ويرد في هذه الورقة، طريقة لقياس استهلاك الأوكسجين باستخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس بيرميبيليزيد من المورفولوجية. هذا الأسلوب يتطلب مقداراً قليلاً من الأنسجة مقارنة بتقنية عزل المتقدرية الكلاسيكية وما تحقق من النتائج ذات صلة أكثر فسيولوجيا.
ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، يمثل نموذجا ناشئة لدراسة الأيض. في الواقع، المورفولوجية لها هياكل مثلى للأعضاء البشرية وامتلاك الأيضية العالية المصانة ولها عمر قصير نسبيا يسمح دراسة مختلف الآليات الأساسية في فترة قصيرة من الزمن. بيد أنه من المستغرب أن إحدى الآليات الأساسية الأيض الخلوية، التنفس المتقدرية، قد لم يتم دقة التحقيق في هذا النموذج. فمن المحتمل لأنه عادة ما يتطلب قياس التنفس المتقدرية في المورفولوجية عدد كبير جداً من الأفراد والنتائج التي تم الحصول عليها لا استنساخه بدرجة عالية. هنا، يتم وصف أسلوب يسمح للقياس الدقيق لاستهلاك الأكسجين الميتوكوندريا باستخدام كميات ضئيلة من نسيج المورفولوجية. في هذا الأسلوب، تشريح ثوراكسيس وبيرميبيليزيد على حد سواء مع الملقط حادة ميكانيكيا وكيميائيا صابونين، السماح لمركبات مختلفة عبر غشاء الخلية وتعدل التنفس المتقدرية. بعد بيرميبيليزيشن، يتم وضع بروتوكول لتقييم قدرة المجمعات المختلفة لنظام نقل الإلكترون (ETS) لأكسدة ركائز مختلفة، فضلا عن استجابتها أونكوبلير ومثبطات عديدة. ويعرض هذا الأسلوب العديد من المزايا مقارنة بأساليب استخدام العزلة المتقدرية، كما أنها ذات الصلة أكثر فسيولوجيا لأن الميتوكوندريا لا تزال تتفاعل مع المكونات الخلوية الأخرى وهو يحافظ مورفولوجية المتقدرية. وعلاوة على ذلك، نموذج الأعمال التحضيرية أسرع، والنتائج المتحصل عليها يتم استنساخه بدرجة عالية. عن طريق الجمع بين مزايا المورفولوجية كنموذج لدراسة الأيض مع تقييم التنفس المتقدرية، المهم رؤى جديدة يمكن كشف النقاب عنها، خاصة الذباب تشهد فيه مختلف البيئية أو الفيزيولوجية المرضية شروط.
ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، قد استخدمت ككائن نموذج للبحوث الوراثية لعلى مدى قرن1. دراسة هذا الكائن لم يؤد فقط إلى المعرفة الأساسية الهامة حول الميراث المرتبطة2والطفرات معدل3، تطوير الجهاز العصبي و تحديد مصير الخلية4، لكنه برز أيضا في الآونة الأخيرة أداة قيمة لدراسة الآليات الكامنة للعديد من الأمراض مثل مرض الزهايمر وباركنسون5،6. وعلاوة على ذلك، نموذج شعبية لدراسة عملية الشيخوخة، كما أنها يمكن أن تثار في عدد كبير خلال فترة قصيرة من الزمن ولها عمر قصير. كما أنها تمتلك هياكل مثلى للأعضاء البشرية، مثل قلب، oenocytes (مثل تتمثل الخلايا)، وهيئات الدهون (أداء المثل الأنسجة الدهنية البيضاء والكبد)، الأنسولين المنتجة للخلايا (ما يعادل الخلايا β البنكرياس)، فضلا عن هيموليمف نقل نواتج الأيض (يناظر دم الفقاريات)7. وعلاوة على ذلك، وسط مسارات الأيض الوسيطة (بما في ذلك مسار الإشارات الشبيهة بالانسولين/يشبه الأنسولين عامل النمو ومسارات الهدف ربمسن-تور) هي أيضا عالية حفظت7. لهذه الأسباب، استغلوا مؤخرا المورفولوجية لوصف الآليات الأساسية التي تتحكم في التمثيل الغذائي، خاصة في الحالات المرضية الملازمة للبشرية من الأمراض الأيضية مثل مرض السكري8. هو مكون رئيسي من الأيض ميتوكندريا يدمج مسارات متعددة ويقوم بواحدة من أهم وظائف بيولوجية للحياة، إنتاج ATP، عبر عملية الفسفرة (أوكسفوس). نظراً لدورها المركزي في عملية التمثيل الغذائي للكائن، فمن غير المستغرب أن خلل mitochondrial يشاركون في العديد من الأمراض مثل باركنسون9 والزهايمر من الأمراض10، وكذلك في التصلب العضلي الجانبي 11 , 12-وهم أيضا المحددات الأساسية لعملية الشيخوخة. في الواقع، فهي المنتجة الرئيسية للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) في الخلية، والتي يمكن أن تكون ضارة للخلية عند تركيزات عالية من خلال الأضرار الأكسدة11. كما ارتبطت الشيخوخة إلى تراكم الحمض النووي mitochondrial التالفة أو تحور13، ميتوفاجي الاختلالات14،15 ، فضلا عن إعاقة نشوء حيوي المتقدرية16. الميتوكوندريا هي أيضا المحددات الرئيسية للتوازن للخلية كما يمكن الاستفادة من ركائز مختلفة لضبط العديد من الوظائف الخلوية حسب وفرة أو ندرة المغذيات الكبيرة17،18.
في الواقع، المواد الغذائية المختلفة في الوجبة الغذائية (الكربوهيدرات والدهون والبروتينات) هي هضمها واستيعابها وتنقل في الخلايا. أنهم ثم تتحول في سيتوسول، وينقلون ركائز المشتقة في مصفوفة الميتوكوندريا حيث تنتج مكافئات الحد، مثل NADH والقوات المسلحة الهايتية219. ثم تتأكسد هذه المكافئات مما يقلل من مختلف مجمعات الانزيمية منظومة نقل الإلكترون (ETS). يتم تضمين هذه المجمعات في الغشاء الداخلي المتقدرية، مثل مجمع الأول و “الثاني المعقدة”. بالإضافة إلى ذلك، تمثل المجمعات الانزيمية الأخرى مثل نازعة والغليسيرول-3-الفوسفات mitochondrial ونازعه برولين طرق بديلة لدخول الإلكترونات في20،ETS21. هذه المجمعات ‘بديل’ تتسم بأهمية خاصة في الحشرات، وفقا للأنواع، وأنهم يمكن أن تشارك بنشاط زيادة التنفس20،،من2223،21. يتم نقل الإلكترونات من هذه الاختبارات تغذية النظم إلى أوبيكوينوني وفي وقت لاحق إلى “الثالث معقدة”، ثم إلى “الرابع المعقدة”، حتى يقبلون النهائي، الأوكسجين الجزيئي. نقل الإلكترون هذا يولد قوة دافع بروتون عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية القيادة الفسفرة ADP إلى ATP في “مجمع الخامس” (الشكل 1). نظراً للدور المركزي الميتوكوندريا في التوازن للخلية، دراسة الأيض المتقدرية يمثل melanogaster دال- نموذج ذات الصلة باستخدام أداة قوية لتحديد الآليات الكامنة وراء مختلف الفيزيولوجية المرضية الظروف أو تحت تؤكد الخلوية والبيئية. المثير للدهشة ومع ذلك، سوى عدد قليل من الدراسات فعلا قياس التنفس المتقدرية في المورفولوجية24،،من2526. وفي الواقع، تتطلب تجارب تهدف إلى تقييم استهلاك الأوكسجين المتقدرية عزلة الميتوكوندريا. على الرغم من فائدة لقياس وظائف المتقدرية مختلفة (مثل إنتاج روس أو نسبة P/O كعلامة لكفاءة الميتوكوندريا،من2728)، هذه العزلة عموما تتطلب كميات كبيرة بدلاً من ذلك الأنسجة من عدة أفراد24،29. هذا الشرط لكميات عالية من الأنسجة والأفراد عامل هام يحد، خاصة بالنظر إلى أن جميع الأفراد نفس السن، ويفضل أن تكون من نفس الجنس للتجارب، مما يجعل قياس التنفس في وقت مختلف يشير شاقة في أحسن الأحوال. وعلاوة على ذلك، بينما يمكن أن توفر العزلة المتقدرية كبير من التبصر في الآليات الأساسية التي تنظم الأيض المتقدرية، الأساليب المستخدمة لعزل الميتوكوندريا والعديد من العوائق مثل صعوبة الحصول على نتائج قابلة للتكرار ، تعطل شبكة الميتوكوندريا، وتحوير المتقدرية هيكل ووظيفة29،،من3031.
الهدف من هذه الدراسة تقديم بروتوكول قوية لقياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في المورفولوجية استخدام كمية ضئيلة فقط من الأنسجة من عدد قليل جداً من الأفراد. يتألف هذا البروتوكول من قياس الأوكسجين المتقدرية الاستهلاك في الموقع باستخدام ألياف العضلات بيرميبيليزيد29 من ثوراكسيس المورفولوجية في تركيبة مع ريسبيروميتري عالية الدقة32،33، 34 , 35-هذا الأسلوب له أيضا مزايا إضافية مقارنة بطريقة العزل المتقدرية الكلاسيكية نظراً للتفاعل مع العناصر الأخرى للخلية كما جيدا كما المتقدرية هيكل ووظيفة يتم الاحتفاظ أكثر في بيرميبيليزيد ألياف29،،من3136، مما يجعل هذا النهج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا. مع أحكام هذا البروتوكول، وظائف الميتوكوندريا يمكن دقة تقييم استخدام ريسبيروميتري عالية الدقة في ثوراكسيس ثلاثة فقط من المورفولوجية، مع ركائز يسمح تحديد استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة من ETS. ولذلك، يمكن أن يساعد هذا البروتوكول الإجابة على أسئلة رئيسية حول الآليات الأساسية التي تتحكم في عملية التمثيل الغذائي في سياق العديد من الظروف البيئية أو الفيزيولوجية المرضية بالاستفادة من نموذج المورفولوجية.
لقياس استهلاك الأوكسجين في عدة خطوات مختلفة ETS وتقييم ركائز مختلفة كيف تسهم التنفس، وركائز مختلفة (الشكل 1)، أونكوبلير، ومثبطات هي تستخدم30 بعد بيرميبيليزيشن من الأنسجة. على وجه التحديد، يتم إجراء إضافات متتالية من ركائز مختلفة لتحفيز دخول الإلكترونات عن طريق مجمعات مختلفة من ETS. أونكوبلير، السيانيد الكربونيل 4–(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، ثم يضاف بتركيز الأمثل لقياس التنفس غير مقترنة، أي حفز التنفس غير فوسفوريلاتينج لاستهلاك الأوكسجين القصوى. متسلسلة من الموانع من مجمعات ثم تتم الأول، والثاني، والثالث لمراقبة استهلاك الأكسجين المتبقي الذي سبب تفاعلات أكسدة غير ETS. أخيرا، يمكن تقييم القدرة القصوى التنفس الرابع المعقدة بحقن N, N, N ‘، N، p-ميثيل–فينيلينيدياميني (تمبد)، موفر إلكترون مصطنعة، واسكوربات. من المهم أن نلاحظ أن هذه التجارب تجري في 24 درجةمئوية حيث أنها درجة الحرارة التي تربى الذباب.
ويرد في هذه الدراسة، طريقة لإعداد نموذج قبل قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في المورفولوجية. تم تطوير هذا الأسلوب للتغلب على المشاكل المختلفة المتعلقة بالبروتوكولات المتقدرية العزلة، لا سيما من حيث المدة وعدد الأفراد المطلوب باستخدام. بدلاً من العمل مع العزلة المتقدرية عادة ما تتطلب ك…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من العلوم الوطنية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة، منحة الاكتشاف) وجامعة دو مونكتون أن أرستها. لهب يود أن ينوه دعم تمويلي من المعهد الكندي للبحوث الصحية (استوفوا)، ومؤسسة الابتكار نيو برونزويك (نبيف)، وجامعة دو مونكتون. أعمال EHC معتمد من قبل جمعية الزهايمر لكندا، كندا الدماغ، مقدمة، والمؤسسة الكندية لسرطان الثدي، ومؤسسة الابتكار في نيو برونزويك، مؤسسة البحوث الصحية في نيو برونزويك وجامعة دو مونكتون.
High-resolution respirometer Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Startup O2K respirometer kit |
O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Hamilton syringes with different volumes |
Datlab software | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software for data acquisition and analysis |
Fine-tipped antimagnetic forceps | VWR | 82027-400 | |
Secura225D-1S-DQE | Sartorius AG, Goettingen, Germany | Semi-micro balance (distributed by several companies) |
|
Drosophila melanogaster wild-type w1118 | Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA | Storage Condition: 24 °C |
|
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E4378 | EGTA Storage Condition: RT |
KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | Storage Condition: RT |
Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Storage Condition: -20 °C |
MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Storage Condition: RT |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Storage Condition: RT |
Na2Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | Storage Condition: -20 °C |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | Storage Condition: RT |
Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | Storage Condition: 2-8 °C |
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | Storage Condition: RT |
Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S7900 | Saponin Storage Condition: RT Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily. |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | Storage Condition: RT |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | Storage Condition: RT |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Storage Condition: RT |
BSA | Sigma-Aldrich | 05470 | Storage Condition: 2-8 °C |
Na2S2O4 | Sigma-Aldrich | 157953 | Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Pyruvate Storage Condition: 2-8 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily. |
L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Malate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 °C. |
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A5285 | ADP Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 °C. |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | Cytochrome c Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Proline Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | Succinate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 °C. |
sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt | Sigma-Aldrich | G7886 | Glycerol-3-phosphate Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 °C. |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: RT Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 °C. |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 °C. |
Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily. |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Storage Condition: -20 °C Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 °C. |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | T7394 | TMPD Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Ascorbate Storage Condition: RT Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at -20 °C. |
NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 °C. |