Articolo metodologico

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

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DOI:

10.3791/57457

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14 settembre 2018

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1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology, Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology, Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Cromatina loop gioca un ruolo significativo nella regolazione genica; Tuttavia, non ci sono stati nessun progressi tecnologici che consentono di modifica selettiva e reversibile della cromatina con passanti. Qui descriviamo un potente sistema per ri-organizzazione di cromatina ciclo usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9), ha dimostrato di selettivamente e reversibilmente modulare l'espressione genica a mirati loci.

Abstract

Recenti studi hanno chiaramente dimostrato che a lungo raggio, tridimensionale della cromatina looping gioco interazioni un ruolo significativo nella regolazione dell'espressione genica, ma se il ciclo è responsabile o il risultato di alterazioni nell'espressione genica è ancora sconosciuto. Fino a poco tempo, come ciclo di cromatina colpisce la regolamentazione delle attività genica e la funzione cellulare è stato relativamente ambigua, e limitazioni nei metodi esistenti per manipolare queste strutture ha impedito una esplorazione approfondita di queste interazioni. Per risolvere questa incertezza, abbiamo progettato un metodo per ri-organizzazione di cromatina selettivo e reversibile ciclo utilizzando CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Il dinamismo del sistema CLOuD9 è stato dimostrato dal successo della localizzazione dei costrutti di CLOuD9 a loci genomici per modulare la conformazione della cromatina locale di destinazione. D'importanza, è stata confermata anche la possibilità di invertire il contatto indotto e ripristinare la conformazione cromatinica endogeno. Modulazione dell'espressione genica con questo metodo costituisce la capacità di regolare l'espressione genica cellulare e sottolinea il grande potenziale per le applicazioni di questa tecnologia nella creazione di loop di cromatina che influenzano marcatamente gene stabile de novo espressione nei contesti di cancro e di sviluppo.

Introduzione

Il rapporto tra cromatina pieghevole nel nucleo e l'organizzazione specifica del genoma ha raccolto significativo interesse negli ultimi anni, come è stato dimostrato essere associato molto attentamente con gene expression1,2. Mentre il rapporto preciso fra attività genica e modulazione della struttura della cromatina rimane poco chiaro, è stato ipotizzato che le interazioni tra contatti cromosomiche come risultato di organizzazione dinamica della cromatina tridimensionale servano un gene funzione regolativa3. Infatti, tale effetto è stato ben dimostrato al luogo del gene della globina umana, dove la regione di controllo del locus (LCR) regola l'attività dei geni della globina in modo inerente allo sviluppo specifico creando un ciclo di cromatina tra le due regioni4. Tuttavia, in questa e altre regioni, non è chiaro se cromatina looping è una causa o una conseguenza delle alterazioni nell'espressione genica.

Fino ad ora, le sfide a studiare questo fenomeno sono rimaste irrisolte. Per esempio, altri tentativi di indurre cromatina loop coinvolto modifica della sequenza di DNA lineare o procedure complesse che richiedono un'abbondanza di conoscenza di base sugli elementi specifici che facilitano il loop5,6, 7,8. Inoltre, mentre il lavoro precedente ha suggerito che cromatina loop auto espressione genica in un contesto specifico e limitato7,8, il livello al quale cromatina looping colpisce trascrizione a livello globale è incerto. Se interesse l'impatto di looping a lungo raggio sull'espressione del gene è cresciuta costantemente negli ultimi anni, domande senza risposta circa stabilendo e mantenendo contatti della cromatina per modificare l'attività del gene persistono.

La tecnologia che abbiamo progettato impiega nucleasi carenti cluster ripetizioni brevi palindromi regolarmente intercapedine (CRISPR) - CRISPR - associati proteina 9 (dCas9), per consentire il targeting ampiamente applicabili di qualsiasi loci genomici9. Questa tecnologia elimina le complesse problematiche relazionate a modifiche della sequenza del DNA lineare ed è accessibile senza significativa conoscenza preliminare di determinati componenti di loop. In particolare, lo strumento è universale e ampiamente applicabili agli anelli di cromatina riconosciuti in sviluppo, nonché una varietà di malattie, come il cancro. Il potere di CLOuD9 è dimostrato reversibilmente alterando la struttura di loop a efficacemente modulano l'espressione genica.

Protocollo

1. gRNA Design

  1. Selezionare uno strumento di progettazione gRNA standard per progettare la guida RNAs10. Utilizzare coppie complementari di CLOuD9 costrutti precedentemente sviluppato9 (cioè, almeno 1 S. aureus (CSA) e 1 S. pyogenes (CSP) costruire) per ogni esperimento.
    1. All'interno dello strumento di progettazione on-line selezionati, utilizzare la sequenza di Protospacer adiacente Motif (PAM) "NGG" con una lunghezza di guida di 20 bp per CSP e il PAM di sequenza "NNGRRT" con una lunghezza di guida di 21 per CSA.
    2. Scegliere Guide basate sulla specificità Punteggio ottenuto e guide su entrambi i fili per massimizzare le probabilità di ottenere una guida di lavoro di progettazione.
    3. Ordinare 2 oligonucleotidi per guida da un produttore di oligo: per oligo avanti, aggiungere "caccg" all'estremità 5' della sequenza guida e per l'oligo inversa, aggiungere "aaac" all'estremità 5' e "c" all'estremità 3' prima di ordinare.
  2. Inizialmente, progettazione gRNAs di 3-5 per ogni area di interesse, si sviluppa su un'area di bp 250-1000. Valutare il gRNA targeting efficienza come segue:
    1. GRNAs clone identificato in un plasmide Cas9 attivo (Vedi punto 3) e transitoriamente transfect in cellule 293T (Vedi punto 4)11.
    2. Crescere le cellule per 2-3 d in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (streptococco di penna), poi raccolto ed estrarre genomic DNA12.
    3. Amplificare regioni mirate da reazione a catena della polimerasi (PCR). Eseguire prodotti su un gel di agarosio 1.5% e purificare bande appropriati.
    4. Eseguire un'analisi di endonucleasi T7 come descritto in Guschin, et al. protocollo n.13,14.
      Nota: Guide efficienti sono quelli determinati per tagliare il DNA presso il sito di destinazione.

2. coltura cellulare

  1. Mantenere le cellule in una sana e dividono attivamente stato.
    1. Per K562s, cultura media di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con 10% FBS e 1% penna dello streptococco.
      1. Crescere K562s in un pallone di collo inclinato 25 cm2 per manutenzione e regolare la densità delle cellule a 400.000 cellule per mL ogni giorno.
      2. Dopo K562s sono state trasdotte con costrutti di CLOuD9, aggiungere 2 con puromicina µ g/mL e 100 µ g/mL igromicina per mezzi di manutenzione.
    2. Per 293Ts, cultura in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 10% FBS e 1% penna dello streptococco.
      1. Crescere 293Ts in piatti da 10 cm2 e dividere quando confluenti.

3. Miniprep e gRNA inserimento15

Nota: Le mappe di plasmide sono disponibili nell'appendice e primer utilizzati negli esperimenti di esempio sono disponibili in supplementari nella tabella 1.

  1. Mix 5 µ g del plasmide CRISPR lentivirale con 3 µ l di BsmBI, 3 µ l della fosfatasi alcalina, 6 µ l di tampone 10x e 0,6 µ l di preparata 100 mM DTT. Portare il volume totale a 60 µ l con ddH2O e incubare a 37 ° C per 30 min a digerire e dephosphorylate il plasmide.
  2. Gel di purificare il plasmide digerito ed eluire ddH2O.
  3. Mescolare 1 µ l di ciascuna delle guide accoppiate a 100 µM con 1 µ l di 10 x T4 legatura Buffer, 6,5 µ l di ddH2O e 0,5 µ l T4 PNK, raggiungere 10 µ l di volume totale. Incubare a 37 ° C per 30 min, poi a 95 ° C per 5 min, poi la rampa fino a 25 ° C a 5 ° C/min.
    Nota: Questo verrà tempri la coppia di guide.
  4. Diluire 1: 200 guide ricotto (dal punto 3.3) in ddH2O.
  5. Mescolare 1 µ l del plasmide digerito dal passaggio 3.2 con 0,5 µ l delle guide dei diluito dal passaggio 3.4, 2,5 µ l di 2 x Buffer, 1 µ l di ddH2O e 0,5 µ l di ligasi, per rendere una reazione totale di 5,5 µ l. Questo Incubare a temperatura ambiente per 10 min legare le guide per il plasmide BsmBI digerito.
  6. Trasformare il plasmide appena legato da passo 3.5 Stbl3 batteri e amplificare utilizzando qualsiasi metodo di preparazione del plasmide.

4. lentivirus produzione

  1. Conteggio 750.000 293T cellule per pozzetto per un sei-pozzo piastra utilizzando un emocitometro e semi in DMEM con 10% FBS e 1% penna dello streptococco. Usarla bene per ogni costrutto.
  2. 24 h dopo la semina, cambiare supporto a fresco privo di antibiotico DMEM con 10% FBS.
  3. In una provetta, diluire 11 µ l di reagente di transfezione basata sui lipidi con 150 µ l del OptiMEM medium, per reazione11.
  4. In un tubo separato, diluire 2 µ g del plasmide vettore lentivirale CLOuD9 dal punto 3.6, 0,35 µ g di pMDLg/pRRE, 1 µ g di OSPRO-Rev e 0,65 µ g di pMD2.G con 150 µ l del OptiMEM medium, per reazione11.
  5. Per ogni reazione, aggiungere le miscele di plasmide lentivirali diluito per il reagente di transfezione basata sui lipidi diluito con un rapporto 1:1 e incubare per 5 min11.
  6. Aggiungere l'intero volume di ciascun complesso misto dal passaggio 4.5 nei relativi pozzetti delle cellule 293T privo di antibiotico dalla fase 4.2.
  7. 48 ore più tardi, raccogliere produzione virale media pipettando in una nuova provetta e spin giù a 300 x g per 5 min. Dopo la centrifugazione, spostare il surnatante in una nuova provetta per rimuovere i detriti residua della cellula.
  8. Usare mezzi di produzione virale immediatamente per la trasduzione delle cellule bersaglio o congelare a-80 ° C per un uso futuro.

5. lentivirus trasduzione delle cellule

  1. Aggiungere 250 µ l di ogni costrutto virale di interesse (composto da complementari CLOuD9 plasmidi) in una provetta conica 15 mL contenenti 80.000 cellule per l'applicazione di CLOuD9.
  2. Portare il volume totale dei media in ogni conica a 1 mL con media senza Antibiotico e aggiungere polybrene a una concentrazione finale di fra 1-8 µ g/mL (la concentrazione massima di polybrene tollerato dal tipo cellulare utilizzato dovrà essere determinata sperimentalmente).
  3. Girare le cellule a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente, quindi risospendere pipettando senza rimuovere il surnatante virale. Spostare la sospensione dell'intera cella in una piastra di coltura delle cellule.
  4. 24h post-traduzionali, cellule di spin giù a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  5. Aspirare il surnatante virale e risospendere le cellule in terreno di coltura delle cellule normali.
  6. Il giorno successivo, aggiungere con puromicina (1 µ g/mL per cellule 293T) e igromicina (25 µ g/mL per cellule 293T) al medium della coltura cellulare per selezionare per cellule doppiamente trasdotte. Determinare sperimentalmente le concentrazioni adeguate di con puromicina e igromicina per un tipo di cella specificata prima dell'inizio degli esperimenti.
  7. Mantenere le cellule nei media di selezione per almeno 3 d prima eventuali esperimenti a valle e mantenere in media di selezione, per la durata di tutti gli esperimenti.

6. la dimerizzazione e Wash Out delle cellule

  1. Aggiungere 1 mM acido abscissico (ABA) o un volume equivalente di solfossido dimetilico (DMSO) per i controlli alla coltura delle cellule a dimerizzano il CLOuD9 selezionato e trasdotte cellule. Utilizzare ABA entro 6 mesi dalla data di ricevimento, mantenere il freddo e proteggerlo dalla luce nell'uso. 2 mM ABA può essere utilizzato se necessario.
    1. Cambiare supporto ogni giorno per fornire fresco ABA (o DMSO per controlli) per la durata degli esperimenti.
      Nota: Nessun limite per la lunghezza di dimerizzazione ancora è stato osservato.
  2. Invertire la dimerizzazione attraverso la rimozione di supporti contenenti ABA e cellule di lavaggio con sufficiente tamponato fosfato salino (PBS) per coprire la superficie della piastra, due volte. Da allora in poi, cellule di cultura in media senza ABA per mantenere uno stato di non-dimerizza.

7. immunoprecipitazione e Co-immunoprecipitazione

Nota: Assicurarsi di tutti i buffer fresco e immediatamente prima dell'uso.

  1. Dopo il completamento degli esperimenti di dimerizzazione, raccogliere e rotazione verso il basso le celle, quindi aspirare il surnatante.
  2. Crosslink e congelare giù le cellule
    1. Fare un magazzino fresco di formaldeide 1% in PBS a temperatura ambiente, utilizzando materiali freschi. Per ogni 2 milioni di cellule, Risospendere delicatamente con 1 mL di formaldeide 1% a temperatura ambiente per esattamente 10 min, durante la rotazione.
      Nota: Utilizzare un volume minimo di 10 mL per reticolazione inferiore a 10 milioni di cellule.
    2. Placare la reticolazione con l'aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M, seguita da incubazione per 5 min a temperatura ambiente, durante la rotazione.
    3. Rotazione verso il basso le cellule e lavare 1-2 volte con PBS ghiacciata. Palline delle cellule possono essere quindi snap congelati in azoto liquido e conservato a-80 ° C o utilizzato immediatamente.
      Nota: Calore invertirà le reticolazioni formaldeide. Se si precipitò, le cellule possono essere memorizzate direttamente a-80 ° C senza congelare lo snap.
  3. Preparare il coniugato anticorpo/tallone
    Nota: Condizioni di ottimizzazione per l'anticorpo selezionata (cioè, test di buffer di lisi diverse per lisi cellulare e l'esecuzione di IP) possono essere utile. Due comuni buffer, buffer di lisi di Farnham e buffer RIPA per volta, può avere un effetto significativo sull'efficienza IP ed efficienza di sonicazione. Tutte le composizioni di buffer possono essere trovate nella Tabella materiali. Inoltre, tenete a mente che cromatina sonicazione può richiedere diverse ore per completare.
    1. Risospendere le perline nel Vortex brevemente come appropriato per l'anticorpo selezionata.
    2. Trasferire una quantità appropriata di perline per l'esperimento in una provetta da 1,5 mL. Come punto di partenza, è possibile utilizzare 20 µ l di perline per ogni 1 µ g di anticorpo. Non aggiungere ancora dell'anticorpo.
      Nota: Utilizzare 10 µ g anticorpo con 200 µ l di perline per 1 mg di totale lysate come punto di partenza, a meno che non è noto che l'anticorpo è più o meno efficiente di quanto ciò implicherebbe. Per le proteine di abbondanza bassa, questo rapporto potrebbe essere necessario essere regolata.
    3. Se si utilizza il buffer di lisi di Farnham, lavare 3x in tampone di diluizione di IP. Se si utilizza il buffer di lisi RIPA, lavare 3x in tampone di lisi RIPA.
    4. Risospendere le perline in un volume finale dello stesso buffer dal punto 7.3.3 (diluizione di IP o buffer di RIPA) che è > 1 x e < 5 volte il volume iniziale. vale a dire Per 100 µ l di perlina iniziale, utilizzare tra 100 e 500 µ l di risospensione finale.
    5. Aggiungere anticorpo lavato beads ora a una concentrazione appropriata. Per un buon anticorpo HA o bandiera ai costrutti di CLOuD9 IP, usare gli anticorpi alle 01:50 (µ g proteine: µ g lisato proteico) ed incubare tra 8 + h e durante la notte a 4 ° C, durante la rotazione. In alternativa, incubare per 2-4 h a temperatura ambiente.
    6. Rimuovere il surnatante da perline e scartare.
    7. Perle di lavare 3 volte con il tampone di lavaggio.
    8. Risospendere in un volume minimo del buffer utilizzato per pernottamento incubazione con l'anticorpo (diluizione di IP o RIPA buffer). Mantenere il freddo fino a quando combinato con lisato proteico.
  4. Sottoporre ad ultrasuoni della cromatina
    1. In primo luogo lisare cellule con l'aggiunta di gonfiore buffer per palline delle cellule in ghiaccio per 10 min, sfogliando le cellule ogni pochi minuti per evitare la sedimentazione.
      Nota: In genere, 500 µ l di tampone di gonfiore è aggiunto alle cellule di 25 milioni e scalati da lì, ma fare uso minore di 500 µ l tampone per < 25 milioni di cellule.
    2. Lisata manualmente in senso orario e antiorario, 13 x ciascuno.
    3. I nuclei di spin giù a 4 ° C per 5 min a 1.500 x g. aspirare il supernatante completamente e ripetere la procedura per rimuovere il surnatante rimanenti, poi pesano il pellet cellulare in mg.
    4. Aggiungere l'inibitore della proteasi al buffer di lisi di nuclei (Farnham buffer o RIPA buffer, sopra, scegli uno).
    5. Aggiungere 10 x quantità di tampone di lisi di nuclei ai nuclei pellettati per risospendere (ad esempio, aggiungere 1 mL di tampone di lisi di nuclei per un pellet di 0,100 g). Brevemente vortice e lyse per 10 min sul ghiaccio.
      Nota: Tenere presente la dimensione del tubo sonicazione. Volume ideale è spesso < 1 mL, quindi potrebbero essere necessario essere diviso se pellet sono molto grandi campioni.
      1. Per Co-IP, Sonicare nuclei brevemente per solubilizzare materiale e dissetare SDS ad un livello che consente di immunoprecipitazione con 2-3 volumi di tampone di diluizione, quindi procedere con il passo 7.4.6. Per gli anticorpi molto sensibili, aggiungere più tampone di diluizione per ridurre ulteriormente la concentrazione di SDS.
        Nota: Interrompere sonicazione quando Cancella lisato; che passa da un opaco/traslucido bianco a completamente trasparente. I campioni possono essere freddo come possibile e non oltre Sonicare.
      2. Per il ChIP, accuratamente Sonicare DNA per ottenere frammenti di DNA di 150-1000 bp, quindi procedere con il passo 7.4.6.
    6. Filare fuori materiale insolubile alla massima velocità per 10 min a 4 ° C.
    7. Trasferire il materiale solubile in una nuova provetta.
    8. Per Co-IP, misurare la concentrazione di proteina e procedere con il pulldown al punto 7.5.
    9. Per il ChIP, rimuovere un'aliquota di 10 µ l di deselezionata lisato e aggiungere 40 µ l IP buffer di eluizione e 6 µ l 5 M NaCl a quella per un totale di 56ul. Far bollire per 15 min a 95 ° C, aggiungere 5-10 µ l di 3M NaOAc pH 5 e ripulire in una colonna di purificazione di PCR. Misurare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza a 260 nm e standardizzare i campioni. Quindi procedere al pulldown al punto 7.5.
      Nota: Extra lisato può essere snap congelato a-80 ° C e utilizzato in un secondo momento, ma i migliori risultati sono ottenuti dal fresco lisato. Se il congelamento, non gelo/disgelo lisato di più di una volta.
  5. Pulldown
    1. Trasferire una quantità appropriata di lisato proteico in una nuova provetta. Se si utilizza il buffer di lisi di Farnham, diluire in 2,1 volumi di tampone di diluizione IP (Vedi sopra).
    2. Mettere da parte 100 µ l del surnatante per controllo di input e conservare a 4 ° C fino al giorno successivo.
    3. Aggiungere tallone/anticorpo coniugato dal passaggio 7.3.8 ai campioni.
    4. Ruotare i campioni a 4 ° C durante la notte e garantire che c'è abbastanza volume per movimento liquido in provette da 1,5 mL.
  6. Lavare ed eluire
    1. Dopo la rotazione durante la notte, è possibile salvare il surnatante come la frazione non vincolante. Quindi lavare perline 3-5 volte in tampone di diluizione di IP.
    2. Preparare il tampone di eluizione di IP a temperatura ambiente, senza inibitori.
    3. Eluire complessi con 50 µ l di tampone di eluizione scosso su un vortex a 67 ° C per 15 min. eluizione di trasferimento ad un nuovo tubo e ripetere con un altro 50 µ l. combinarli entrambi per un totale eluizione di 100 µ l.
      Nota: Se c'è troppa background di questa procedura di eluizione, calore può essere ridotto o eliminato durante l'agitazione/incubazione. Questo in genere riduce il rendimento della proteina bersaglio, ma diminuire significativamente sullo sfondo.
  7. Invertire le reticolazioni riscaldando a 67 ° C per > 4h.
    Nota: Questo non è strettamente necessario per co-IPs, ma può essere utile.
    1. Per Co-IP, per garantire piena dimerizzazione tra le destinazioni di interesse, eseguire eluati su un gel di SDS-page e sonda con gli anticorpi contro il tag HA o Flag, come indicato, tutto a 1: 1.000. Quindi procedere al passaggio 8.
    2. Per ChIP-qPCR, per garantire la corretta localizzazione e ottimizzazione di ogni componente di CRISPR-dCas9, pulire eluizione prodotto su una colonna ed eluire in 10 µ l. eseguire in tempo reale quantitativa polymerase chain reaction (qPCR) di DNA purificato. Primer utilizzati nei dati presentati sono disponibili in supplementari nella tabella 1. Quindi procedere al passaggio 8.

8. estrazione e del RNA PCR quantitativa

  1. Per studiare i cambiamenti nell'espressione genica indotta da CLOuD9, in primo luogo, di isolare e purificare il RNA totale da controllo cella pellet e pellet dimerized cella.
  2. Rendere il DNA complementare (cDNA) dal RNA purificato da trascrizione inversa17 ed eseguire analisi qPCR. Gli iniettori sono disponibili in supplementari nella tabella 1.

9. cromosoma conformazione Capture Assay

  1. Per osservare i cambiamenti nella frequenza di contatti di loci genomici indotti da CLOuD9, eseguire cromosoma conformazione acquisizione (3C) saggi8.
  2. Quantificare i prodotti di legatura 3C in due insiemi di duplicati per ciascuno dei tre replicati biologici mediante PCR quantitativa in tempo reale. Normalizzare i campioni per i segnali di 3C dal locus di tubulina. Gli iniettori sono disponibili in supplementari nella tabella 1.

Risultati

CLOuD9 induce reversibile β-globina promotore-LCR looping. Uso appropriato del sistema CLOuD9 induce contatto reversibile del CSA complementare e CSP CLOuD9 costruisce attraverso l'aggiunta o la rimozione dell'ABA per terreni di coltura delle cellule (Figura 1a). Costrutti CSA e CSP (Figura 1b) sono localizzati in regioni genomiche appropriate utilizzando standard CRISPR gRNAs. Considerando la vasta documentazione del locus della globina umana così come la frequente piegatura cromosomiche e riorganizzazione che vi avviene durante lo sviluppo, questa regione è stato scelto per dimostrare l'utilità del sistema CLOuD9. Inoltre, la linea cellulare K562 è stata selezionata perché è stato dimostrato costantemente esprimere alti livelli del gene della γ-globina fetale, in contrasto con il gene della β-globina che è in genere espresso in cellule di stirpe degli eritrociti adulto sano. Utilizzando le cellule K562, la capacità di CLOuD9 di modificare l'espressione genica può essere esaminata nel tentativo di ripristinare l'espressione del gene della β-globina in questa linea cellulare.

Prima di induzione di dimerizzazione, cromatina immunoprecipitazione quantitativa PCR (ChIP-qPCR) è stata utilizzata per garantire la localizzazione esatta e il targeting di ogni componente di CLOuD9 (complementare figura 1). Inoltre, co-immunoprecipitazione (Co-IP) con e senza ABA verificato dimerizzazione CSA e CSP alla presenza del ligando, nonché reversibilità in assenza del ligando (Figura 1C e complementare nella figura 2). 24 h dopo l'aggiunta di ABA, maggior contatto tra β-globina e il LCR è comparso come misurato dalla cattura di conformazione del cromosoma (3C) nelle cellule con entrambe le parti la dimerizzazione, ma non i controlli che contiene solo due costrutti CSA o CSP, quindi convalida la specificità del cambiamento della cromatina per i siti mirati (Figura 1C e complementari figure 3,4). Creando l'interazione di LCR-β-globina non ha completamente eliminato il contatto di LCR-globina endogeno, ma invece, aggiunto al contatto originale, come precedentemente segnalato8. Aumenti in β-globina/LCR contatti sono stati osservati per fino a 72 h di dimerizzazione, indipendentemente dalla regione esatta all'interno mirato LCR e β-globina regione del promotore (figure complementari 5,6). Infine, la reversibilità del sistema è stata confermata con 3C dopo la rimozione di ABA, che hanno mostrato un completo rinnovamento della conformazione endogena (Figura 1 d e complementari figure 3-6).

Abbiamo considerato che il successo dimostrato nelle cellule K562 può essere un risultato della posizione della globina locus in una regione dell'eucromatina (Figura 1D), quindi una seconda linea cellulare è stata utilizzata per esplorare questa idea. Il sistema di CLOuD9 è stato applicato alla HEK 293T cellule nelle regioni che sono eterocromatici e non esprimono geni della globina (Figura 1e). Il risultato è stato simile a quello che è stato osservato in K562s; altre associazioni di LCR di β-globina sono state misurate da 3C dopo 24 h con ABA (Figura 1e e complementare figura 3), fornendo la prova affinchè la robusta capacità di CLOuD9 funzione in diversi ambienti cellulari, nonostante lo stato originale della cromatina o conformazione.

Ulteriori loci sono stati testati per garantire l'ampia applicabilità di CLOuD9, tra cui il promotore di Oct4 e potenziatore distale 5' all'interno delle cellule 293T. In precedenza, c'è stata alcuna espressione di Oct4 rilevabile in questa linea cellulare e ulteriormente, contatti no endogeni descritti. Prove di espressione di Oct4 in cellule staminali embrionali, derivanti dal contatto con il rinforzatore distale 5' motivato questo esperimento, e lo stesso risultato è stato osservato al locus della β-globina18. Contatto tra l'Oct4 promotore e distale enhancer è stato identificato in cellule CLOuD9 abilitato, ma non le cellule di controllo (Figura 1f). Inoltre, è stato osservato che il promotore Oct4 e distale 5' enhancer interazione anche richiesto un rinforzatore 3' per contattare il promotore Oct4. Questo evento è coerenza con le prove che il rinforzatore 3' interagisce con il promotore Oct4/5 ' distale enhancer complesso durante il gene endogeno attivazione10.

CLOuD9 induce alterazioni specifiche del contesto a loci genici. Dopo la conferma che il sistema di CLOuD9 infatti indurre cromosomiche contatti a loci genici, abbiamo cercato di esaminare effetto dei cicli sull'espressione del gene. È stato documentato che la trascrizione per i geni di Oct4 e della globina sono contingenti sui contatti tra i loci genici LCR e della globina e tra il 5' distale enhancer e promotore di Oct4, rispettivamente1,11. Così, abbiamo supposto che utilizzando il sistema di formazione di ciclo di azionamento della cromatina in ciascuna di queste regioni si tradurrebbe in convincente espressione genica di CLOuD9.

In entrambi i loci, RT-qPCR ha dimostrato che ABA indotta della cromatina loop ha guidato gli aumenti nell'espressione di Oct4 in cellule 293T e nell'espressione di β-globina in cellule K562, anche se non in 293Ts (Figura 2a). Però l'aggiunta di ABA alla cella cultura per espressione di appena 24 h β-globina aumentato significativamente, espressione ha continuato ad aumentare costantemente fino a 72 ore ed era reversibile dopo interruzione di ABA (Figura 2a). Tutte le cellule K562 ad eccezione dei controlli seguito questa tendenza, non importa dove si trovavano i componenti di dimerizzazione nelle regioni promotore LCR e β-globina (Figura 2a e complementari figure 7,8). A sostegno di questi risultati, ChIP-qPCR di H3K4me3 e RNA Pol-II al luogo del β-globina in K562s e 293Ts hanno corrisposto con alterazioni osservate nella trascrizione (Figura 2 c-f).

CLOuD9 costituisce stabile della cromatina loop. Anche se a breve termine induzione del ciclo con CLOuD9 seguito chiaramente le aspettative, se a lungo termine induzione del ciclo ha avuto effetti differenziali è rimasto devono essere rispettate. Per studiare questo, le cellule sono state coltivate in presenza di ABA per 10 giorni. Mentre sia K562s e 293Ts hanno esibito una maggiore frequenza di contatto tra il locus della β-globina e il LCR riguardante i comandi (Figura 3a, b e complementari figure 9,10), alterazioni nell'espressione di β-globina sono state osservate ancora soltanto in cellule K562 (Figura 3C). È interessante notare, tuttavia, è stato osservato che a lungo termine dimerizzazione in K562s, dove la trascrizione è stata fortemente upregulated, non era più reversibile (Figura 3a e complementari figure 9-11). Tuttavia, in 293Ts, dove nessuna alterazione nella trascrizione è stata osservata in seguito a lungo termine la dimerizzazione, ha indotto le alterazioni nei contatti della cromatina è rimasti reversibile (Figura 3b e complementare figura 9).

Nel complesso, solo una piccola diminuzione nell'espressione genica è stata osservata dopo 10 giorni di rimozione di ABA, che rimase significativamente superiori livelli di espressione genica prima della dimerizzazione (Figura 3C). In armonia con questo, le cellule K562, ma non cellule 293T, ha mostrato alterazioni sostenute in H3K4me3 e RNA Pol-II presso il locus di β-globina di ChIP-qPCR, rispetto ai controlli, anche dopo 10 giorni di rimozione ABA (figura 3d-f). Quindi, i nostri risultati indicano che la stabilità del ciclo della cromatina implica più espressione genica sostenibile.

figure-results-1
Figura 1: CLOuD9 induce reversibile β-globina promotore-LCR looping. (a) aggiunta di acido abscissico (ABA, verde) porta due costrutti di CLOuD9 complementari (CLOuD9 s. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), rosso e blu, rispettivamente) in prossimità, ritocco della struttura della cromatina. Rimozione dell'ABA ripristina la conformazione cromatinica endogeno. (b) CLOuD9 costrutti combinano tecnologia CRISPR-dCas9 da S. aureus e S. pyogenes con reversibilmente dimerizeable domini PYL1 e ABI1. (c) Timeline di CLOuD9 dimerizzazione esperimenti. (d) 3 C test misura frequenze di tutto il locus reticolazione di β-globina in cellule K562 dopo 24 h di trattamento con ABA (rosso) e successiva interruzione (blu) mostrando la reversibilità di indotta β-globina/LCR contatti (evidenziati in grigio). Le frecce arancione indicano regioni specifiche di destinazione costrutto CLOuD9. Il frammento di EcoRI contenente siti di ipersensibilità 1-4 di LCR (barra nera) venne utilizzato come area di ancoraggio. Sono stati valutati la sua frequenza di reticolazione con altri frammenti EcoRI indicati (nomi nella parte superiore del grafico). I geni della β-globina umana e LCR ipersensibilità siti sono raffigurati sulla parte inferiore del grafico con le coordinate della posizione cromosomica. Dati dal ChIP-seq di H3K4me3 e H3K9me3 dimostrano che questa regione è euchromatic in K562s. (e) simile reversibile cambiamenti nella struttura della cromatina sono veduti in cellule HEK 293T, nonostante l'evidenza dai dati H3K4me3 e H3K9me3 ChIP-seq che la globina regione è eterocromatici in questo tipo di cella. (f) 3 C saggio misurare frequenze di tutto il locus reticolazione Oct4 in 293T cellule dopo 72 h del trattamento con ABA (rosso) risultati indotto Oct4/distale contatti enhancer (evidenziati in grigio). Le frecce arancione indicano regioni specifiche di destinazione costrutto CLOuD9. Il frammento di MboI contenente il promotore di Oct4 (barra nera) venne utilizzato come area di ancoraggio. Sono stati valutati la sua frequenza di reticolazione con altri frammenti MboI indicati (nomi nella parte superiore del grafico). Le regioni di Oct4 umane sono raffigurate sulla parte inferiore del grafico con le coordinate della posizione cromosomica. Tutti i risultati di 3C sono stati ottenuti da almeno tre esperimenti indipendenti. C 3 valori sono stati normalizzati alla tubulina. Per β-globina, frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono state impostate su zero. Per Oct4, frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e un frammento di controllo negativo di fuori della regione di Oct4 interagente sono state impostate su zero. Barre di errore indicano s.d. n = 3. Questa figura è stata modificata da Figura 1 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: CLOuD9 induce alterazioni specifiche del contesto in stato di espressione e della cromatina di gene. (a) CLOuD9-indotta della cromatina looping al luogo del β-globina provoca l'induzione reversibile dell'espressione della β-globina in K562s ma non in 293Ts. significato dato rispetto a cellule di controllo trattato. Di due code student t-test * P < 0,05, t = 3.418, df = 5; P < 0.0001, t = 10,42 df = 5; n.s. non significativo. Barre di errore indicano s.d. n = 3. (b) induzione di Oct4 espressione è stata osservata in seguito di 293Ts indotta da CLOuD9 ciclo nello stesso locus. Rispetto a cellule di controllo trattato, è data importanza. Di due code student t-test * P < 0,05, t = 4.562, df = 2. Barre di errore indicano s.d. (c) schema dei percorsi primer ChIP-qPCR lungo il corpo del gene della β-globina. (d, e) ChIP-qPCR dimostra alterazioni reversibili in H3K4me3 al luogo del β-globina in K562s ma non in 293Ts seguito indotta da CLOuD9 looping. Di due code student t-test * P < 0,05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. Barre di errore indicano s.d. (f) CLOuD9 mediate alterazioni nella trascrizione di β-globina in K562s corrispondono con gli aumenti in occupazione di RNA Pol-II in tutta l'interezza del corpo gene della β-globina. Di due code student t-test * P < 0,05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. Barre di errore indicano s.d. Questa figura è stata modificata da Figura 2 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: CLOuD9 stabilisce loop stabile della cromatina che sostengono l'espressione genica robusto seguendo la dimerizzazione a lungo termine. (a, b) 3C analisi dimostra che in K562s ma non 293Ts, CLOuD9-indotta della cromatina loop diventa irreversibile dopo 10 giorni di trattamento ABA, anche quando ABA è rimosso per fino a 10 giorni aggiuntivi. 3C tutti i risultati sono stati ottenuti da almeno tre esperimenti indipendenti. C 3 valori sono stati normalizzati alla tubulina, e frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono state impostate su zero. Barre di errore indicano s.d. n = 3. (c) stabilizzazione di Loop in K562s traduce in espressione persistente della β-globina, anche dopo 10 giorni di washout di ABA. Nessun cambiamento nell'espressione della β-globina è osservato in 293Ts. significato dato rispetto a cellule di controllo trattato. Di due code student t-test * * * P < 0.0001, t = 5.963, df = 5; aumenti n.s. non significativo (d) ChIP-qPCR mostrando segni di H3K4me3 sopra il locus di β-globina in risposta indotta da CLOuD9 cicli sono sostenuti dopo 10 giorni di washout di ligando in K562s. due code dello studente t-test * P < 0,05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. (e) alterazioni significative nella H3K4me3 non segnali segue a lungo termine la dimerizzazione sono stati osservati da ChIP-qPCR in 293Ts. (f) occupazione aumentata RNA Pol-II del locus del β-globina dopo induzione di ciclo a lungo termine è stata mantenuta in K562s Dopo 10 giorni di washout di ligando. Di due code student t-test * P < 0,05, * * P < 0,001, * * * P < 0,0001. Tutte le barre di errore indicano s.d. Questa figura è stata modificata da Figura 3 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare figura 1: costrutti di CLOuD9 localizzano nelle loro regioni di destinazione desiderata. Immunoprecipitazione della cromatina e quantitative PCR di CLOuD9 costrutti dimostrano corretta localizzazione per loro previsti loci genomici. Questa figura è stata modificata da complementare figura 1 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 2: costrutti di CLOuD9 reversibilmente associano in risposta al trattamento ABA. Co-immunoprecipitazione dimostrando l'associazione delle proteine dCas9 seguenti 72 h del trattamento di ABA è invertito segue successive 72 h di washout di ligando. Questa figura è stata modificata da complementare figura 2 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 3: controllo trattamento non induce nessun cambiamento nei contatti della cromatina. Trattamento con DMSO, un agente di controllo, per 24 ore non induce nessun cambiamento nella conformazione della cromatina endogeno di 3C in entrambe le cellule K562 o HEK 293Ts. 3C valori sono stati normalizzati a tubulina e frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono stati impostati su zero. Barre di errore indicano SD. n = 3. Questa figura è stata modificata da complementare figura 3 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 4: controllo CLOuD9 trasdotte cellule non mostrano alterazioni della cromatina looping. Dirigendo due CLOuD9 costruisce sia il LCR o il promotore di β-globina non induce nessun cambiamento significativo nella struttura della cromatina di 3C dopo il trattamento ABA rispetto al trattamento di controllo. C 3 valori sono stati normalizzati alla tubulina, e frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono state impostate su zero. Barre di errore indicano SD. n = 3. Questa figura è stata modificata da complementare figura 4 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 5: CLOuD9 cromatina loop rimane reversibile dopo 72 ore di dimerizzazione. Analisi di 3C in K562s viene illustrato reversibilità di CLOuD9 indotta β-globina/LCR contatti dopo 72 ore del trattamento ABA. C 3 valori sono stati normalizzati alla tubulina, e frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono state impostate su zero. Barre di errore indicano SD. n = 3. Questa figura è stata modificata da complementare figura 5 a Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 6: CLOuD9 indotta β-globina/LCR loop non è influenzato dal sito di destinazione di globina. Regia di CSA e CSP costruisce alternativo nelle regioni di LCR o i risultati del promotore di β-globina in simili cambiamenti reversibili nell'induzione del ciclo di 3C dopo 72 ore del trattamento ABA. C 3 valori sono stati normalizzati alla tubulina, e frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono state impostate su zero. Barre di errore indicano SD. n = 3. Questa figura è stata modificata da complementare figura 6 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 7: CLOuD9 indotte alterazioni nell'espressione genica sono sostenute indipendentemente dal sito di destinazione di globina. Regia di CSA e CSP costruisce alternativo nelle regioni del promotore della β-globina e LCR non ha alcun impatto sull'induzione dell'espressione genica dopo 72 h di dimerizzazione. Tuttavia, mentre un certo impatto sulla forza di espressione genica seguente dimerizzazione di lungo termine (10 giorni) è stata osservata, elevati livelli di β-globina rispetto a cellule di controllo trattato erano sostenuta seguenti colori attenuati ligando successive per ulteriori 10 giorni. Rispetto a cellule di controllo trattato, è data importanza. p < 0,001, t = 10.25, df = 5; p < 0,0001, da sinistra a destra t = 8,697, df = 6, t = 40.31, df = 7; n.s. non significativo. Tutte le barre di errore indicano SD Questa figura è stata modificata da complementare figura 7 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 8: controllo CLOuD9 trasdotte cellule non mostrano alterazioni nell'espressione di β-globina. Dirigendo due CLOuD9 costruisce sia il LCR o il promotore di β-globina non induce nessun cambiamento significativo nell'espressione di β-globina che segue trattamento ABA rispetto al trattamento di controllo. Rispetto a cellule di controllo trattato, è data importanza. n.s. non significativo. Questa figura è stata modificata da complementare figura 8 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 9: trattamento di controllo a lungo termine non induce nessun cambiamento nei contatti della cromatina. Trattamento con DMSO, un agente di controllo, per 10 giorni non induce alcun cambiamento nella conformazione della cromatina endogeno di 3C in entrambe le cellule K562 o HEK 293Ts. 3C valori sono stati normalizzati a tubulina e frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono stati impostati su zero. Barre di errore indicano SD. n = 3. Questa figura è stata modificata da complementare figura 9 a Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 10: Long-Term CLOuD9 indotta β-globina/LCR loop non è influenzato dal sito di destinazione di globina. Dirigendo CSA e CSP costruisce alternativo nelle regioni di LCR o i risultati del promotore di β-globina allo stesso modo sostenuto loop ad induzione, come dimostrato da 3C dopo 10 giorni di trattamento ABA e 10 giorni di interruzione successivi ligando. C 3 valori sono stati normalizzati alla tubulina, e frequenze di interazione tra il frammento di ancoraggio e il frammento che comprende il frammento β/HS sono state impostate su zero. Barre di errore indicano SD. n = 3. Questa figura è stata modificata da complementare figura 10 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare figura 11: costrutti di CLOuD9 associano irreversibilmente in risposta al trattamento a lungo termine di ABA. Co-immunoprecipitazione dimostrando associazione irreversibile delle proteine dCas9 CSA e CSP dopo 10 giorni di trattamento ABA e 10 giorni successivi di washout di ligando. Questa figura è stata modificata da complementare figura 11 a Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa figura.

Complementare tabella 1: elenco di primer sequenze per gRNAs, qRT-PCR, 3C e ChIP qPCR. Questa tabella è stata modificata da complementare tabella 1 in Morgan, Stefanie L., et al. 9. per favore clicca qui per scaricare questa tabella

Discussione

Le fasi critiche in CLOuD9 cromatina loop sono: 1) progettazione o utilizzando il gRNAs corretto, media 2) cambia ogni giorno sulle cellule trasdotte CLOuD9, tra cui ABA o DMSO, 3) mantenendo la freschezza dell'ABA e 4) esecuzione accurate e attenta valutazione di conformazione della cromatina.

I limiti di CLOuD9 risiedono principalmente nella capacità di progettare guide alla regione di destinazione della scelta. Guida RNAs eseguire l'importante compito di localizzare i componenti di dCas9 a regioni del DNA bersaglio per essere dimerized e l'efficacia delle guide si basano sul loro sito di destinazione specifica. Senza i componenti gRNA corretto, il sistema non sarà in grado di formare reversibilmente CLOuD9 indotto loop. Così, di progettare più guide per ogni area di interesse e diffondendo le guide in una regione di 250-1000 bp, sarà assicurata almeno una guida di successo. Posizione di guida è anche parte integrante risultati accurati. È importante evitare guide situate in siti di legame del fattore di trascrizione o altre regioni critiche per evitare effetti di sfondo come verso l'alto o verso il basso regolazione della trascrizione. Inoltre, l'ubicazione precisa del costrutto CLOuD9 può influire leggermente trascrizione del gene dell'obiettivo. Questo sottolinea l'importanza dei test più coppie di guide per ogni regione di destinazione, per identificare la coppia più robusta per scopi sperimentali. Ulteriormente, ogni coppia di regioni di destinazione, il costrutto CSA dovrebbe essere destinato con gRNAs S. aureus, e il costrutto CSP dovrebbe essere mirato con gRNAs per S. pyogenes per il targeting di specificità.

Per garantire risultati accurati e corretta dimerizzazione, è anche importante mantenere la freschezza degli ambienti cellulare seguendo la trasduzione dei costrutti di CLOuD9. Supporto giornaliero di modifica e l'aggiunta di dimerizer fresco (o controllo) assicura che i costrutti complementari rimarrà in prossimità e preservare la conformazione della cromatina alterata. Inoltre, garantendo l'ABA è fresco ed è stata conservata in modo appropriato secondo il protocollo del produttore (aperto entro 6 mesi, freddo, mantenuti protetti da luce) è essenziale per ottenere risultati autentici.

In particolare, il dimerizer di ABA per CLOuD9 è stato utilizzato con le proteine di dimerizzazione di ABI e PYL, piuttosto che più comunemente utilizzato sistema FRB e FKBP. La necessità di un rapalog per il sistema FRB/FKBP avrebbe limitato l'applicabilità di CLOuD9, a causa della tossicità per le cellule tumorali. Il sistema alternativo di ABI/PYL aggirato questa limitazione, abilitando in modo efficiente CLOuD9 essere più largamente utilizzabili.

Collettivamente, abbiamo sviluppato CLOuD9, una tecnologia unica e robusta che può con la forza ma reversibilmente creare contatti tra loci genomici destinazione a lungo raggio. Through inducendo cromatina loop, inoltre dimostriamo che CLOuD9 possono essere utilizzati per modificare l'espressione genica nel contesto cellulare appropriato. L'adattabilità della tecnologia consente lo studio senza restrizione delle interazioni tra qualsiasi due loci genomici, senza richiedere una conoscenza preventiva del ripetere le regioni o meccanismi di ciclo. Inoltre, unico reversibilità dimostrata di CLOuD9 un'ulteriore esame dei meccanismi loop in malattia e lo sviluppo. Mentre gli effetti su bersaglio di cromatina loop sono stati dimostrati chiaramente, c'è ancora di essere dati offrendo comprensione negli effetti di loop fuori bersaglio e il conseguente impatto sui cicli on target.

I nostri dati illustra solo alcune applicazioni di questo strumento, ma implica l'idea di fondo importante che la disposizione della cromatina è indicativa dell'espressione genica. La nostra tecnologia può essere utilizzata per studiare e rivelare le sfumature della struttura della cromatina nella regolazione genica, migliorando la comprensione globale del ruolo della cromatina pieghevole nella trascrizione dei geni. Una migliore comprensione delle sottigliezze di transcriptional dinamiche possono aprire la strada nella ricerca e nel trattamento di cancro, malattie ereditarie e disordini congeniti, in cui cromatina distinta Assemblea senza dubbio altera gene espressione20, 21,22,23. Lavori successivi utilizzando la tecnologia di CLOuD9 illuminerà ulteriori dettagli circa la disposizione e la dinamica della cromatina domini e come guidano pieghevole per sostenere l'espressione genica stabile in sviluppo e la malattia.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo e l'intero laboratorio di Wang per supporto tecnico e lettura critica del manoscritto. S.l.m. è stata sostenuta in questo lavoro attraverso la NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) e il National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. è supportato da un premio alla carriera per gli scienziati medici del Burroughs Wellcome fondo ed è un Donald E. e Delia B. Baxter Fondazione facoltà studioso.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Terreni RPMI 1640 Life Technologies11875-119Per colture cellulari K562
Terreni DMEM LifeTechnologies11995-0651X, per colture cellulari 293T
lentiCRISPR v2Addgene plasmide#52961Per lo sviluppo di plasmidi CLOuD9
pRSV-RevAddgene plasmide#12253Per la produzione di lentivirus
pMD2.GAddgene plasmid#12259Per la produzione di lentivirus
pMDLg/pRREAddgene plasmid#12251Per la produzione di lentivirus
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-019Per la produzione di lentivirus
anticorpi anti-HACell Signaling3724Per l'immunoprecipitazione
anticorpi anti-FlagSigmaF1804Per immunoprecipitazione
DNeasy Sangue e Tessuto KitQiagen69504Per l'estrazione del DNA
TRIzolLife Technologies15596-018Per l'estrazione dell'RNA
RNeasy KitQiagen74106Per l'estrazione dell'RNA
Superscript VILOLife Technologies11754-050Per cDNA 
SYBR Green I MasterMixRoche4707516001Per analisi qPCR
Light Cycler 480IIRochePer analisi qPCR
anticorpo anti-H3K4me3AbCamab8580Per ChIP-qPCR
anti-RNA Anticorpo Pol-IIMotivo attivo61083Per ChIP-qPCR
Inibitore della proteasi libera EDTARoche11873580001Per proteine estrazione
4-12% Tris Glycine gelBioradQualsiasi dimensione, Per western blot
anticorpo anti-Rabbit HRPSanta Cruzsc-2030Per western blot
anticorpi anti-topo HRPSegnalazione cellulare7076SPer western blot
K562 e H3K293 Dati ChIP-SeqCodificaPer l'analisi ChIP-seq
K562 e H3K293 Dati ChIP-SeqCodificaENCSR000APE Per l'analisiChIP-seq
K562 e H3K293 Dati ChIP-SeqCodificaPer l'analisi ChIP-seq
K562 e H3K293 Dati ChIP-SeqGEOGSM1479215Per l'analisi ChIP-seq
Dynabeads Protein A per l'immunoprecipitazioneThermo Fisher Scientific10001DPer l'immunoprecipitazione
Dynabeads Protein G per Termo Fisher Scientific10004Dper immunoprecipitazione
RNA Clean & Concentratore-5Zymo ResearchR1015Per la purificazione dell'RNA
Pierce 16% Formaldeide Senza metanoloThermo Fisher Scientific28908Per la reticolazione
PX458 PlasmideAddgene48138Plasmide Cas9 attivo suggerito per il clonaggio del gRNA, ma qualsiasi plasmide Cas9 attivo funzionerà
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104Per la purificazione
FastDigest BsmBIThermo Fisher ScientificFD0454Per RNA guida di clonazione
FastAPThermo Fisher ScientificEF0651Per RNA guida di clonazione
10X FastDigest BufferThermo Fisher ScientificB64Per RNA guida di clonazione
Kit di estrazione su gel QIAquickQiagen28704Per RNA guida di clonazione
10X T4 Ligation BufferNEBB0202SPer RNA guida di clonazione
T4 PNKNEBM0201SPer RNA guida di clonazione
2X Quick Ligase BufferNEBB2200SPer RNA guida di clonazione
LigaseNEBM2200SPer RNA guida di clonazione RNA
Buffers
Farnham lysis bufferTris-Cl pH 8,0 all'1%, SDS all'1%, soluzione acquosa di inibitore della proteasi all'1% (non EDTA) e 1 mM di EDTA in acqua Tampone
RIPA modificato1% NP40/Igepal, desossicolato di sodio 0,5%, SDS 0,1%, EDTA 1 mM e soluzione acquosa di inibitore della proteasi all'1% (non-EDTA) in PBS pH 7,8 o 7,4 Tampone
di diluizione IP0,01% SDS, Triton-X 100 all'1,1%, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, inibitore della proteasi 0,1x
Tampone100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40 e 1% desossicolato di sodio Tampone
di rigonfiamento0,1 M Tris pH 7,5, 10 mM acetato di potassio, 15 mM acetato di magnesio, 1% NP-40
Tampone0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris pH 8 e 167 mM NaCl
IP tampone di eluizione1% SDS, 10% NaHCO3  
ENCSR000AKU ENCSR000FCJ PCR Quick di lavaggio di diluizione

Riferimenti

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