Här presenterar vi två protokoll för mätning av mitokondriell Ca2 + tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler. För isolerade mitokondrier, vi detalj en plate reader-baserade Ca2 + import assay med de Ca2 + känsliga färga kalcium grön-5N. För odlade celler beskriver vi en konfokalmikroskopi metod där Ca2 + färgämnet Rhod-2/AM.
Ca2 + hantering av mitokondrierna är en kritisk funktion som reglerar både fysiologiska och patofysiologiska processer i ett brett spektrum av celler. Förmågan att noggrant mäta inflödet och utflödet av Ca2 + från mitokondrier är viktigt för att fastställa rollen av mitokondriell Ca2 + hantering i dessa processer. I denna rapport presenterar vi två metoder för mätning av mitokondriell Ca2 + hantering både isolerade mitokondrier och odlade celler. Vi detalj först en tallrik läsare-baserad plattform för mätning av mitokondriell Ca2 + upptag med de Ca2 + känsliga dye kalcium grön-5N. Det platta läsare-baserade formatet kringgår behovet av specialutrustning och kalcium grön-5N färgämnet är idealiskt lämpad för att mäta Ca2 + från isolerade vävnaden mitokondrier. För vår ansökan beskriver vi mätning av mitokondriell Ca2 + upptag i mitokondrierna som isolerats från mus hjärta vävnad; dock kan detta förfarande tillämpas för att mäta mitokondriell Ca2 + upptag i mitokondrierna isolerade från andra vävnader såsom levern, skelettmuskel och hjärnan. För det andra beskriver vi en confocal microscopy-baserad analys för mätning av mitokondriell Ca2 + i permeabilized celler använder Ca2 + känsliga färgämnet Rhod-2/AM och imaging använder 2-dimensionell laserskanning mikroskopi. Detta permeabilisering protokoll eliminerar cytosoliska dye kontaminering, möjliggör specifika inspelning av ändringar i mitokondriell Ca2 +. Dessutom tillåter laserskanning mikroskopi för hög bildfrekvens att fånga snabba förändringar i mitokondriell Ca2 + svar på olika droger eller reagenser som används i den externa lösningen. Detta protokoll kan användas för att mäta mitokondriell Ca2 + upptag i många celltyper inklusive primära celler såsom hjärt myocyter och nervceller och förevigade cellinjer.
Mitokondrierna är kritiska platser av intracellulära Ca2 + lagring och signalering. Decennier av forskning har visat att mitokondrierna har förmågan att importera och binda Ca2 + 1,2. Mitokondrier är dock inte bara passiva platser Ca2 + lagring. Ca2 + på mitokondriell facket utför grundläggande signalering funktioner inklusive reglering av metabola utdata och aktivering av mitokondrie-medierad cell death gångvägar, som har granskat tidigare3. För metabolisk reglering ökar Ca2 + aktiviteten hos tre matrix-lokaliserad mellan östradiol och östron av den tricarboxylic syra cykel samt respiratoriska kedja komplex, att öka mitokondriell energi produktion4,5 . Med mitokondriell Ca2 + överbelastning och dysreglerad mitokondriell Ca2 + hantering, Ca2 + utlösare mitokondriell permeabilitet övergången pore (MPTP) öppning, leder till mitokondriell inre membranet vilket, membranet potentiella förlust, mitokondriell dysfunktion, svullnad, brista och i slutändan cell död6,7,8,9. Således, mitokondriell Ca2 + signalering direkt påverkar både cellulära liv och död vägar genom metabol kontroll och MPTP-döden axel.
Under de senaste åren, det har snabbt växande intresse i studien av mitokondriell Ca2 + dynamics förfaller i stor del till att identifiera de molekylära beståndsdelarna av den mitokondriella Ca2 + uniporter complex, en mitokondriell inre membranet transportör som är en primär läge Ca2 + importera till mitokondriella matris 10,11,12. Identifiering av dessa strukturella och reglerande subenheter av uniporter har frambringat möjligheten att genetiskt inriktning mitokondriell Ca2 + inflödet för att modulera mitokondriell funktion och dysfunktion och underlättade studiet av de bidrag av uniporter komplexa och mitokondrie Ca2 + tillströmningen till sjukdom13,14,15. Faktiskt, mitokondriell Ca2 + signalering har varit inblandad i patologier av en mångfald av sjukdomar allt från hjärtsjukdom till neurodegeneration och cancer16,17,18, 19,20.
Med tanke på den grundläggande betydelsen av mitokondriell Ca2 + signalering i metabolism och celldöd, och kombinerat med den breda räckhåll för biologiska system påverkar att mitokondriell Ca2 + signalering, metoder att bedöma mitokondriell Ca2 + tillströmningen är av stort intresse. Inte överraskande, en mängd tekniker och verktyg att mäta mitokondriell Ca2 + har utvecklats. Dessa inkluderar metoder som använder verktyg som fluorescerande Ca2 +-känsliga färgämnen21,22 och genetiskt-kodade Ca2 + sensorer riktade till mitokondrierna, såsom cameleon och aequorin23, 24. Målet med denna artikel är att belysa olika metoder och modellsystem där mitokondrie Ca2 + upptag kan mätas. Vi presenterar två experimentella metoder för att utvärdera mitokondriella Ca2 + tillströmning kapacitet. Med hjärt mitokondrier som exempel, vi detalj en plate reader-baserad plattform för mätning av mitokondriell Ca2 + upptag med de Ca2 + känsliga färga kalcium grön-5N som är idealisk för isolerade vävnaden mitokondrier14 . Med hjälp av odlade NIH 3T3-celler, beskriver vi också en konfokalmikroskopi imaging-baserad analys för mätning av mitokondriell Ca2 + i permeabilized celler med Ca2 + känsliga färgämnet Rhod-2/AM25.
Här beskriver vi två olika metoder för att mäta mitokondriell Ca2 + tillströmning. Den plattan läsare-baserade kalcium grön-5N metod bildskärmar extramitochondrial Ca2 + nivåer och är en Ca2 + upptag som lämpar sig väl för mätningar i isolerade mitokondrier. Medan vi har visat representativa resultat från isolerade murina hjärt mitokondrier, kan denna analys lätt anpassas för mitokondrierna isolerade från vävnader med hög mitokondriell överflöd inklusive lever, skel…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av bidragsfinansiering från den amerikanska hjärtat Association (J.Q.K.).
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors | Biotek | ||
Tissue Homogenizer | Kimble | 886000-0022 | |
22 x 22 mm coverslips | Corning | 2850-22 | |
96 well plate | Corning | 3628 | |
6 well plate | Corning | 3506 | |
Calcium Green-5N | Invitrogen | C3737 | |
MitoTracker green FM | Invitrogen | M7514 | |
Rhod-2, AM | Invitrogen | R1244 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
Sucrose | EMD Millipore | 8510 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
EGTA | Sigma | E8145 | |
Potassium chloride | Fisher | BP366-500 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P0662 | |
Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
L-malic acid | Sigma | M1125 | |
Calcium chloride | Sigma | C4901 | |
Potassium acetate | Fisher | BP364-500 | |
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
Phosphocreatine disodium salt | Sigma | P7936 | |
Saponin | Sigma | S7900 | |
Ru360 | Calbiochem | 557440 |