección de imagen. Barra de escala es 191,4 μm. inserciones en la esquina inferior derecha el perfil cuantitativo de la línea de espesor óptico de la línea azul trazada en las imágenes. (C-D) Imágenes de QPI representante de segmentación celular para células de KHOS-A (C) y -N (D). Barra de escala es que 100 μm. las células en los bordes se excluyeron para la cuantificación. (C-e-G) Espesor medido versus área de células individuales de KHOS-A (E) -N las células y (F). Cada punto representa una célula individual (n = 200-300). La trama de superposición (G) muestra patrones significativamente diferentes de dispersión para KHOS-A y -N células. (H-M) Histogramas de espesor de célula (H-le), distribución de área (J-K)y volumen (L-M) para KHOS-A (H, J, L) y -N cells (I, K, M). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: caracterización de la proliferación de la célula. El panel superior muestra segmentación celular representativa para contar el número de células. Barra de escala es de 100 μm. El panel inferior muestra la tasa de proliferación celular calculado correspondiente. Datos se presentan como media ± desviación estándar. Prueba de t de Student (impar, dos colas) fue utilizado para los análisis estadísticos. Resultados de las pruebas se consideraron significativas cuando p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: caracterización del movimiento de la célula. (A-B) Seguimiento de células representativas imágenes para KHOS-A (A) y -N (B) células. Barra de escala es de 100 μm. seleccionadas las células se describen con diferentes colores. Motilidad celular grabada en un 4 h período de tiempo se presenta con la línea de color correspondiente. (C-D) Trayectorias de celular de células de KHOS-A (C) y -N (D) trazan desde el punto de origen (0,0). Cada línea representa una celda individual. KHOS-A células demostraron un patrón más disperso en comparación con las células KHOS-N (n = 10). (E-L) Registrados parámetros cuantitativos durante el período investigado para el movimiento de la célula de KHOS-A (E, G, I, K) -N (F, H, J, L) de las células, incluyendo células motilidad (E-F), velocidad (G-H), distancia de migración (I-J de la motilidad y )y la franqueza de la migración (K-L). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este estudio, describimos una en vitro, no invasivo y libre de etiqueta método usando QPI para caracterizar cuantitativamente los fenotipos angiogénicos y no angiogénico de las células de osteosarcoma humano. Varios parámetros celulares han sido analizados simultáneamente por este método integrado, alto rendimiento, incluyendo el área celular, espesor de la célula, volumen celular, tasa de proliferación, doble tiempo, franqueza de migración, velocidad de la motilidad, migración y movilidad.
En comparación con los ensayos convencionales que evalúan comportamientos celulares y morfología de la célula, este método no sólo ahorra tiempo y mano de obra, sino que también proporciona información más precisa y detallada. Por ejemplo, la ubicación del sistema QPI (dentro de la incubadora de la célula) reduce las perturbaciones de los cambios ambientales como fotografiar en un entorno ambiental (temperatura y atmósfera)23. Además, espesor óptico de la célula y el volumen, de cambio de fase, se podían obtener con el QPI, mientras que sólo el área celular se mide por la célula tradicional del proceso de la proyección de imagen. Esta característica de QPI genera información más detallada para las comparaciones cuantitativas de fenotipos de células diferentes.
Densidad de siembra adecuada de las células de interés es fundamental en el método actual. Durante la fase de adquisición imágenes, las células se esperan que sean menos de una monocapa confluente debido a la limitación de esta técnica QPI coherente que adquisición de imágenes pueden realizarse solamente con el panel de uno de los focos, que puede perder información parcial en la z Dirección (es decir, las células superpuestas). Además, caracterizaciones con QPI se limitan al formato 2D, que no es óptimo para la invasión de la célula en la dirección z en la matriz extracelular. Presets múltiples las longitudes focales se necesitan para el futuro desarrollo de metodología QPI.
Además de contar células, proyección de imagen de QPI proporciona imágenes informativas para el estudio de la mitosis celular sin adicional etiquetado21,23,24. Mientras que la división de célula fue reconocida fácilmente por la evidente disminución de área celular y el volumen, la capacidad objetiva y cuantitativamente definir y diferenciar las etapas del ciclo celular de las células todavía debe establecerse. Esta capacidad facilitaría significativamente la investigación con respecto al análisis de la célula para la diferenciación de células madre, la respuesta de drogas y detención del ciclo celular.
Debido a las ventajas de ser cuantitativo, etiqueta-libre y fácil de utilizar, este método también puede tener aplicaciones clínicas útiles25,26,27,28,29,30 . Por ejemplo, este sistema podría utilizarse en la caracterización de poblaciones de células heterogéneas, incluyendo las células inactivas y activas en los tumores humanos. Las diferencias célula caracterizado morfológica y de comportamiento entre las células de cáncer latente y activa pueden utilizarse potencialmente para descifrar los mecanismos moleculares subyacentes la dormancia del tumor en cánceres humanos.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores reconocen con gratitud el apoyo de la Breast Cancer Research Foundation y la Fundación de investigación médica avanzada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T75 flask | Corning, NY, USA | 353136 | |
| 6-well plates | Corning, NY, USA | 3506 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals, GA, USA | S11550 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, MA, USA | 10010023 | |
| Beckman Z1 Coulter counter | Beckman Coulter, IN, USA | Z1 | |
| HoloMonitor M4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | M4 | Microscope |
| Hololid | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | PHI 8020 | |
| HStudioM4 | Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, Sweden | HStudioM4 | Software |
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