Articolo metodologico

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

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DOI:

10.3791/57649

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3 maggio 2018

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1Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

Abstract

Modelli murini geneticamente (GEMM) sono estremamente utili nel rivelare nuove conoscenze biologiche sui meccanismi di iniziazione e progressione delle malattie umane come il cancro. Topi knock-out condizionale e transgenici sono stati usati frequentemente per la sovraespressione genica o tipi di ablazione in specifici tessuti o cellule in vivo. Tuttavia, la generazione di modelli murini di germline possono essere lunghe e costose. Gli avanzamenti recenti nel gene editing tecnologie e la fattibilità di erogare plasmidi di DNA tramite l'infezione virale hanno permesso la rapida generazione di modelli di germline non autoctono del topo del cancro per parecchi organi. La vescica è un organo che è stato difficile per vettori virali accedere, a causa della presenza di uno strato di glicosaminoglicani che copre l'urotelio. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato nel laboratorio per la distribuzione efficiente dei plasmidi di DNA nel mouse vescica urotelio in vivo. Tramite instillazione intravescicale di plasmide del DNA pCAG-GFP ed elettroporazione della vescica esposta chirurgicamente, indichiamo che il plasmide del DNA possa essere consegnato in particolare le cellule uroteliali della vescica per espressione transitoria. Il nostro metodo fornisce un modo veloce e conveniente per la sovraespressione e atterramento di geni nella vescica del mouse e può essere applicato alla costruzione di GEMM di cancro alla vescica e altre malattie urologiche.

Introduzione

Modelli murini geneticamente (GEMM) hanno giocato un ruolo essenziale ad ampliare la nostra conoscenza circa lo sviluppo animale, gene funzioni in vivoe meccanismi di malattia progressione1,2. Germline GEMM sono tradizionalmente sviluppato in due modi. Il primo è la creazione di topi transgenici di pronuclei iniezione del plasmide DNA seguito da trapianto di zigoti in femmine pseudopregnant. L'altra è la generazione di topi knock-out/knock-in di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali e lo sviluppo delle chimere. Knockout condizionale di geni nel tipo specifico dei tessuti o cellule di interesse comporta l'allevamento degli alleli geneticamente ingegnerizzati con siti Cre e flox per più generazioni. L'intero processo può essere costoso e richiede tempo, soprattutto se l'obiettivo è di indirizzare i geni multipli del tessuto-specifico. Recentemente, la modifica del gene tecnologie quali cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) sono state applicate a parecchi organi dei topi per indurre le alterazioni genetiche tessuto-specifico per il cancro autoctono modellazione3, 4,5,6,7 o mutazioni della malattia corretta in situ8,9. In questi studi, la consegna dei vettori gRNA solitamente è stata realizzata attraverso l'infezione adenoviral o lentivirale dell'organo o idrodinamico vena caudale iniezione. La relativa facilità di consegna dei componenti CRISPR il polmone ed il fegato ha notevolmente migliorato la comodità e l'efficienza di cancro in questi organi rispetto ai tradizionali modelli del mouse Cre-Lox basata di modellazione.

Il urothelium della vescica è dove la maggior parte dei tumori della vescica hanno origine. La consegna dei vettori di DNA per il urothelium della vescica per la terapia del gene o modellazione è ostacolata da uno strato di glicosaminoglicani sulla superficie apicale urothelial, che agisce come una barriera per l'aderenza di virus infettivi10,11. Diversi agenti di pretrattamento come Syn3 e dodecil-β-d-maltoside sono stati utilizzati per interrompere questa barriera e usufruire dell'adenovirus infezione efficienza12,13,14. Se il virus adeno-associato (AAVs) efficacemente può infettare la vescica non è stata segnalata. Nel complesso, un metodo di consegna di base non-virale sarebbe auspicabile. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato in laboratorio per consegna efficiente DNA del plasmide dell'urotelio del mouse tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Perché il nostro approccio non comporta pretrattamento chimico di strato di glicosaminoglicani o produzione di virus, significativamente semplifica la consegna dei plasmidi di DNA nell'urotelio vescica del mouse e dovrebbe facilitare vari studi in vivo di malattie di vescica.

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Protocollo

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California Santa Cruz.

1. plasmide e preparazione di strumenti

  1. Per ogni vescica a transfect, preparare almeno 20 µ l di plasmide del DNA (1 µ g / µ l).
  2. Aggiungere 1 µ l di Trypan Blue il 20 µ l di soluzione di plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL. Pipetta per mescolare bene.
  3. Autoclave tutti chirurgico strumenti e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente gli strumenti chirurgici e guanti con etanolo al 70% o utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro quando si eseguono le seguenti operazioni per mantenere condizioni di sterilità.

2. anestetizzante animale

  1. Utilizzare un sistema di anestesia top tavolo per anestetizzare l'animale con isoflurano. Girare sul serbatoio O2 e regolare il flussometro ossigeno a 1 L/min.
  2. Posto un topo C57BL/6J femmina adulto nella camera di induzione. Accendere e regolare il vaporizzatore di isoflurane al 3% per induzione. Il mouse dovrebbe essere in anestesia entro 2 min amministra buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea dopo la rimozione del mouse dalla camera di induzione per preemptive analgesia.
    Nota: Nel presente protocollo, i topi femminili sono usati, come sono più facili da lavorare con durante la cateterizzazione di uretra. Il protocollo funziona anche per topi maschi, ma prestare particolare attenzione è necessaria quando si esegue il passaggio 3.
  3. Applicare unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse anestetizzato rivolto verso l'alto su un rilievo di riscaldamento con il suo naso nel cono di naso. Girare l'interruttore del circuito di aria per lasciare isoflurano andare attraverso il cono di naso.
  4. Trattenere la testa e il naso a cono con nastro adesivo. Regolare il vaporizzatore di isoflurane al 2% per la manutenzione.
  5. Trattenere le membra con nastro adesivo. Eseguire test toe-pizzico per assicurarsi che l'animale è in anestesia profonda e quindi radere la zona addominale.

3. urina svuotamento e lavaggio della vescica

  1. Applicare il lubrificante al catetere (24G, 2,11 cm di lunghezza, diametro esterno di 0,045 cm) e garantire che la sua superficie esterna è completamente coperto.
  2. Inserire il catetere nell'uretra apertura e spingere lentamente fino a raggiungere la vescica, momento in cui l'urina dovrebbe defluire attraverso il catetere. Premere delicatamente l'addome per aiutare lo svuotamento dell'urina.
    1. Verifica se il catetere è inserito correttamente nella vescica osservando automatico urina fuori-flusso. Evitare piercing la parete della vescica e uretra e applicare il lubrificante più volte se necessario.
  3. Scartare l'urina con una pipetta in un becher da rifiuti.
  4. Pipettare 80 µ l di tampone fosfato salino (PBS) nell'estremità esterna del catetere, con l'altra estremità ancora nella vescica. Con attenzione è possibile collegare una siringa da 1 mL al catetere. Spingere delicatamente la siringa per iniettare il PBS nella vescica. Lasciare alcuni PBS del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.
  5. Rimuovere la siringa. Aspettare per la PBS drenare dalla vescica. Premere delicatamente l'addome per evacuare PBS.
  6. Scartare il PBS del catetere con una pipetta nel contenitore dei rifiuti.
  7. Ripetere PBS lavaggio (passaggi 3.4-3.6) per altre due volte.
    Nota: È fondamentale lavorare delicatamente durante queste fasi di lavaggio. Sangue nel catetere o il fallimento di automatico fuori-fluire del liquido indica in genere l'uretra è trafitto. È anche importante evitare di introdurre bolle d'aria, come essi potranno diminuire l'efficienza di elettroporazione.

4. plasmide consegna

  1. Applicare etanolo al 70% all'addome del mouse e utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale di 1 cm per aprire la pelle dell'addome sopra la vescica.
  2. Pipettare almeno 20 µ l di plasmide plus soluzione tripan blu in estremità esterna del catetere e collegare la siringa.
  3. Iniettare la soluzione di plasmide nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione è successo. Lasciare un po' di liquido del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.
  4. Afferrare l'orifizio uretrale esterno con pinzette e quindi rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una stringa per stringere l'orifizio uretra esterno. Fare due anelli con la stringa e poi legare con due nodi.
    Nota: Serraggio dell'uretrale è importante per impedire il riflusso del liquido del plasmide.
  5. Accendere il generatore di elettroporazione con i seguenti parametri: 33V, 50 ms tempo di lavoro e 950 ms tempo di intervallo.
  6. Tenere la vescica con una pinzetta e pizzicare la vescica con due elettrodi. Spingere il pedale per eseguire l'elettroporazione.
    Nota: Gli impulsi elettrici sono impostati a verificarsi 5 volte con brevi intervalli di tempo dopo ogni pressione del pedale. Il mouse può contrarsi in questo processo. Spingendo il pedale più di una volta può aumentare l'efficienza di consegna, ma anche molti impulsi elettrici possono danneggiare l'integrità del tessuto dell'urotelio.
    1. Evitare il contatto tra le pinzette e gli elettrodi, come questo genererà una scintilla.

5. il recupero

  1. Suturare l'apertura addominale e pelle con sutura chirurgica sterile e clip. Applicare iodio sulla ferita.
  2. Rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Amministrare la buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio.
  3. Tenere l'animale il termoforo e tornare alla gabbia a casa dopo il recupero completo. Controllare l'animale almeno una volta al giorno per la normale mobilità, abbeveraggio e alimentazione comportamenti e senza segni di infezione, fino a quando l'incisione è guarito e quindi rimuovere le clip. Se l'animale Visualizza il sintomo di dolore come ridotto toelettatura, aumentata aggressività e vocalizzazione, somministrare iniezioni successive di buprenorfina analgesico.

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Risultati

Per dimostrare il successo di consegna del gene in urothelium della vescica, abbiamo usato il plasmide di15 pCAG-GFP per elettroporazione. 20 µ l di soluzione Trypan Blue e plasmide è stato iniettato attraverso l'uretra e 5 impulsi elettrici sono stati amministrati. Dopo 48 h, abbiamo dissecato la vescica del mouse e osservato le patch di fluorescenza di GFP sotto un microscopio di fluorescenza di dissezione, mentre un negativo di controllo della vescica che non su...

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Discussione

Elettroporazione migliora la permeabilità della membrana cellulare ed è una potente tecnologia per gene electrotransfer16. Consegna del gene in roditori vivente mediante elettroporazione è stato frequentemente utilizzato in neurobiologia campi17,18,19,20,21. Le sue potenziali applicazioni in molti altri organi non sono stati esplorati e...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang per aiuto con configurazione del sistema di elettroporazione. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal gruppo beneficio del cancro di Santa Cruz e NIH di Z.A.W.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringa BD 1mL TBFisher148232E
BuprenorfinaSigmaB9275-50MG
Pinzette DumontRoboz Surgical InstrRS-5005Trattare con etanolo al 70% prima dell'uso chirurgico
ECM830 SQ Wave ElectroporatorHarvard Apparatus450052
Exel International Safelet monouso Cateteri per fleboFisher Scientifico14-841-2124G, lunghezza 2,11 cm, diametro esterno 0,045 cm
Forbici per microdissezione extra finiRoboz Surgical InstrRS-5135Trattare con etanolo al 70% prima dell'uso chirurgico
IsofluranoVet one501017
K& H Tappetino riscaldato per piccoli animali, 9 per 12 pollici Amazonn/aCoprire il tappetino termico con tovaglioli di carta
Unguento oftalmicoFisherNC0849514
PBS, pH7.4Life Technologies10010049
Punte di pipetta 200 e micro; LUSA Scientific1111-0206
Punte per pipette, universali; da 0,1 a 10 &; LFisher02707438(CS)
PIPETMAN NEO P2GilsonF144561
PIPETMAN NEO P200NGilsonF144565
plasmide CAG-GFPAddgene16664
Platino pinzetta 5 mmHarvard Apparatus4504895 mm
di diametro ForbiciRoboz Surgical InstrRS-5880Trattare con 70% di etanolo prima dell'uso chirurgico
Cordone per cordeAmazonn/aMandala Crafts 150D 210D 0,8 mm 1 mm in pelle per cucire cuciture filo cerato piatto corda Corda
per corde Nastro, ScotchFisher19047257
Therio-gel Lubrificante veterinarioPBS salute degli animali353-736
Trypan Blue StainLife Technologies15250061
V-1 Piano del tavolo sistema di anestesiaVetEquip901806
Vicryl sutura viola 18" FS-2 taglio 5-0FisherNC0578475
Walgreens Povidone Iodio 10%Walgreens953982
Clip per feriteFisher018045
Applicatore di clipper ferite Fisher01804

Riferimenti

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Tecnica di elettroporazionecancro alla vescica del toposovraespressione genicainstillazione intravesicaleespressione di GFPcolorazione immunofluorescenteesposizione chirurgicacellule uroteliali

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