Summary
Этот метод описывает размещения разъединительных вен графтов в кроликов, трансдукции графтов и достижение прочного трансген выражения. Это позволяет расследования физиологических и патологических роли трансгенов и их белковых продуктов в привитые вен и тестирование генной терапии для трансплантата болезни вен.
Abstract
Вен трансплантата шунтирования является общей лечения артериальной облитерирующий эндартериит; Однако долгосрочный успех ограничивается отказа трансплантата вследствие тромбоза, гиперплазия интимы и атеросклероза. Цель этой статьи заключается в том, чтобы продемонстрировать метод для размещения двусторонних венозной взаиморасположение графтов в кролика, а затем преобразователя графтов с вектором передачи гена, который достигает прочный трансген выражение. Метод позволяет расследование роли биологических генов и их белковых продуктов в нормальной вен трансплантата гомеостаза. Она также позволяет тестирование трансгенов для мероприятий, которые могли бы предотвратить вен трансплантата сбоя, например., ли выражение трансген предотвращает рост neointimal, уменьшает воспаление сосудистой или уменьшает атеросклероз у кроликов кормят с высоким содержанием жиров диеты. Во время первоначального выживания хирургии сегменты правого и левого внешнего яремной подакцизным и помещены на двусторонней основе как обратный конец в бок общей сонной артерии взаиморасположение графтов. В ходе второй операции выживания, выполнено 28 дней спустя каждый графтов изолирован от обращения с сосудистой клипов и люменов (через arteriotomy) заполнены раствор, содержащий вспомогательные зависимых аденовирусных вектор (HDAd). После инкубации 20-мин атмосферный вектор решения, ремонт arteriotomy и потока восстанавливается. Вены собирают в моменты времени, продиктовано отдельных экспериментальных протоколов. 28-день задержки между размещения трансплантата и трансдукция необходима для обеспечения адаптации вен трансплантата к артериальной циркуляции. Эта адаптация избегает быстрой потере трансген выражения, которое происходит в духе графтов преобразованы до или сразу же после прививки. Метод является уникальным в его способности добиться прочного, стабильного трансген выражение в привитые вен. По сравнению с другими моделями трансплантата крупных животных вен, кролики имеют преимущества низкой стоимости и простой обработки. По сравнению с моделями трансплантата грызунов вен, кролики имеют больше и легче манипулировать кровеносных сосудов, которые обеспечивают обильное ткани для анализа.
Introduction
Атеросклероз является хроническим воспалительным заболеванием, в котором накопление липидов и воспаление в стенке сосудов ведут к сужению просвета сосуда, инфарктов, инсультов и потеря конечностей1,2. Чрескожного вмешательства (например., ангиопластика и стентирование) и медицинской терапии (например., статины и антиагрегантов агентов) являются полезным лечения атеросклероза; Однако они часто оказываются неэффективными в лечении тяжелой обструктивной болезни как коронарные и периферические тиражами. Шунтирование, использование аутогенных вен сегментов, остается общей процедуры для лечения пациентов с тяжелой, диффузные заболевания коронарных и периферических сосудов3,4. Однако, вен графтов в обоих коронарных и периферической циркуляции имеют плохой долгосрочные показатели проходимости. В коронарное кровообращение примерно 10-20% вен, которые графтов закрыта на 1 год и 50% являются закрыта 10 лет5,6. В периферической циркуляции вен трансплантата отказов являются 30-50% на 5 лет7.
Генная терапия является привлекательным подход для предотвращения отказа трансплантата вен, потому что он может доставить продукт терапевтических генов именно на месте этого заболевания. Соответственно многочисленные доклинические исследования проверили вен трансплантата генной терапии8,9. Однако по сути все эти исследования изучили эффективность раннего времени точек (2-12 недель)10,11,12,13,14,15, 16 , 17. Мы осознаем, что без доказательств, что вмешательства генной терапии может обеспечить прочный (лет) защиту конце вен трансплантата, обычно является результатом neointimal гиперплазия и атеросклероза4. Мы разработали метод, который позволяет прочный трансген выражение в привитые вен и тем самым позволяет тестирование вмешательства генной терапии в конце, а также раннее время точках. Для достижения прочного трансген выражения, метод включает в себя HDAd векторов и задержки трансдукции стратегии. HDAd векторов обеспечивают длительное трансген выражение, потому что им не хватает вирусных генов, предотвращение признания (и неприятие) transduced клеток иммунной системы18,19,20, 21. отсроченная трансдукции (выполненных 28 дней после размещения трансплантата) предотвращает потерю transduced клеток во время процесса arterialization, который происходит рано после прививочных22.
Другие методы, обеспечивающие достижение терапевтического трансген выражение в стенке трансплантата вен полагаются на трансдукции вен трансплантата в то время трансплантата размещения10,11,12,15,16 ,17. При измерении серийно, выражение трансген, используя этот подход быстро снижается после трансдукции22,23. Соответственно исследования, используя этот подход не изучили эффективность за 12 недель после прививки вен, с наиболее не оценке эффективности за 4 недели. В противоположность этому, наш метод достигает вен трансплантата трансген выражение, которое сохраняется стабильно по крайней мере 24 недель и-на основе аналогичных исследований, выполненных в артерии вероятно продолжается гораздо дольше,22,24. Мы осознаем не других вен трансплантата генной терапии вмешательства, которое достигает стабильного трансген выражение этой продолжительности.
Мы использовали модель Кролик для разработки нашего метода. Другие использовали грызуны, кролики, или крупных животных для тестирования вен графт генной терапии10,11,12,,1516,17,25, 26. По сравнению с моделями грызунов, кролики являются более дорогими и распространяются более жесткие нормативные требования. Однако, по сравнению с более крупных животных (например., свиньи и собаки), кролики гораздо дешевле купить и дома и гораздо проще в обращении. Кроме того, кролик сосуды напоминают человеческие сосуды физиологически27, они являются достаточно большими, что они могут быть использованы для тестирования чрескожного вмешательства28,29, и они обеспечивают достаточно ткани, несколько конечных точек (например., гистология, белка, РНК) может проверяться с помощью одного сосуда образца22,30. Кроме того когда кролики с вен графтов кормили с высоким содержанием жиров диеты, они разрабатывают вен трансплантата атеросклероза31,32, который является распространенной причиной ишемической объездной вен трансплантата провал4,5 . Эти трансплантаты вен атеросклеротической кролик может служить в качестве субстрата для тестирования генная терапия выступления участников с помощью этого метода. Указанный протокол может помочь следователям освоить технические навыки, необходимые для достижения прочного трансген выражение в кролика вен графтов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные протоколы и исследования были утверждены в университете Вашингтона отделение животных.
1. предшествующие операции (для всех кабинетов)
- Анестезировать кролика с кетамином и 1,5 мг/кг Ксилазина 30 мг/кг внутримышечно (IM) в paraspinous мышц.
Примечание: Продовольствие и вода не ограничены до операции. - Время ожидания для достаточной глубины анестезии, настроить таблицы в подготовке комнате и операционной комнате (OR).
- Подготовка подготовка номер для бритья шеи кролика и размещение внутривенного (IV) порта в ухо (выживания хирургии только). Место глазная мазь, фентанил патч (выживание хирургии), машинки для стрижки волос приготовительная спиртом салфеткой, 24-G x ¾" катетер, инъекционным портом и хирургическая лента для подготовки таблицы.
- В OR, настроить оборудование для мониторинга и связанные зонды (Электрокардиограмма (ЭКГ), пульс оксиметрии (SpO2) и температуры). Подготовить IV насоса 100 мл физиологическим IV сумку с иглой 18-G или 19-G и установите скорость потока как 10 мл/ч/кг (только для выживания хирургии). Настройка кислорода и изофлюрановая оборудование с ураном (вен прививки или урожай операций).
- Чтобы защитить ураном для кролика, цикл марлевые полосы вокруг трубки, которая поставляет газ в ураном. Этот цикл следует окружить трубу, где он придает ураном. Свободные концы полосы марли должны оба быть около 45 см длиной. Место ураном (прилагаемый марлей) на головной конец таблицы.
- Включите циркулирующей воды и/или принудительного воздуха потепление одеяло или таблицы. На потепление одеяло позиции рулонных полотенец в качестве поддержки шеи и место пластину дисперсионные электрод электрокоагуляции.
- Как местным обезболивающим, объединить в шприц 1 мл 2% лидокаин HCl и 1 мл 0,5% бупивакаин HCl. развести вируса к желаемой концентрации (здесь, использовать 2 х 1011 вирусных частиц/мл для HDAd) в стерильной среде DMEM и держать на льду (гена передачи хирургии только).
- После достижения адекватной анестезии глубины, подготовьте кролика для хирургии.
Примечание: Тест на отсутствие рефлекс педали вывода для обеспечения адекватной глубины анестезии. Продолжать следить за педаль рефлекс всей операции.- Применять мазь глазная кролика глаза.
- Чтобы разрешить для размещения ректальной температуры зонда, нажмите пальцами перчатке чуть выше прямой кишки и переместить пальцы к ануса удалить stooling из кролика кишки.
- Бритье кролика от грудины надреза до края нижней челюсти. Бритье одно ухо для размещения IV и противоположного уха для фентанила патч администрации (выживания хирургии только). Бритье левый задний средний пальцы для размещения датчика SpO2 .
- Для векторных хирургии инфузии интубировать кролика. Используйте 4 мм O.D./3 мм и.д. uncuffed эндотрахеальную трубку, резьбовые над артроскопа. Кролик в грудной recumbency и гипер расширить шею. Держите кролика рот широко открытыми и визуализировать глотки и гортани складок с помощью артроскопа. Во вдохновение аккуратно вставьте эндотрахеальную трубку через гортани и трахеи.
- Для выживания кабинетов место и обеспечить 24-G IV катетер в Вену левого уха кролика и шапочка с инъекционным портом. Примените патч 25 мкг/ч фентанила в правом ухе кролика.
Примечание: Протокол предназначен для хирурга, расположено на правой стороне кролика. Если хирург будет кролика левой стороны, обратной стороны в этот шаг, чтобы сохранить провода и IV напротив хирурга. Переключение сторон в будущих шагов, при необходимости. - Для прививки и урожай операций вен управлять общим наркозом с ураном; для векторных хирургии инфузии управлять общим наркозом через эндотрахеальную трубку.
Примечание: Интубация может использоваться для всех операций. Наш опыт показывает однако, риск осложнений от гортани и трахеи травмы во время интубации может перевесить преимущества интубации. Операция, которая включает перенос генов для трансплантата (особенно в холестерин кормить кроликов) является единственным хирургии в которых интубация, как представляется, обеспечивают чистую выгоду. - Нести кролика в или. Место кролика в лежачем положении на операционном столе с полотенцем поддержки шеи, расположены чуть ниже головы кролика. Аккуратно расширить шеи кролика, до тех пор, пока это прямой и около горизонтальных.
- Место ураном для кролика (вен прививки и урожай операций) или подключить эндотрахеальной трубки (вектор хирургии инфузии) с O2 в 1 Л/мин и начать изофлюрановая. При использовании ураном, закрепите его, завернув концы прилагаемый марлевые прокладки вокруг шеи кролика поддержки полотенце. Регулировка изофлюрановая концентрации, как необходимо поддерживать хирургической уровень анестезии (обычно 1-2%).
- Центр электрокоагуляции дисперсионные Электрод пластина под спину кролика. Щуп ректальной температуры и применять SpO2 зонда и ЭКГ приводит к кролику.
- Подключите к порту катетер в левом ухе кролика физиологическим IV линии и начать IV инфузионный насос на 10 мл/ч/кг. После 1 h, снижения солевые вливания 5 мл/мин/кг.
- Слабо галстук передние ноги кролика к операционному столу как сдержанность.
Примечание: При необходимости, пластиковый столик могут быть размещены на кролика, чтобы предотвратить хирург от нажатия на грудь/живот кролика и потенциально вызывая гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и аспирации. - Подкожно вводить лидокаин/бупивакаин (2 мл, равного микс, шаг 1.2.4) (SQ) на шее вдоль линии планируемых разрез, для местной анестезии.
- Продезинфицируйте хирургического помощник сайт с 3, чередуя скрабы хлоргексидин глюконат и изопропиловый спирт, а затем спрей сайт с повидон йод. У хирурга скраб, платье и перчатки, после асептического принципов.
- Выполняйте операции выживания в асептических условиях. Есть помощник обрабатывать любые нестерильные предметы и асептически пройти стерильных материалов к хирургу или асептически разместить их на таблице драпированные инструмента.
- У использования стерильных полотенца хирург асептически манипулировать нестерильного оборудования, таких как Микроскоп. Должны носить 2 x хирургической лупы при выполнении первой половине операции хирург.
2. Сосудистая хирургия трансплантата (выживание)
- Подготовка инструментов и стерильные области.
- Есть помощник открыть стерильные пакеты (таблица пелерина, пелерина бумаги и 6 полотенец) и асептически передавать содержимое к хирургу.
- Драпировка в таблице документа. Место бумаги Пелерина и стерильные простыни на таблице драпированные инструмента. С 4 полотенца драпировка кролика, оставляя только хирургическое сайта на шее воздействию. Положите документ драпировка над кролика. Позднее будет использовано одно полотенце, и последний из них является резервной.
- Есть помощник открыть стерилизованный инструмент пакет и асептически пройти инструмент лоток к хирургу. Организовать инструменты на таблице инструмента.
- Помощник открыть следующее оборудование и асептически передать хирург или поместить его на таблице документа: один шприц 1 мл, один шприц 3 мл, один 20 мл шприц, 1 игла 21 G, 3-0 Полигликолидная кислота (PGA) швом, шовный материал PGA 5-0 , 7-0 полипропилен шовный материал и один из 24 G IV катетер.
- Закрепите кабель электрокоагуляции к пелерина, охватывающих кролика, используя 7.25" Кантровиц щипцами. Падение Подключите конец кабеля через край работы таблицы подключен к блоку электрохирургии и включен помощник.
- Наполните шприц 20 мл стерильного физиологического раствора из соленых мешок или флакона, удерживаемые помощник. При необходимости воспользуйтесь этой физиологического раствора для предотвращения обезвоживания организма подвергаются ткани во время операции.
- Подготовить 5 мл гепаринизированным физиологическим физраствора, добавив 0,1 мл гепарина 5000 МЕ/мл в 5 мл физиологического раствора, т.е., гепарин 100 МЕ/мл, в небольшой миске хирургического. Это решение можно используйте для сброса сонной артерии и Вены трансплантата регулярно во время прививочных процедуры.
- Вырежьте отверстие в документ драпировка над хирургической сайта на шее кролика. Использование полотенце зажимы для зажима углы в отверстие в место для базового полотенца.
- Сосудистые рассечение
Примечание: Используйте 2 x хирургические лупы для помощи с этой частью операции.- Вырезать кожу с electrocautery вдоль средней линии между грудной вырез и нижней челюсти (приблизительно 7-9 см в длину) и зажим кожи шеи кролика для полотенца с полотенцем зажимы. В конце хвостового сделайте короткие боковые прорезать фасции с электрокоагуляции. Тупо вскрыть под фасции вдоль всей срединной большими ножницами. Прорезать расчлененных фасциальных слоя вдоль средней линии с электрокоагуляции.
- Начните с правой стороны. Вскрыть между sternohyoid мышц, обволакивающие трахеи и V-образный sternocephalic мышцы, чтобы разоблачить общей сонной артерии.
- Тщательно анализировать сегмент 4-5 см общей сонной артерии и ее крупных ветвей (обычно 1-2 на стороне) от окружающих тканей. Расширение рассечение от основания шеи проксимально к пролет глоточный нервные дистально. Использование хирургических кремния петли для помощи в опровержение сонной артерии при вскрытие. Перевязать большие ветви общей сонной артерии с шелковыми швами 5-0 до резки каждой ветви дистально.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не нарушить блуждающего нерва, что параллели общей сонной артерии, или меньше нервов, которые пересекают артерии. - Повторите рассечение на левой стороне (шаг 2.2.3).
- Используйте ткани Холдинг щипцы для временно закрыть слой подкожной клетчатки. Вскрыть поверхностной фасции из кожи на правой стороне, до тех пор, пока внешние яремной подвергается. Вскрыть 4-5 см сегмент внешнего яремной вены и бесплатно ее отделения от окружающих тканей, лигируют веточек с шелковыми швами 5-0 до резки филиал.
- Повторите рассечение на левой стороне (шаг 2.2.5).
- Придать гепарина (150 МЕ/кг) в IV катетера и заподлицо с 10 мл физиологического раствора.
- Мера 3-cm сегмент внешнего яремной вены на правой стороне и перевязать хвостовой конец сегмента с Шелковый шов 5-0. Разрешить Вены, чтобы заполнить с кровью, а затем перевязать краниального конца сегмента вен. Разделить краниального конца сегмента внешней яремной вены, тщательно промойте судно с гепаринизированным физиологическим (100 ед/мл) с использованием 3-мл шприц, прилагается к 24-G IV-катетера. Разделите сегмента вен на его хвостовой конец. Место сегмента вен в стандартизированных положение, в котором однозначно идентифицируются краниально и каудально концы.
- Пересадка вен
- Пусть помощник удалить хирургическим лупы от хирурга и переместить хирургический микроскоп (25 X) в положение.
Примечание: Хирург должен драпировка стерильные полотенце через микроскоп. Это позволяет хирургу манипулировать микроскопа при сохранении стерильности. - Зажим правой общей сонной артерии на каждом конце сегмента изолированных с мини зажимы, размещение черепной зажим сначала позволяет артерии заполнения, а затем размещения хвостового зажим.
- Вырезать 1 × 2 см кусок жесткой бумаге (доступно из упаковки шовный материал стерильный) и поместите его под общей сонной артерии, чтобы улучшить экспозицию.
- Выполните arteriotomy, точно краниально к хвостовой зажим (хвостового arteriotomy). Длина arteriotomy должно быть равным диаметру конца сегмента вен. Вставьте шприц с IV катетер через хвостового arteriotomy и промойте просвет сонной артерии с гепаринизированным физиологическим.
- Шовные краниального конца жилы до хвостового arteriotomy, с помощью 7-0 полипропилен шовный материал с одной швы (рис. 1).
- Поместите первый стежок к шовные хвостового конца хвостового arteriotomy до конца сегмента вен. Разместите второй строчки 180° от первой строчки, чтобы шов краниального конца хвостового arteriotomy до конца сегмента вен.
- Место третьей строчки в точке, равноудаленной от первых двух строчек на боковой стороне анастомоза. Место четвертая строчка на медиальной стороне анастомоза, равноудаленной от первых двух строчек и напротив третьей строчки. Место 4 дополнительных швов (швы 5-8) между каждым из строчек 1-4.
- Выполните черепной arteriotomy на хвостовой части черепной клипа. Расстояние между краниального конца черепной arteriotomy и каудального конца хвостового arteriotomy должно быть таким же, как длина сегмента вен. Длина головы arteriotomy равна Диаметр хвостового конца сегмента вен.
- Расширение вен краниально от анастомоза, положив поверх сонной артерии, без внесения каких-либо изгибов. Промыть сонной артерии и Вены с гепаринизированным физиологическим через черепной arteriotomy. Солевой раствор будет течь через артерии, в Вену через хвостового анастомоза и будет выходить из свободных и неушивании конца жилы. Промывка Вену также предотвращает его от скручивания.
- Шовные хвостового конца жилы в черепной arteriotomy (рис. 1).
- Место первого стежка для шовные хвостовой конец черепной arteriotomy в хвостовой конец сегмента вен. Разместите второй шов в шов краниального конца черепной arteriotomy в хвостовой конец сегмента вен. Заполните анастомоза, как описано в шаге 2.3.5.2. Просто перед последний узел привязали на краниальной анастомоза, кратко откройте зажим на краниального конца сегмента расчлененных общей сонной артерии, чтобы позволить обратно кровотечения, что вымывает воздух в сонной артерии и Вены привитые. Затем затяните последний узел.
- Релиз черепной зажим, чтобы позволить трансплантата заполнения вен с кровью и затем отпустите зажим хвостовой. Оживленная пульсаций должны рассматриваться в духе трансплантата. Придайте нежное давление сухой марлей, чтобы остановить любое кровотечение в анастомозов.
- Перевязать обоих концах сегмента общей сонной артерии, которая соединяет анастомозов с Шелковый шов 3-0 и разделить сонной артерии, на полпути между лигатуры (рис. 1). Нанести несколько капель папаверин (3,5 мг/мл) сонной артерии, прилегающих к каждой анастомоза.
- Придать гепарина (75 МЕ/кг) в ухо IV катетер и заподлицо с 10 мл физиологического раствора. В настоящее время придать бупренорфин (SQ, 0,02 мг/кг) для предоставления послеоперационной анальгезии, пока патч фентанила оказывает болеутоляющее плазменный уровень фентанила.
Примечание: Дополнительные бупренорфина инъекции (SQ, 0,02 мг/кг) может быть необходимым 6 h после первой инъекции для поддержания анальгезии, пока плазмы фентанила достигает терапевтической концентрации. - Повторите, пересадка на левой стороне (шаги 2.2.8, 2.3.2-2.3.9).
- Закройте подкожной клетчатки с 5-0 PGA шва с помощью шаблона постоянной. Закройте кожи с 3-0 PGA шва с помощью внутрикожные модели. Бери узлов на обоих концах.
- Пусть помощник удалить хирургическим лупы от хирурга и переместить хирургический микроскоп (25 X) в положение.
- Послеоперационное восстановление, очистка и уход
Примечание: Позвольте кролика, чтобы оправиться от анестезии в спокойной, тихой среде. Контролировать кролик непрерывно для надлежащего оксигенации и тела температуры до тех пор, пока он полностью выздоровел.- Выключить изофлюрановая и кислорода и отсоедините кроликов анестезия машины. Отсоедините IV жидкости труб от кролика, но оставьте порт IV в духе уха для эмерджентных доступа.
- Транспортные кролика в клетке восстановления и поместите его на его стороне. Тепловые поддерживают с теплой водой одеяло (или приточно-потепление). Дать O2 , ураном, до тех пор, пока SpO2 является стабильной.
- До тех пор, пока кролика можно сидеть и передвигаться в своей клетке, флип кролика другую его сторону каждые 15 мин. Затем удалите канюля IV уха и возвращение кролика в своей клетке. Возвращение кролика в компании других животных, только после того, как он полностью оправился от анестезии.
- Распоряжаться любой отходов следующие соответствующие протоколы для биологической и колюще-режущих отходов утилизации отходов.
- После операции проверьте Кролик здравоохранения и хирургической раны каждый день. Администрировать бупренорфина как потребность боли не управляется патч фентанила. Удаление фентанила патч на послеоперационный день 3.
3. чрескожной УЗИ
- Чтобы оценить проходимость трансплантата, выполните ультразвуковое исследование на кролика наркоз 5-7 дней после переноса генов хирургии и хирургии вен трансплантата.
- Обернуть кролика наркоз надежно в одеяло и место кролик лежа в ветеринарных V-корыто с его шеи продлен. Бритье шеи, или в случае необходимости, удалять волосы с агентом для депиляции. Нанесите гель УЗИ шеи и выполнить ультразвуковое исследование.
Примечание: Ультразвуковое исследование осуществляется также на наркотизированных кроликов в то время как ген передачи и терминала трансплантата урожай хирургия изучить проходимость трансплантата и измерить диаметр просвета трансплантата. Экзамен делается непосредственно перед очистки шеи и выполняется аналогичным образом для кроликов наркозом.
- Обернуть кролика наркоз надежно в одеяло и место кролик лежа в ветеринарных V-корыто с его шеи продлен. Бритье шеи, или в случае необходимости, удалять волосы с агентом для депиляции. Нанесите гель УЗИ шеи и выполнить ультразвуковое исследование.
4. ген передачи хирургия выполнена ~ 28 дней после размещения трансплантата (выживание хирургии)
- Подготовка инструментов и поле стерильным.
- Выполните шаги 2.1.1-2.1.3. в сосудистая хирургия трансплантата.
- Пусть помощник асептически открыть следующее оборудование и либо передать его к хирургу или поместить его на таблице инструмент: шесть 1 мл-шприцы (с иглой), один шприц 3 мл, один 20 мл шприц, 1 игла 21 G, одноигольные 19-G, шовный материал PGA 3-0 , Шовный материал PGA 5-0, 7-0 полипропилен шовный материал, два 24 G IV катетеры и зонд поток стерильного крови.
- Выполните шаги 2.1.5-2.1.6. в сосудистая хирургия трансплантата.
- Подготовить один шприц 1 мл с 1 мл DMEM для мытья артерии и Вены трансплантата и подготовить два 1-мл шприцы с вирусом решения (~ 0,5-0,7 мл вирус решение/вен трансплантата). Пусть помощник оттепель вирус и развести его в среде DMEM. Подготовьте один шприц 3 мл с 0,5 мл лидокаина/бупивакаин (50/50 смесь, шаг 1.2.4).
- Выполните шаг 2.1.8 в сосудистая хирургия трансплантата.
- Изоляция вен графтов и прилегающих сонных артерий
Примечание: 2 x хирургические лупы должно использоваться для этой части.- Вырезать кожу с electrocautery вдоль средней линии между грудной вырез и нижней челюсти (приблизительно 7-9 см в длину) и зажим открыть кожи с полотенце зажимы. 0,5 мл лидокаина/бупивакаин (50/50 смесь, шаг 1.2.4) обратиться в подкожной клетчатке.
- В конце хвостового сделайте короткие боковые прорезать фасции с электрокоагуляции. Тупо вскрыть под фасции вдоль всей средней линии. С электрокоагуляции рассекала расчлененных фасции вдоль средней линии.
- Начните с правой стороны. Вскрыть между sternohyoid мышц, наложение трахеи и V-образный sternocephalic мышц, подвергать вен трансплантата. Тщательно изолируйте вен трансплантата и 1,5-2,0 см сонной артерии, прилегающих к трансплантат по бокам краниально и каудально.
- Повторите рассечение на левой стороне после шаг 4.2.3.
- Измерения потока крови в Вену графтов.
- Заполните полость хирургической раны на правой стороне с физиологическим для включения передачи звуковых волн. Погружать 2-мм периваскулярной потока зонд (подключенных к тома-расходомер) в физиологического раствора в полость раны и равным нулю, скорость потока.
- Место датчик потока вокруг сонной артерии, хвостовой или краниально к трансплантат вен. Запись данных из потока зонд с системой сбора электронных данных.
- Повторите измерение потока на левой стороне после шаг 4.3.2.
- Вычислите пульсации, основанные на пик скорости систолического потока, минимальная диастолического скорость потока и средний расход. Также Вычислите ламинарные касательное напряжение, основанный на скорости потока и диаметр просвета (измеряется с чрескожной УЗИ).
- Влить вектор решения в духе графтов
Примечание: Хирургический микроскоп (16 X) используется при необходимости для прокола, вливания и ремонт сонной артерии.- Есть помощник удаления хирург хирургического лупы и переместить хирургический микроскоп в позицию. У хирурга драпировать полотенцем стерильные через микроскоп. Стерильные полотенце позволяет хирургу манипулировать микроскопа при сохранении стерильности.
- Помощник вставки гепарина (150 МЕ/кг) в IV катетера и промыть соленой.
- Используйте драйвер большой иглы согнуть иглой 21 G примерно 80 ° чуть выше скоса (не сгибайте фаски; Рисунок 2A).
- Зажим общей сонной артерии на каждом конце трансплантата вен с мини зажимы, размещение черепной зажим сначала позволяет артерии заполнения, а затем размещения хвостового клип. Место хвостового клип приблизительно 10 мм хвостовой анастомоза, чтобы оставить место для arteriotomy.
- Положить два шелковый галстук вокруг артерии просто хвостового трансплантата и галстук один зашитый узел на каждый - не затягивая их.
- Прокол сонной каудально к трансплантат с изогнутой иглой 21 G точно краниально хвостового сосудистой клипа. Будьте осторожны, чтобы не протыкайте задней или боковой стены. Заранее иглу в просвете back-and-forth дважды, чтобы убедиться, что просвет ясно, затем тщательно снять иглу.
Примечания: Общей сонной пункция может помочь, схватив артериальной адвентиции тонкой пинцетом и осторожно подняв передней стенки при вставке кончик иглы просто каудально к точке подъема (рисA). Это уменьшает риск попадания на задней стенке с иглой. - С несколькими развернулось марлевые подушечки создайте гнездо для размещения шприц используется для инфузий. Место это гнездо марлевые каудально к хирургической сайта.
- Надели шприцем с DMEM-только 24 G IV-катетер и затяните катетер на шприц достаточно для предотвращения утечки (шприц будут удалены позже в этом хирургии) и согнуть катетер ~ 4 мм от кончика так что изгиб занимает около 75 ° после того, как она будет выпущена.
- Вставьте IV катетер в общей сонной arteriotomy до точки изгиба и мыть трансплантата просвета вены дважды с 0,5 мл DMEM. Для каждого повторения заполняют DMEM вен трансплантата. Затем удалите DMEM из лоскута, слегка нажав с пальца в перчатке в краниально конец трансплантата. Аккуратно вставьте палец в хвостовой конец трансплантата для промывки Люминал содержимое через arteriotomy.
- Удаление DMEM шприц из катетера, оставляя катетера в сосуд. Соедините шприц, содержащая вирус решение, убедившись, что воздух не вводит катетер. Перемещение, что слабо завязывают шелковые галстуки вниз артерии, до тех пор, пока они вокруг катетера, но не затягивайте их.
- Влить 0,03 мл раствора вирус подтолкнуть остальных DMEM из катетера. Удалите все жидкости из трансплантата просвета вены с пальцем, нажав осторожно от черепа до хвостового.
- Затяните два связей вокруг кончика артерии и катетер для герметизации люмен. Влить раствор вирус пока растянутый ключе. Аккуратно сложить шприц на гнездо марлей.
Примечание: Жизненно важно что трансплантат вен расширяет его предварительно трансдукции калибра и остается завышенные во время инфузии вирус. Если нет, то будет значительно сократилось количество переноса генов. - Оставьте раствор содержащего вирус в просвете Вены трансплантата для 20 мин, а затем заменить придает катетер с пустой шприц шприц содержащий вирус. Аккуратно аспирационная вирус содержащих раствор из лоскута до тех пор, пока судно разрушается. Удалите шприц, оставляя катетер на месте. Вырезать и развязать шелковыми швами и снимать катетер с судна. Удаление катетера из сонной артерии тщательно, чтобы избежать повреждения эндотелия.
- С помощью хирургический Микроскоп закройте arteriotomy с 7-0 полипропилен шва с помощью X-модели (рис. 2B).
- Возьмите шовный материал с иглодержателя, введите судна в правом нижнем углу arteriotomy и выход судна в левом нижнем. Крест открытия вне судна и сделать второй проход от сверху справа до левого.
- Перед затягиванием шовный материал, кратко релиз черепной сосудистой клип для очистки воздуха и остаточной вирус от трансплантата Вены и артерии. Кровь будет течь из arteriotomy, когда выпущена зажим.
- Закройте arteriotomy, осторожно потянув шов заканчивается и связать их вместе с 2 площади узлов.
Примечание: Потянув шовный материал слишком туго вызовет гармошки ткани, которая будет беспокоить потока, увеличить риск тромбоза и потенциально ввести неконтролируемых переменных.
- Релиз черепной сосудистой клип, а затем хвостового клип. Остановите любое кровотечение с помощью Марли, чтобы применить легкое давление.
- Примерно в это время придать бупренорфин (SQ, 0,02 мг/кг) для предоставления послеоперационной анальгезии, пока патч фентанила оказывает болеутоляющее фентанила плазменные уровни.
Примечание: Дополнительные бупренорфина инъекции (SQ, 0,02 мг/кг) может быть необходимым 6 h после первой инъекции для поддержания анальгезии, пока плазмы фентанила достигает терапевтической концентрации. - Повторите вирус настой протокол на левой стороне, следующие шаги 4.4.5-4.4.15.
- Ушивание раны
- Закройте подкожной клетчатки с 5-0 PGA шовный материал, с помощью непрерывного шаблона. Закройте кожи с 3-0 PGA шва с помощью внутрикожные модели. Бери узлов на обоих концах.
- Послеоперационное восстановление, очистка и уход
- Выполните шаг 2.4.
5. урожай хирургии (терминал)
- Подготовка документов и хирургической сайта.
- Выполните шаги 2.1.1-2.1.3 в сосудистая хирургия трансплантата.
- Пусть помощник открыть и асептически место на таблице инструмента (или передать хирург): один 20 мл шприц, 1 игла 21G, Шелковый шов 3-0 и зонд поток стерильного крови.
- Выполните шаги 2.1.5-2.1.6 и 2.1.8 вен хирургия трансплантата.
- Изоляция общих сонных артерий и вен графтов
- Вырезать кожу с electrocautery вдоль средней линии между грудной вырез и нижней челюсти (приблизительно 7-9 см в длину) и зажим кожи шеи кролика для полотенца с полотенцем зажимы.
- В конце хвостового сделайте короткие боковые прорезать фасции с электрокоагуляции. Тупо вскрыть под фасции вдоль всей средней линии. Прорезать расчлененных фасции вдоль средней линии с электрокоагуляции.
- Начните с правой стороны. Вскрыть между sternohyoid мышц, обволакивающие трахеи и V-образный sternocephalic мышцы, чтобы разоблачить общей сонной артерии и Вены трансплантата.
- Вскрыть правильном ключе трансплантата и общей сонной артерии, свободный от окружающих тканей. Используйте хирургические кремния петли для втягивания артерии и Вены трансплантата во время вскрытия.
- Повторите рассечение на левой стороне после 5.2.3-5.2.4 шаги.
- Производить измерения потока, следующие шаги 4.3.1-4.3.3 в хирургии передача генов.
- Урожай вен графтов
- С 3-0 Шелковый шов перевязать правой общей сонной артерии, краниально к трансплантат. Затем перевязать сонной каудально к трансплантат.
- Акцизный правильном ключе трансплантата, разделив прилегающих сонной артерии между каждым из перешнуровок и прилегающих анастомоза. Удаление вен трансплантата из кролика и промойте просвет с saline.
- Трим сонной артерии и анастомозов с обоих концов трансплантата вен. Трим прочь избыток adventitial ткани из вен трансплантата и вырезать трансплантата на сегменты, необходимые для анализа другой конечной точке.
- Урожай левой Вены трансплантата, повторив шаги 5.4.1-5.4.3.
- Придать 1 мл фенитоин/Пентобарбитал IV чтобы усыпить кролика.
- Распоряжаться любой отходов следующие соответствующие протоколы для биологической и колюще-режущих отходов утилизации отходов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Техническое знание нового оператора должны быть проверены, прежде чем оператор может использовать этот метод для создания экспериментальных данных. Первая веха, что необходимо достичь нового оператора является проходимость трансплантата последовательной вен после первоначального пересадка вен хирургия и последующие задержки трансдукции хирургии. Свыше 90% проходимость после каждой операции является желательным и достижимыми. Проходимость можно оценить неинвазивно с помощью чрескожной УЗИ, который мы обычно выполняют на 5-7 день после операции. В кроликов с патентной вен ультразвуковое исследование покажет большой кровеносный сосуд с бойкая хвостового к черепной кровотока по обе стороны передней шеи (рисA). Если любой из вен графтов закрыта, будет не обнаружено хвостового к черепной кровотока на изображены с перекрытых трансплантата. Однако черепно до хвостового кровотока по-прежнему будут обнаружены в внутренней яремной (рис. 3B).
Второй этап должен обеспечить новый оператор является эффективным трансдукции вен трансплантата эндотелиальных клеток. Здесь аденовирусных вектор, который выражает β-галактозидазы используется для оценки эффективности переноса генов эндотелия. Оператор new в нашей лаборатории преобразованы вен графтов с аденовирус, выражая β-галактозидазы (AdnLacZ) с использованием методов, описанных. Графтов заготовленной 3 дней после трансдукция и нарезать сегменты. Некоторые сегменты окрашивали 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal). EN лицом изображений Люминал поверхностей показал графтов вен с эффективным трансдукции (рис. 4A) и бедных трансдукции (Рисунок 4B). Для дальнейшей оценки квалификации оператора new, β-галактозидазы мРНК в экстрактах трансплантата transduced вен также измеряется с помощью количественного PCR обратная транскриптаза опосредованной и нормализации сигнала на уровень фосфата Глицеральдегид Дегидрогеназа мРНК (GAPDH) измеряется в том же ключе графтов.
Уровни mRNA β-галактозидазы в Вену графтов преобразованы оператором new не были существенно отличается от уровня мРНК β-галактозидазы в Вену графтов преобразованы опытным оператором (рис. 5). Если не доступны для сравнения образцов mRNA от вен графтов преобразованы опытным оператором, отрицательный контроль вен трансплантата, которую мРНК могут быть получены путем преобразования вен графтов с вектором не выражая управления (AdNull). Мы обнаружили, что средние уровни mRNA β-галактозидазы в духе, который графтов преобразованы опытным оператором приблизительно Гарибова выше фонового сигнала ПЦР для β-галактозидазы мРНК, измеряется в AdNull преобразованы графтов (рис. 5) .
Рисунок 1 . Размещение обращенном право внешней яремной вены направо общей сонной артерии лоскута с конец в бок анастомозов. Трансплантат вен (синий) зашивается для общей сонной артерии (красный) на два анастомозов. На каждом анастомоза, швы (белый Икса) нумеруются в порядке, в котором они расположены. Для обоих анастомозов стежка 1 швы хвостовой конец arteriotomy к внешним яремной вены. Стежка 2 швы краниального конца arteriotomy к внешним яремной вены. Стежка 3 помещается на боковой стороне анастомоза в точке, равноудаленной от первых двух строчек. Стежка 4 помещается на медиальной стороне анастомоза, равноудаленной от первых двух строчек и напротив строчки 3. Четыре дополнительных швов (швы 5-8) находятся на полпути между четырех существующих стежков. Сонная артерия сегмента между анастомозов перевязано на обоих концах с 3-0 шелковыми швами (стрелки) и разделили (пунктирная линия) на полпути между лигатуры. Левосторонней графтов выполняются аналогичным образом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Создание и закрытие сонной arteriotomy. (A) общей сонной артерии адвентиции держаться вблизи трансплантата вен с тонкой щипцами и восходящей тяги применяется к стенке артерии. Это создает вертикальную поверхность, позволяя изогнутой иглой 21 G вставляемый приблизительно параллельно судна люмен, уменьшается риск прокола на задней стенке артерии. (B) arteriotomy зашивается с помощью 7-0 полипропилен в X-шаблон. Первый проход шовные входит в просвет артерии в нижней правой части arteriotomy (сайт 1) и выходит из просвета в левом нижнем углу (узел 2). Шовный материал затем пересекает arteriotomy. Следующий этап повторно входит просвета в правом верхнем углу (сайт 3) и выходит из просвета в левом верхнем углу (сайт 4). Нежной тяги на концах шовный материал (концы выход из сайт 1 и 4) закрывает arteriotomy. Концы швов связаны с 2 площади узлов. Сплошной синий круги показывают места, где шов проникает артериальной стенки. Сплошной синий линии показывают, где шов проходит вне артериальной стенки; синие пунктирные линии указывают, что шов расположен внутри просвета. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Чрескожная ультразвуковых изображений шеи кролика, оценки вен проходимость трансплантата 5-7 дней после прививки. (A) патент вен трансплантата (красный) с кровотока в хвостовой к черепной направлении является (стрелка). (B) окклюзии вен трансплантата. Обнаружено никакого хвостового к черепной кровотока (который будет отображаться красный). Внутренней яремной (синий) с кровотока в черепно до хвостового направлении указывается (звездочка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Трансген выражение бета галактозидазы в Вену графтов. 28 дней после прививки, кролик вен графтов были преобразованы на 20-мин инкубации аденовирусных векторов, выражая β-галактозидазы в люмен хирургически изолированных вен графтов. Вен графтов были заготовленной 3 дней после трансдукция и витражи с 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside. (A) En лицом изображение поверхности Люминал вен сегмента показаны эффективные трансдукции. (B) En лицом изображение поверхности Люминал вен сегмента показаны бедных трансдукции. Шкалы бар = 1.0 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Выражение бета галактозидазы (β-gal) трансген мРНК в Вену трансплантата сегментов. 28 дней после размещения яремной взаиморасположение графтов в кролика аорт, графтов были преобразованы с аденовирусных вектор, выражая бета галактозидазы (AdnLacZ) или аденовирусных вектор управления, не выразить трансген (AdNull ). Операции были завершены к опытным оператором (хирург 1) или оператор new (хирург-2). Вен графтов преобразованы с AdnLacZ были все собранные 3 дней после трансдукции. РНК, извлеченные из графтов преобразованы с AdNull и собирают через 14 дней после трансдукции также проанализировали, как отрицательный контроль. Выражение mRNA бета галактозидазы был количественно количественного PCR обратная транскриптаза опосредованной, с значения нормированы Глицеральдегид фосфат дегидрогеназа мРНК измеряется в том же экстракты и выраженная в произвольных единицах (АС). Бары указывают средние значения; p значений от ранга сумма испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшие шаги в этом протоколе включают управление анестезии, Антисвертывающая, хирургические манипуляции Вены, артерии/привитые и гемодинамических измерения привитые Вены. Надлежащее управление анестезия имеет решающее значение в этой несколько выживания хирургии модели, которая включает в себя две относительно длинные операции (обычно 3-3,5 ч для двусторонней связи прививки и 1,5-2,5 ч для двусторонних трансплантата трансдукция). Мы ведении анестезии через ураном и эндотрахеальной интубации и обнаружили, что интубации улучшила выживание после операции трансдукции трансплантата, возможно потому, что вентиляция под положительным давлением предотвращает ателектаз и связанные дыхательной недостаточности. Кролики являются сложными для интубации, и связанных с интубации сократимость травма может привести к послеоперационным Стридор. Однако проблемы и осложнения интубации, маленькая цена, чтобы платить в интересах ликвидации большинства периоперационных заболеваемости и смертности, связанных с прививочных хирургии вен.
Антикоагуляционную имеет важное значение для того, чтобы предотвратить тромбоз привитые вен, которые могут возникнуть после любой из операций выживания. Тромбозы, по-видимому, раннем послеоперационном событие, потому что графтов вен, которые патент на чрескожной УЗИ 5-7 дней после операции почти всегда патент на урожай. Для предотвращения тромбоза после первой операции (т.е., вен прививки), IV гепарина осуществляется до уборки первого внешнего яремной вены. Основываясь на период полувыведения плазмы гепарина в кроликов (1-2 ч), еще половину дозы гепарина IV осуществляется до уборки контралатеральной внешней яремной вены. Кроме того до тех пор, пока оба артериовенозных анастомозов отдельных вен трансплантата полной, мы флеш люмен сонной артерии и Вены трансплантата примерно каждые 8 мин с гепаринизированным физиологическим. Чтобы избежать трансплантата тромбоза, следует позаботиться чтобы не повредить вен трансплантата особенно эндотелий-во время сбора урожая и прививки. Это включает в себя нежный обработка Вены с хирургических инструментов и оставляя тонкий слой adventitial жировой ткани придает Вену. Мы также управлять одной дозы актуальные папаверин привитые сонной артерии, чтобы предотвратить или обратный спазм сосудов, которые могли бы способствовать тромбоза.
Тщательное внимание к хирургической техники требуется во время прививки хирургии вен. Чтобы избежать кровотечения на анастомозов, тромбоз трансплантата и введение неконтролируемого гемодинамики переменных, два arteriotomies должны быть правильной длины. Если arteriotomy является слишком коротким, вен трансплантата Лютая стена будет излишним на сайте анастомоза, создавая пробелы, которые позволяют кровотечения. Если arteriotomy является слишком длинным, растяжения вен для покрытия arteriotomy принесет Вену трансплантата стены в непосредственной близости, что затрудняет для хирурга во избежание ушивание сопротивляясь вен трансплантата стены вместе (по существу гарантирующих послеоперационные Тромбоз сосудов). Кроме того если просвет вен трансплантата сужается, потому что Вены было протягивано для покрытия чрезмерно длинный arteriotomy, стеноз будет создан, увеличивает напряжение сдвига, предрасполагает к тромбоз33и потенциально изменяет переменные показатели, такие как neointimal рост и сосудистого ремоделирования34,35. Кроме того важно избежать введения повороты в Вену трансплантата, которое может привести к сужению просвета или ненормальное потока. Чтобы помочь избежать скручивания трансплантата, мы всегда выравнивание сегмента вен вдоль вентральной поверхности общей сонной артерии и убедитесь, что есть без поворотов в ключе. Ввиду возможности появления переменной хирургической техники для изменения вен трансплантата гемодинамики, и потому, что изменения гемодинамики могут повлиять на исход переменных независимо от лечения, мы регулярно измерять диаметр потока и трансплантата крови перед вливанием вектор и на время сбора урожая. Мы используем эти значения для вычисления касательное напряжение и пульсации. Вен графтов с гемодинамическим измерений вне заданных диапазонов могут быть объективно исключены из дальнейшего анализа, уменьшение экспериментальной изменчивости и увеличение статистической мощности.
Как мы разработали этот метод, мы сделали несколько модификаций. Первоначально мы пытались перенос генов трансплантата вен во время прививочных операции. Однако в этих обстоятельствах трансген выражение почти полностью погибла на 3 дня после передачи гена22. Трансген выражение было быстро потеряли ли вен сегмент был transduced на месте и затем привитые или же Вену был привитые сначала и затем преобразованы. Только путем задержки трансдукции до, после Вены трансплантата адаптировалась к артериальной циркуляции (мы ждали до 28 дней после прививки для выполнения переноса генов, хотя возможно короткие задержки), был быстрой потере трансген выражения избегать22 . Мы также преобразовать от анестезии доставлено ураном эндотрахеальной трубки доставлены анестезии для второй операции (перенос генов) после испытывают интраоперационной и послеоперационной смертности. Кроме того после возникновения очевидной аспирационной пневмонии в послеоперационном периоде кролика, мы начали место небольшой пластиковый стол на живот кролика (под стерильную шторы). Таблица была позиционируется для предотвращения хирург от случайно, опираясь на живот кролика, потенциально стимулирующее гастроэзофагеальной рефлюксной болезни и аспирации. У нас было не больше событий в стремление после размещения таблицы. Однако потому что это размещение совпал с переходом к эндотрахеальной интубации, мы не можем быть уверены какой вмешательство отвечает за устранение стремление события.
Этот метод также имеет ограничения. В Соединенных Штатах использование кроликов вместо грызунов требует соблюдения требований закона об обеспечении благосостояния лабораторных животных от 1966 года. Таким образом следователи, используя кроликов (или других животных, охватываемых настоящим законом) необходимо иметь хорошо оборудованных операционных залов и экспертов анестезиологов и обеспечивают высокий уровень послеоперационного наблюдения и ухода. Второй недостаток-это что 2 операции необходимы для того, чтобы обеспечить постоянное трансген выражение22. Вторая операция увеличивает стоимость экспериментов и предоставляет каждый кролик в дополнительный набор возможностей оперативного и периоперационных осложнений. Однако мы не осведомлены о любой другой подход передачи гена, который достигает прочный трансген выражение в Вену графтов. Третье ограничение этого метода является, что она требует опыта в строительстве HDAd векторов и подготовке высокого титра HDAd запасов. Многие лаборатории имеют опыт с первого поколения аденовирусных, лентивирусные и аденоассоциированный вирусных векторов (AAV), но относительно немногие группы имеют опыт работы с HDAd и как правило необходимо будет наладить сотрудничество для получения этого опыта. Клинические применимость метода также может быть ограничен. Для людей вторая операция приведет к увеличению стоимости и сложности рисков. Кроме того по сравнению с человека подкожной вены (используется для коронарных и периферических обхода кабинетов), кролик, внешние яремной вены имеют очень тонкие стенки. Вполне возможно, что стены утолщение и ремоделирования, что происходит после прививки кролика внешней яремной вены в артериальной обращение будет ослаблять если вены трансплантата уже имеет толстые стены. Наконец в экспериментах в этой модели, продолжительностью до 6 месяцев, ни один из привитых вен разработал стенозом22. Таким образом этот метод не представляется модель всех биологических процессов, которые способствуют вен отказа трансплантата.
В заключение метод использует надежную модель животных человека сосудистых заболеваний (кроликов) для создания привитые вен, в которых трансгенов стабильно выражаются для длительных периодов времени (по крайней мере 6 месяцев)22. Стабильные выражение трансгенов в Вену графтов покажет их роли в нормальной ключе графт гомеостаза и будет уточнить их потенциал для вен трансплантата генной терапии. Метод может улучшить и сделал более клинически применимые к разработке методов, которые позволяют перкутанная доставку векторов в Вену трансплантата, избегая тем самым вторую операцию. Эти методы могут быть на основе катетер36,37, или они могут включать специально подготовленные векторов, которые вводят в периферическую вену и затем мишенью в Вену трансплантата стену, например магнитные поля38. Этот метод позволит также тестирование векторов помимо HDAd вен трансплантата генной терапии, включая лентивирусные векторы AAV, а также не вирусных векторов. 39 , 40 , 41 , 42
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposables | |||
| 3mL syringe with 24G needle | Becton Dickinson | 309571 | 2x for vein graft surgery; 2x for gene transfer surgery |
| 1 mL syringe with 27G needle | Becton Dickinson | 309623 | 2x for vein graft surgery, 5x for gene transfer surgery |
| 19G needle | Becton Dickinson | 305187 | Gene transfer surgery |
| 20 mL syringe, luer lock | Nipro Medical Corp | JD+20L | |
| Catheters, 24Ga x 3/4” | Terumo Medical Products | SROX2419V | |
| 21G needle | Becton Dickinson | 305165 | Gene transfer surgery and for 20 mL syringe of saline |
| Gauze 4” x 4” | Dynarex | 3242 | ~10-15 per surgery |
| 3-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-244 | |
| 5-0 silk suture | Covidien Ltd. | S-182 | |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8703P | Vein graft surgery |
| 7-0 polypropylene suture | CP Medical | 8648P | Gene transfer surgery |
| 5-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 421A | |
| 3-0 polyglycolic acid suture | CP Medical | 398A | |
| Alcohol swabs | Covidien Ltd. | 6818 | For the placement of I.V. line |
| Catheter plug | Vetoquinol | 411498 | |
| Ketamine HCl, 100 mg/mL | Vedco Inc. | 5098916106 | |
| Xylazine, 100 mg/mL | Akorn Inc. | 4821 | |
| Lidocaine, 20 mg/mL | Pfizer | 409427702 | |
| Marcaine 0.5% | Pfizer | 409161050 | |
| Beuthanasia D-Special | Intervet Inc. | NDC 00061047305 | Harvest surgery only |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/mL | Patterson Veterinary | 12496075705 | |
| Saline IV bag, 0.9% sodium chloride | Baxter | 2B1309 | |
| Heparin (5000 U/mL) | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-047-10 | |
| Papaverine (3.5 mg/ml) | American Reagent Inc. | NDC 0517-4002-25 | Diluted from 30mg/mL stock; Use 1 mL maximum |
| Fentanyl patch, 25 mcg/h | Apotex Corp. | NDC 60505-7006-2 | |
| Isoflurane | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Viral vector | Gene transfer surgery only | ||
| Surgical Instruments | |||
| Metzenbaum needle holder 7" straight | Roboz | RS-7900 | |
| Operating scissors 6.5" straight blunt/blunt | Roboz | RS-6828 | |
| Needle holder /w suture scissors | Miltex | 8-14-IMC | |
| Castroviejo scissors | Roboz | RS-5658 | |
| Castroviejo needle holder, 5.75" straight with lock | Roboz | RS-6412 | |
| Stevens scissors 4.25" curved blunt/blunt | Roboz | RS-5943 | |
| Alm retractor 4" 4X4 5mm blunt prongs | Roboz | RS-6514 | 2x |
| Backhaus towel clamp 3.5" | Roboz | 4x | |
| Micro clip setting forceps 4.75" | Roboz | RS-6496 | |
| Micro vascular clips, 11 mm | Roboz | ||
| Surg-I-Loop | Scanlan International | 1001-81M | 5 cm length |
| Bonaccolto forceps, 4” (10 cm) long longitudinal serrations, cross serrated tip, 1.2mm tip width | Roboz | RS-5210 | |
| Dumont #3 forceps Inox tip size .17 × .10 mm | Roboz | RS-5042 | |
| Graefe forceps, 4” (10 cm) long serrated straight, 0.8 mm tip | Roboz | RS-5280 | |
| Halstead mosquito forceps, 5" straight, 1.3 mm tips | Roboz | RS-7110 | 2x |
| Halstead mosquito forceps, 5" curved, 1.3mm tips | Roboz | RS-7111 | |
| Jacobson mosquito forceps 5" curved extra delicate, 0.9 mm tips | Roboz | RS-7117 | |
| Kantrowitz forceps, 7.25" 90 degree delicate, 1.7 mm tips | Roboz | RS-7305 | |
| Tissue forceps 5", 1X2 teeth, 2 mm tip width | Roboz | RS-8162 | |
| Allis-Baby forceps, 12 cm, 4x5 teeth, 3 mm tip width | Fine Science Tools | 11092-12 | 2x |
| Adson forceps, 12 cm, serrated, straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Veterinary electrosurgery handpiece and electrode | MACAN Manufacturing | HPAC-1; R-F11 | |
| Surgical Suite Equipment | |||
| Circulating warm water blanket and pump | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Bair hugger warming unit | 3M | Model 505 | |
| IV infusion pump | Heska | Vet IV 2.2 | |
| Isoflurane vaporizer and scavenger | Multiple vendors | Catalog number not available | |
| Veterinary multi-parameter monitor | Surgivet | Surgivet Advisor | |
| Veterinary electrosurgery unit | MACAN Manufacturing | MV-9 | |
| Surgical microscope | D.F. Vasconcellos | M900 | 25X magnification for vein graft surgery; 16X magnification for gene transfer surgery |
References
- Libby, P., Bornfeldt, K. E., Tall, A. R. Atherosclerosis: Successes, Surprises, and Future Challenges. Circ Res. 118, 531-534 (2016).
- Fowkes, F. G., et al. Comparison of global estimates of prevalence and risk factors for peripheral artery disease in 2000 and 2010: a systematic review and analysis. Lancet. 382, 1329-1340 (2013).
- Mohr, F. W., et al. Coronary artery bypass graft surgery versus percutaneous coronary intervention in patients with three-vessel disease and left main coronary disease: 5-year follow-up of the randomised, clinical SYNTAX trial. Lancet. 381, 629-638 (2013).
- de Vries, M. R., Simons, K. H., Jukema, J. W., Braun, J., Quax, P. H. Vein graft failure: from pathophysiology to clinical outcomes. Nat Rev Cardiol. 13 (8), 451-470 (2016).
- Harskamp, R. E., Lopes, R. D., Baisden, C. E., de Winter, R. J., Alexander, J. H. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions. Ann Surg. 257, 824-833 (2013).
- Sabik, J. F. Understanding saphenous vein graft patency. Circulation. 124 (3), 273-275 (2011).
- Owens, C. D., Ho, K. J., Conte, M. S. Lower extremity vein graft failure: a translational approach. Vasc Med. 13, 63-74 (2008).
- Robertson, K. E., McDonald, R. A., Oldroyd, K. G., Nicklin, S. A., Baker, A. H. Prevention of coronary in-stent restenosis and vein graft failure: does vascular gene therapy have a role. Pharmacol Ther. 136, 23-34 (2012).
- Yla-Herttuala, S., Baker, A. H. Cardiovascular Gene Therapy: Past, Present, and Future. Mol Ther. 25, 1095-1106 (2017).
- Schwartz, L. B., et al. Adenoviral-mediated gene transfer of a constitutively active form of the retinoblastoma gene product attenuates neointimal thickening in experimental vein grafts. J Vasc Surg. (5), 874-881 (1999).
- Eefting, D., et al. Local lentiviral short hairpin RNA silencing of CCR2 inhibits vein graft thickening in hypercholesterolemic apolipoprotein E3-Leiden mice. J Vasc Surg. 50, 152-160 (2009).
- Handa, M., et al. Adventitial delivery of platelet-derived endothelial cell growth factor gene prevented intimal hyperplasia of vein graft. J Vasc Surg. 48 (6), 1566-1574 (2008).
- Kloppenburg, G. T., Grauls, G. E., Bruggeman, C. A., Stassen, F. R. Adenoviral activin A expression prevents vein graft intimal hyperplasia in a rat model. Interact Cardiov Th. 8, 31-34 (2009).
- Eefting, D., et al. A novel urokinase receptor-targeted inhibitor for plasmin and matrix metalloproteinases suppresses vein graft disease. Cardiovasc Res. 88, 367-375 (2010).
- Eichstaedt, H. C., et al. Gene transfer of COX-1 improves lumen size and blood flow in carotid bypass grafts. J Surg Res. 161, 162-167 (2010).
- Kritz, A. B., et al. In vivo modulation of Nogo-B attenuates neointima formation. Mol Ther. 16 (11), 1798-1804 (2008).
- Peroulis, M., et al. The role of ex-vivo gene therapy of vein grafts with Egr-1 decoy in the suppression of intimal hyperplasia. Eur J Vasc Endovasc. 40, 216-223 (2010).
- Kochanek, S., et al. A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and b-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5731-5736 (1996).
- Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: Removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. P Natl Acad Sci USA. 93, 13565-13570 (1996).
- Chen, H. -H., et al. Persistence in muscle of an adenoviral vector that lacks all viral genes. P Natl Acad Sci USA. 94, 1645-1650 (1997).
- Wen, S., Graf, S., Massey, P. G., Dichek, D. A. Improved vascular gene transfer with a helper-dependent adenoviral vector. Circulation. 110, 1484-1491 (2004).
- Du, L., Zhang, J., Clowes, A. W., Dichek, D. A. Efficient gene transfer and durable transgene expression in grafted rabbit veins. Hum Gene Ther. 26, 47-58 (2015).
- Channon, K. M., et al. Efficient adenoviral gene transfer to early venous bypass grafts: comparison with native vessels. Cardiovasc Res. 35, 505-513 (1997).
- Flynn, R., et al. Expression of apolipoprotein A-I in rabbit carotid endothelium protects against atherosclerosis. Mol Ther. 19, 1833-1841 (2011).
- George, S. J., et al. Sustained Reduction of Vein Graft Neointima Formation by Ex Vivo TIMP-3 Gene Therapy. Circulation. 124, 11 Suppl 135-142 (2011).
- Chiu-Pinheiro, C. K., et al. Gene transfer to coronary artery bypass conduits. Ann Thorac Surg. 74, 1161-1166 (2002).
- Byrom, M. J., Bannon, P. G., White, G. H., Ng, M. K. Animal models for the assessment of novel vascular conduits. J Vasc Surg. 52, 176-195 (2010).
- Ribichini, F., et al. Effects of oral prednisone after stenting in a rabbit model of established atherosclerosis. J Am Coll Cardiol. 50, 176-185 (2007).
- Langheinrich, A. C., et al. Quantification of in-stent restenosis parameters in rabbits by Micro-CT. Rofo. 177 (4), 501-506 (2005).
- Wacker, B. K., Dronadula, N., Zhang, J., Dichek, D. A. Local Vascular Gene Therapy With Apolipoprotein A-I to Promote Regression of Atherosclerosis. Arterioscler Thromb. 37, 316-327 (2017).
- Zwolak, R. M., Kirkman, T. R., Clowes, A. W.
- Qiang, B., et al. Statin therapy prevents expansive remodeling in venous bypass grafts. Atherosclerosis. 223, 106-113 (2012).
- Casa, L. D. C., Ku, D. N. Thrombus Formation at High Shear Rates. Annu Rev Biomed Eng. 19, 415-433 (2017).
- Chen, C., Coyle, K. A., Hughes, J. D., Lumsden, A. B., Ku, D. N. Reduced blood flow accelerates intimal hyperplasia in endarterectomized canine arteries. Cardiovasc Surg. 5 (2), 161-168 (1997).
- Binns, R. L., Ku, D. N., Stewart, M. T., Ansley, J. P., Coyle, K. A. Optimal graft diameter: effect of wall shear stress on vascular healing. J Vasc Surg. 10, 326-337 (1989).
- Oka, K., Mullins, C. E., Kushwaha, R. S., Leen, A. M., Chan, L. Gene therapy for rhesus monkeys heterozygous for LDL receptor deficiency by balloon catheter hepatic delivery of helper-dependent adenoviral vector. Gene Ther. 22, 87-95 (2015).
- Miyake, T., et al. Prevention of neointimal formation after angioplasty using nuclear factor-kappaB decoy oligodeoxynucleotide-coated balloon catheter in rabbit model. Circ Cardiovasc Interv. 7, 787-796 (2014).
- Chorny, M., et al. Site-specific gene delivery to stented arteries using magnetically guided zinc oleate-based nanoparticles loaded with adenoviral vectors. FASEB J. 27, 2198-2206 (2013).
- Hoshino, K., et al. Three catheter-based strategies for cardiac delivery of therapeutic gelatin microspheres. Gene Ther. 13, 1320-1327 (2006).
- Nouri, F., Sadeghpour, H., Heidari, R., Dehshahri, A. Preparation, characterization, and transfection efficiency of low molecular weight polyethylenimine-based nanoparticles for delivery of the plasmid encoding CD200 gene. Int J Nanomed. , 5557-5569 (2017).
- Jia, S. F., et al. Eradication of osteosarcoma lung metastases following intranasal interleukin-12 gene therapy using a nonviral polyethylenimine vector. Cancer Gene Ther. , 260-266 (2002).
- Morishita, R., et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense cdk 2 kinase oligonucleotides. J Clin Invest. 93, 1458-1464 (1994).
