Summary
Färgning DNA-molekyler för fluorescensmikroskopi tillåter forskare att se dem under ett experiment. I metoden som presenteras här är DNA-molekyler före färgas med fluorescerande färgämnen och smält med metylering och icke-metylering känsliga restriktionsenzym.
Abstract
Visualisering av DNA för fluorescensmikroskopi använder en rad färgämnen såsom cyanin färgämnen. Dessa färgämnen utnyttjas på grund av deras hög affinitet och känslighet för DNA. För att avgöra om DNA-molekylerna är full längd efter slutförandet av experimentet, krävs en metod för att avgöra om de färgade molekylerna är fulla längd av smälta DNA med restriktionsenzym. Färgade DNA kan dock hämma enzymerna, så behövs en metod att bestämma vilka enzymer som man kan använda för fluorokrom målat DNA. I denna metod, är DNA målat med en cyanin färgämne över natten så att färgämnet och DNA temperera. Nästa, färgade DNA är smält med ett restriktionsenzym, laddade i en gel och electrophoresed. De experimentella DNA digest band är jämfört med en i silico digest att bestämma aktiviteten restriktionsenzym. Om det är samma antal band som förväntat, då är reaktionen klar. Fler band än väntat visar delvis matsmältningen och mindre band tyder på ofullständig matsmältning. Fördelen med denna metod är dess enkelhet och den använder utrustning som en vetenskapsman skulle behöva för ett restriktionsenzym assay och gel elektrofores. En begränsning med denna metod är att enzymerna som är tillgängliga för de flesta forskare är kommersiellt tillgängliga enzymer; men kunde någon restriktionsenzym användas.
Introduction
Den TOTO-serien (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 och BOBO-3; Tabell 1) utnyttjas i en mängd olika experiment där visualisering av DNA är krävs1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. familjen cyanin dimer används flitigt på grund av deras kvantutbyte, känslighet och hög affinitet för DNA molekyler18,19,20. Cyanin dimer färgämnen har bra selektivitet för dubbel stranded DNA och när interkalenderat har en 100 till 1000 faldig ökning av fluorescens21. Specificiteten färgämnen (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 och TOTO-3) har en kortare våglängd som utsläpp än deras quinolium färga (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 och POPO-3) motsvarigheter (tabell 1)22. Den quantum avkastningen för cyanin dimerer interkalenderat i DNA är också hög (0,2 - 0,6)22. Med hjälp av ett enzym att bestämma metylering profilen av en DNA-molekyl2 eller sträcka23 i en DNA-molekyl som redan målat med fluorescerande färg kräver dock en metod för att bestämma vilken enzymer kommer smälta färgade DNA. Någon typ av färgämne som intercalates i DNA eller någon enzym som ger en märkbara mönster av DNA substratet kan användas för denna metod.
Meng et al. bestäms först matsmältningen klassa av prestained DNA genom gelelektrofores använder en mängd olika färgämnen24. Maschmann et al. grävde i djupare för att titta på familjen TOTO av färgämnen. Både bestäms andelen matsmältningen av färgade DNA för att se om DNA färgas med en viss färg kan smältas med en restriktionsenzym25. Andra metoder studera bindande verkan av färgämnen interkalenderat med DNA använder optisk pincett26 eller NMR27. Båda metoderna kräver specialutrustning; bör denna metod tillåter att utrustning som de flesta molekylär biologi labs har att avgöra om ett färgämne stör en restriktionsenzym matsmältning.
Dessutom i andra metoder för att mäta längden på en viss molekyl, har optisk kartläggning långsträckt ofärgade DNA-molekyler på en yta och rötas DNA för att bestämma stretch och storlek av fragment. Interkalation av färgämne har visat sig öka kontur längden fluorescently betsad DNA-molekyler och beroende på färgämnet används, kontur längderna är olika21. Denna metod har använts i en mängd olika genomen1,3,4,6,13,28,29,30, 31. men om molekyler var pre betsad, beroende på färg och enzym, enzymet kanske inte kunna klippa DNA färgas med en viss färg. Därför, denna metod bestämmer om DNA färgas med en viss färg kan smältas med ett enzym. Dessutom beroende på koncentrationen av färgämnet och färgämnet utnyttjas, rörlighet för DNA kommer att band i en gel migrera långsammare än infödda DNA på grund av partiell återgång av DNA ryggraden att göra plats för färgen att infoga mellan baspar32 .
Dock ibland dessa färgämnen kan delvis eller hämmar helt verkan av vissa restriktionsenzym7,24. Detta tros bero på en strukturell förändring i DNA som orsakas av tillbehöret av den fluorescerande färgämne, som kan hindra enzymet från att erkänna dess specifika sekvens. Förstå hur dessa färgämnen påverkar restriktionsenzym kan hjälpa i experiment där metylering profilen eller sträckan av färgade DNA krävs.
I vår metod, var DNA målat med en fluorokrom sevärdheter och smält med ett restriktionsenzym. Sedan DNA var electrophoresed på en gel, avbildas, och restriktionsenzym matsmältning var mätt. Restriktionsenzym valdes utifrån det skurna mönstret på en gel. Alltför många band orsakade överlappning av DNA band och alltför få band gav inte en fullständig bild av DNA-molekylen. Finns det en sweet spot för att kunna bestämma profilen av smält DNA-molekylen; Därför, det beror på DNA används och enzymet. En fördel med denna metod är dess enkelhet; Det kräver endast utrustning som används i en begränsning matsmältningen och gel elektrofores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av färgämnen, buffertar och agarosgel
-
Förbered följande lösningar för färgning DNA eller nedbrytning av färgade DNA.
- Förbereda 1 x TE (Tris-HCl och etylendiamintetraättiksyra syra; EDTA) buffert med 10 mM Tris-HCl och 1 mM EDTA i en graderad cylinder eller mätkolv. Förvara i rumstemperatur (18-25 ° C).
- Gör portioner av varje färg: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabell 1). Pipettera 4 µL av 1 mM färgämne in i en mörk bärnsten eller svart 1,5 mL tub och tillsätt 36 µL av 1 x TE, blanda med pipetten; denna koncentration gör en 100 µM dye lösning (40 µL totalt). Slutföra det här steget för varje färg. Förvaras vid 4 ° C.
Obs: Undvik att utsätta färgämne för ljus för att förhindra fotoblekning eller nedbrytning av färgämnet. - Förbereda buffert 1 med 10 mM Bis-Tris-propan-HCl, 10 mM MgCl2och 100 µg/mL bovint serumalbumin (BSA). Förbereda buffert 2 använda 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2och 100 µg/mL BSA. Förbereda buffert 3 använda 50 mM kalium acetat, 20 mM Tris-acetat, 10 mM magnesium acetat och 100 µg/mL BSA. Varje enzym kräver en av dessa specifika buffertar ska fungera.
-
Förbered följande lösningar för gelelektrofores.
- Gör en 6 x lastning genom att kombinera 0,25% bromophenol färga blått, 0,25% xylen cyanol, 15% Ficoll i dH2O. Store vid rumstemperatur.
- För att göra en 0,7% agaros gel, väga in 0,07 g av hög gelbildande temperatur (HGT) agaros i en Erlenmeyerkolv, tillsätt 100 mL av 1 x TAE buffert och placera en inverterad bägare ovanpå kolven.
- Värm lösningen på en värmeplatta tills bubblorna börjar bildas på undersidan av kolven och flyta till toppen.
- Ta bort lösningen från värmeplattan, låt lösningen svalna tills kolven kan beröras med en bare hand och häll sedan gelen i en 24,5 x 21,8 cm gel mögel med en gel kam att skapa brunnar.
- Ta bort bubblor nära kammen eller på ytan av gelen genom poppar dem med en pipettspetsen och låt gelen stelna i minst 15 minuter. Detta kan förvaras i kylskåp (4 ° C), som insvept i plastfolie i 1 vecka för att förhindra uttorkning av gel eller kontaminering. Mer information om hur du kör en gel avse Lee et al. 33 .
Obs: Använd en gel kam med 30 enskilda brunnar. Varje bör väl vara 4,5 mm bred med ett djup av 2 mm. Höjden av brunnen beror på mängden gel hälls i rutan.
- Laga 1 x TAE (Tris - acetate - EDTA) buffert med 40 mM Tris-HCl, 20 mM ättiksyra och 1 mM EDTA. Förvara i rumstemperatur (18-25 ° C).
2. beredning av färgade DNA
-
Fläcken lambda DNA (300-800 ng) använder olika alikvoter av färgämnen. Varje färgämne (tabell 1) har sex olika koncentrationer testats, för sammanlagt 48 reaktioner per restriktionsenzym. Följande process beskriver en uppsättning upp för 1 reaktion (figur 1).
- Späd lambda-DNA använder 1 x TE till 100 ng / µL. butik i 4 ° C. Gör en lösning med total volym på 300 µL.
- Färga unmethylated lambda-DNA. För varje band som förväntat från digest, uppskatta 75-100 ng/band. Lägga till lämpliga mängder av färgämnet att producera koncentrationer av 1,9 µM, 3,8 µM, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng DNA.
- Inkubera över natten (15 h - 18 h) vid 4 ° C.
- Lämna en reaktion ofärgade för att agera som en kontroll25.
Obs: Använd unmethylated DNA för matsmältningen reaktionen. Metylering känsliga enzymer kan inte klippa metylerade regioner i DNA och ger ett utseende av en ofullständig matsmältning.
3. beredning av restriktionsenzym analysen
-
Digest färgas DNA med ett restriktionsenzym att avgöra om detta enzym kan smälta prestained DNA (figur 1).
- Följande dag, lägga till 20 U av restriktionsenzym, 3 µL av lämplig buffert (tabell 2) och destillerat, lättbetong och autoklaverad och filtrerat vatten för sammanlagt 30 µL. För varje enzym reaktion, välja bufferten med högsta skära effektivitet, som kan hittas på tillverkarens hemsida.
- Placera reaktionerna i ett vattenbad vid temperatur av optimal enzymaktivitet, visas i tabell 2 för de 6 enzymer som används i Maschmann et al., för 2-4 h (tabell 2)25.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 2 µL 0,5 M EDTA pH 8,0.
4. Electroeluting målat DNA i en agarosgel
- Ta bort sidorna från 24,5 x 21,8 cm gel mögel (1.2.2 steg) och placera gelen i rutan gelelektrofores. Häll 2,5 L 1 x TAE buffert i rutan. Ta försiktigt bort gel kammen från gelen, så brunnarna är tillgänglig33.
- Pipettera restriktionsenzym reaktionerna på en plastfilm och kombinera varje reaktion med 6 x laddar färgämne. För varje reaktion lösning, tillsätt 1 µL av 6 x laddar dye per 5-6 µL DNA lösning (1 x). Sedan Pipettera reaktionerna (innehållande lastning färgämnet, < 18 µL) i brunnar.
- Blanda 1 µL 1 kb stege, 9 µL av 1 x TE och 2 µL av 6 x laddar färgämne. Läsa in lösningen i brunnar som flankerar de andra lösningarna.
- Täck gelboxen med mörkt blå eller svart papper eller tyg. Anslut gelboxen till ett nätaggregat, ställa strömförsörjningen till 30 V, och köra det över natten (15-20 h). Släck lamporna när gelen är igång, för att förhindra photocleavage av märkt DNA.
- Nästa morgon stänga av strömförsörjningen. Ta gelen med facket och överföra det till en behållare med 45 µL etidiumbromid och 1 L av 1 x TAE buffert. Förvara behållaren vid rumstemperatur i mörkret eller luckan i folie för att förhindra exponering för ljus. Låt gelen fläcken minst 45 minuter i rumstemperatur.
FÖRSIKTIGHET: Använd etidiumbromid med handskar och bära skyddsglasögon. Vid rengöring ut behållaren som innehåller etidiumbromid bromid lösning och kasta bort gelen, konsultera din staternas förfogande riktlinjer för att fastställa hur man handskas med begagnade etidiumbromid; andra fläckar kan dessutom användas i stället för etidiumbromid.
5. imaging på agarosgel
- Placera gelen ovanpå en blå ljus transilluminator, som avger maximal ljusprestanda mellan 400-500 nm. Ta bilder med kameran ansluten till stationen.
Varning: Se till att använda omslaget för belysningen och pålagda skyddande glasögon innan han på ljuskällan.
Obs: Detta steg kan också fyllas i med någon UV ljus källa eller standardgel scanner. - Se bilderna i ImageJ genom att dra filen till ImageJ statusfältet och bilden kommer att dyka upp.
- Fastställa vilken matsmältningen för experimentet genom att jämföra banden på gel till gel beräknade i silico mönster. För att fastställa vilken matsmältningen, divideras antalet experimental band med det förväntade antalet DNA band24,25. Om experimentell smält DNA bandet mönstret visar det förväntade mönstret, är matsmältningen priset 1. Om mönstret har fler fragment än väntat, är matsmältningen större än 1. Om mönstret har mindre fragment än väntat, är matsmältningen mindre än ett år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att avgöra om en intercalating färgämne kommer att påverka ett restriktionsenzym smälta DNA, rätt ordning av steg måste följas (figur 1). När DNA är målat och smält med ett givet enzym, kan en bild av gelen vidtas för att fastställa antalet fragment och deras storlek (figur 2). För att fastställa enzym effektiviteten, det totala antalet förväntade synliga band dividerat med antalet synliga band. Enzymet effektivitet equaled enighet, om antalet värdeområden väntat och sett matchen. Om det finns fler band på gel än förväntat, värdet är större än ett och indikerar delvis smält reaktioner. Om det finns mindre band än förväntat, då är värdet mindre än en, vilket tyder på ofullständig matsmältning. I figur 2a, körfält 3 och 4 Visa rörlighet av banden har minskat, orsakar banden som övergång till brunnarna. Lanes 1 och 2 påverkar mängden färgämne inte rörligheten märkbart, så banden matcha kontroll. I figur 2avisar körfält 5 och 6 fler band än kontrollgruppen, så det visar delvis matsmältningen. Vilket betyder, färgerna påverkas klyvning av DNA på webbplatsen erkännande för detta enzym. I figur 2bförväntas alla band ses för alla dye koncentrationer, så färgen inte stör matsmältningen av DNA. Figur 2 c spår rörlighet skiftar med färgade asterisker.
Som färgämne ökar koncentrationen för färgämnen med -1, rörlighet minskar. För att bestämma den ungefärliga storleken på banden, krävs en kontroll att veta där de infödda DNA-molekylerna förväntas jämfört med färgade DNA (figur 2a). För färgämnen med -3 minskade rörlighet inte i den mån-1 färgämnen gjorde, så det var lättare att bestämma storleken på fragmentet (figur 2b). Rörlighet skillnaden beror på vilken typ av färgämne som utnyttjas, som sett i Maschmann et al. 25. Variansen för dessa färgämnen ses på grund av strukturerna av färgerna. Länkaren mellan den aromatiska biexponentiellt för färgämnen -3 var längre än -1. Färgerna kan intercalate lite annorlunda på grund av skillnaden i linker storlek, vilket kan förklara varför rörlighet skiftet är mindre för-3 färgämnen.
Om det finns ingen DNA, eller DNA banden är mycket, svimma i gel, krävs öka koncentrationen av DNA. Dock om DNA koncentrationen ökar, ökar då mängden färgämne som krävs också för att hålla den rätta koncentrationen färgämne DNA förhållande.
Figur 1 : En schematisk bild av stegen krävs när smälta fluorokrom märkt DNA-molekyler. DNA och YOYO-1, eller ett annat färgämne från TOTO-serie läggs till en svart tub och inkuberas över natten (O/N; 15-20 h). Ett restriktionsenzym läggs till ett rör; den är placerad i en inkubator, vid rekommenderad temperatur, för 2-4 h (tabell 2). Läsa in prover i en nedsänkt 0,7% agarosgel gjort med 1 x TAE buffert. Mörkt färgade papper omslag gelboxen och belysningen stängs av, medan gelen är sprang över natten för att förhindra photocleavage av färgen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Begränsning rötning av DNA interkalenderat med ett cyanin dimer färgämne. (en) Lambda-DNA är målat med olika koncentrationer av YOYO-1 över natten (lane C: rötas lambda-DNA med ingen färgämne (kontroll), lane 1: 1,9 ng, lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19,4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: 48,3 ng, lane 6: 63,5 ng av färgämne per 100 ng DNA) och sedan dige sted med mina vid 37 ° C i 2-4 h. Alla reaktioner är electrophoresed (E = 0,85 V/cm) på en 0,7% gelbildande temperatur (HGT) agarosgel gjort med 1 x TAE buffert (1 x TAE; 40 mM Tris-HCl, 20 mM ättiksyra, 1 mM EDTA). Geler är målat med etidiumbromid och avbildas med en blå ljus transilluminator kopplat till en kamera. Lane L är 1 kb stege (storlekar, kb); Lane λ är full längd lambda DNA; Lane E är beräknade bandet mönstret (storlekar, kb). (b), Lambda-DNA är målat med YOYO-3 (lane 1: 1,9 ng, lane 2: 3.8 ng, lane 3: 19,4 ng, lane 4: 32,2 ng, lane 5: 48,3 ng, lane 6: 63,5 ng av färgämne per 100 ng DNA) och smält med HindIII vid 37 ° C. (c) för att se hur rörligheten skiftade som YOYO-1 koncentrationen ökas, färgade asterisker finns intill varje band för varje YOYO-1 koncentration. Bandet på 3,5 kb har exempelvis en röd asterisk bredvid varje band i varje YOYO-1 koncentration. De oväntade banden i lane 5 och 6 har inte en asterisk bredvid banden. Figuren är modifierad från Maschmann o.a. 25. copyright (2017) nukleosider och nukleotider nukleinsyror. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kemiskt namn | Förkortat namn | Ex / Em (nm) |
| [(1 – 1′-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl] bis [4-[(3-metyl-2(3H)-benzothiazolylidene) metyl]]-, tetraiodide | TOTO-1 | 514/533 |
| 1, 1′ - (4,4,8,8-tetrametyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4-[(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-yl) methylidene]-4-dihydroquinolinium, l] tetraiodide} | YOYO-1 | 491/509 |
| 2, 2 '-[1,3-prop-anediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4-ylidenemethylid - yne]] bis [3-metyl]-, tetraiodide | POPO-1 | 434/456 |
| 2, 2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethylimi-nio)-3,1-propanediyl-1(4H) - pyridinyl - 4 – 1, 1 '-[4,8-bis(dimethyliminio)undecane-1,11-diyl]bis{4-[3-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2(3H)-ylidene)prop-1-en-1-yl]qui-nolinium} | BOBO-1 | 462/481 |
| 2, 2 '-{[4,8-bis (dimethyliminio) undecane-1,11-diyl] bis [kinolin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-benzothiazol-3-ium) tetraio-dide | TOTO-3 | 642/660 |
| 1, 1′-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl]] bis [4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzoxazolylidene)-1-propenyl]]-, tetraiodide | YOYO-3 | 612/631 |
| 2, 2 '-[1,3-propanediylbis [(dimethyliminio) - 3,1 - propanediyl-1 (4 H) - pyridinyl - 4 - ylidene-1-pr-open-1-yl-3-ylidene]]bis[3-methyl]-, tetraiodide | POPO-3 | 534/570 |
| 2,2'-{Propane-1,3-diylbis[(dimethylazaniumdiyl)Propane-3,1-diylpyridin-1-yl-4-ylideneprop-1-en-1-yl-3-ylidene]}bis(3-methyl-1,3-Benzothiazol-3-IUM) tetraiodide | BOBO-3 | 570/602 |
Tabell 1: Förkortat namn av TOTO familj av färgämnen med IUPAC-namn och utsläpp (Em) och magnetisering (Ex) maximima22.
| Enzymet | Metylering känsliga | Buffert | Vatten bad temperatur |
| BamHI | Nej | 2 | 37 ° C |
| Mina | Ja | 2 | 37 ° C |
| HindIII | Nej | 2 | 37 ° C |
| PmlI | Ja | 1 | 37 ° C |
| ScaI | Nej | 2 | 37 ° C |
| Bruno | Ja | 3 | 25 ° C |
Tabell 2: Anges i tabellen är en delmängd av möjliga enzymer som kan användas i dessa experiment. Tre enzymer är metylering känsliga och tre inte metylering känsliga. Buffertar används för enzymer och inkubation temperaturer listas för varje enzym.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att smälta fluorescently märkt DNA (figur 1), krävs ett antal steg. Först, DNA är målat med en fluorokrom över natten. DNA kan inkuberas med cyanin dimerer under en kortare tidsperiod. Carlsson et al. fann dock att DNA skapade dubbla band för varje DNA storlek på grund av ofullständig färgning20. För att råda bot på detta kan DNA färgas över natten för att förhindra dubbla band. Detta är ett kritiskt steg i protokollet. Om färgen inte ruvas under en tillräckligt lång tid, dye-DNA kan inte vara vid jämvikt och kommer att ge ett dubbel-banding mönster. Om detta sker, låt DNA-dye blandningen temperera under en längre tid.
Därefter är ett restriktionsenzym lagts till DNA-dye blandningen och rötas för 2-4 h vid en viss temperatur för varje enzym. DNA måste vara unmethylated för metylering känsliga enzymer. Om det inte är, kommer att metylerade DNA hämma enzymet begränsning från styckning DNA i metylerade regioner. Dessutom måste reaktionen inkuberas i rätt buffert och temperatur för enzymet. Varje enzym har en lista över buffertar och enzymaktiviteten i varje buffert. Välj bufferten med enzymaktivitet på 100%, om möjligt. När det gäller temperatur, kontrollera ruvas i rätt temperatur. Om det inte är, kan det orsaka enzymet att förlora aktivitet eller denaturera om temperaturen är för hög. EDTA används för att stoppa reaktionen. Bolaget var enzymer köptes kommer att ha ett diagram med de optimala temperaturer och buffert för det enzymet. Om kontrollen inte ger rätt antal band på rätt molekylvikt, kontrollera att se om enzymet har gått ut, öka inkubationstiden eller kontrollera för att kontrollera att temperaturen är rätt för det enzymet.
När reaktionen är klar, kan proverna laddas i en gel. Först är en gel laddad i behållaren för gel och nedsänkt i 1 x TAE buffert. Nästa, smält DNA blandas med lastning färgämne och lösningen är laddad i brunnar av gelen. Locket är gled över och ledningarna är kopplade till gelboxen. Ett mörkt papper, som är tejpade ihop, är placerad ovanpå locket att täcka locket och drapera över sidorna. Ett annat viktigt steg är att proverna är skyddade från ljus vid alla tidpunkter, särskilt när gelen är igång. Strömförsörjningen ska vara påslagen och lamporna till rummet avstängd. För att förhindra photocleavage av DNA, är prover skyddade från ljus hela tiden. Om det finns inga mörka papper, kan ett mörkt tyg användas också. Om DNA inte rör, se till att kablarna är anslutna till rutan och på Kör-knappen har tryckts.
På morgonen, ta gelen ur rutan gel och läsa in gelen i en behållare som innehåller etidiumbromid. Etidiumbromid tillåter oss att se banden DNA under den blå ljus transilluminator (figur 2). Andra färgämnen kan användas i stället för etidiumbromid. En kamera kan monteras ovanför den blå ljus transilluminator att fånga bilder av gelen. Beroende på inställningarna, kan en tänkbar station också utnyttjas.
Denna metod kan användas för någon färgämne som intercalates eller fläckar DNA, inte bara i TOTO-serien. Maschmann et al. Modified en teknik som utvecklats av Meng et al. för att avgöra om fluorescently fläckig DNA kunde smältas med restriktionsenzym24,25. Detta är den enda teknik som används för att avgöra om pre färgade DNA påverkar restriktionsenzym. Denna metod är begränsad till begränsning enzymer kommersiellt tillgängliga, såvida inte en vetenskapsman har tillgång till andra restriktionsenzym som inte finns kommersiellt. Beroende på DNA, det enzym som valt bör ha en urskiljbar DNA bandet mönster och tillräckligt band (> 3) att avgöra om DNA-molekylen är full längd. DNA bör också vara unmethylated om metylering känsliga enzymer används. Om DNA är denaturerad, sedan inte använda metylering känsliga enzymer.
Denna metod är ett lättanvänt sätt att avgöra om restriktionsenzym kan klippa DNA-molekyler på webbplatsen erkännande som färgas med en intercalating färgämne utan att behöva designa primers för en given skär plats34. De framtida tillämpningarna av denna metod skulle vara att avgöra om fluorescently märkt molekyler från ett experiment var full längd med hjälp av ett restriktionsenzym och fastställande av storleken på banden DNA från digest eller att bestämma DNA metylering profiler molekyler. Framtida experiment kunde också avgöra om Hack enzymer påverkas av de cyanin färgämnena eller andra fluorescerande färgämnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av det nationella institutet för allmän medicinsk vetenskap (NIGMS) (5605100122001), en komponent i den National Institutes of Health (NIH), samt University of Nebraska på Kearney (UNK) sommaren Student Research Program (SSRP) och UNK Grundutbildning Research Fellowship (URF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, (2010).
- Riehn, R., et al.
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
