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Articolo metodologico

Modello murino aspirazione orofaringea di polmonite batterica associata a ventilazione e acquisite in ospedale

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DOI:

10.3791/57672

⸱

28 giugno 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, LAC+USC Medical Center

In questo articolo

Sommario

Polmonite infettiva è tra le più comuni infezioni nell'uomo. Un modello appropriato in vivo è fondamentale per comprendere la patogenesi della malattia e dell'efficacia di nuove terapie. Con questo modello di polmonite di aspirazione orofaringea murino, si può esaminare la patogenesi ed i nuovi trattamenti contro queste infezioni mortali.

Abstract

Modelli murini di infezione sono fondamentali per comprendere la patogenesi della malattia e dell'efficacia di approcci terapeutici progettati per combattere gli agenti patogeni causativi. Polmonite infettiva è tra le più comuni infezioni presentate dai pazienti nella clinica e garantisce così un modello appropriato in vivo . Polmonite tipica modelli utilizzano inoculazione intranasale, che depositi eccessivi organismi di fuori del polmone, causando complicazioni fuori bersaglio e sintomi, come la sinusite, gastrite, enterite, trauma fisico o microparticella di nebbia per imitare aerosol diffusione più tipica di polmonite virale, tubercolotica o da fungo. Questi modelli non riflettono accuratamente la patogenesi di polmonite batterica tipica di comunità o assistenza sanitaria acquistata. Al contrario, questo modello murino di polmonite di aspirazione orofaringea imita l'itinerario della gocciolina in polmonite acquisita in assistenza sanitaria. Inoculando 50 µ l di batteri sospensione nell'orofaringe dei topi anestetizzati causa aspirazione riflessivo, che si traduce in polmonite. Con questo modello, si può esaminare la patogenesi degli agenti patogeni che causano polmonite e nuovi trattamenti per combattere queste malattie.

Introduzione

Infezione respiratoria più bassa è la malattia infettiva più mortale del mondo e la più comune causa di morte nei paesi in via di sviluppo1. Globalmente, queste infezioni rappresentano più di 3,2 milioni di morti nel1. Inoltre, polmonite nosocomiale è tra le forme più comuni e più mortale delle infezioni acquisite assistenza sanitaria ed è causata da agenti patogeni più resistenti agli antibiotici2,3. Il tipico percorso di acquisizione di polmonite batterica per entrambi acquisita in comunità e polmonite nosocomiale è l'aspirazione orofaringea contenuto negli alveoli. Modelli murini usati per studiare queste malattie spesso utilizzano inoculazione intranasale4, gran parte dei batteri di fuori del polmone, causando complicazioni fuori bersaglio e sintomi come sinusite e traumi fisici, che sono incongruenti con la malattia del deposito progressione in essere umano che i modelli sono stati progettati per emulare. Altri modelli possono utilizzare inalazione chambers e dispositivi di micromisting, che più accuratamente imitano le polmoniti virali, tubercolotiche e fungine, ma non con precisione ricapitolare il normale percorso di acquisizione per polmoniti batteriche tipiche.

Il modello di polmonite di aspirazione orofaringea murino può essere utilizzato per simulare l'itinerario naturale e la patogenesi di polmonite batterica. Inoculando 50 µ l della sospensione batterica in orofaringe dei topi anestetizzati utilizzando una pipetta, riflessivo aspirazione segue, che si traduce in polmonite infettiva. Usando questo modello, si può esaminare la patogenesi degli agenti patogeni che causano polmonite e nuovi trattamenti per combattere queste malattie con un modello di fedeltà superiore, più simile alle infezioni di polmonite di aspirazione osservate nell'uomo. Inoltre, a differenza di modelli simili che infettare attraverso la cavità orale5,6, questo modello assicura che l'inoculo completo raggiunge i polmoni invece l'intestino, dove può causare infiammazione off-site e infezioni, come la gastrite ed enterite. Infine, a differenza di un altro modello pubblicato che richiede un laringoscopio e inoculates attraverso la trachea7, questo modello non ostruire le vie respiratorie con un ago sonda gastrica e non richiede l'iniezione per consegna di inoculo. Invece, l'inoculazione si basa sul riflesso di aspirazione naturale del mouse.

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Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali devono essere approvate dal ricercatore istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).

1. preparazione dell'inoculo batterico

  1. Isolare le colonie batteriche.
    1. Striscia un ceppo batterico (ad es., a. baumannii "HUMC1") su appropriato sterile agar (ad es., agar soia triptico), facendo attenzione a generare colonie isolate.
    2. Incubare a condizioni appropriate (ad esempio, durante la notte a 37 ° C).
  2. Far crescere cultura durante la notte.
    1. Selezionare un rappresentante, Colonia isolata dalla piastra di agar con un'ansa sterile da inoculo e utilizzarlo per inoculare 10 mL di terreno di brodo sterile appropriato (ad es., brodo di soia triptico).
    2. Lasciare il campione raggiungere la fase stazionaria in condizioni adeguate (ad es., 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte in un flaconcino di forma conico tappo sfiato, 50 mL).
  3. Crescere la sottocultura.
    1. Trasferire 10 mL di brodo sterile fresco utilizzando una pipetta 100 μL di coltura durante la notte.
    2. Permettono di raggiungere la fase esponenziale/registro alle condizioni adeguate (ad es., 37 ° C con agitazione a 200 giri/min per 3 h in un flaconcino di forma conico tappo sfiato, 50 mL).
  4. Lavare la sottocultura.
    1. Rimuovere la sottocultura dal suo ambiente di incubazione.
    2. Centrifugare a 4.000 × g per 5 min appallottolare i batteri.
    3. Aspirare e scartare il surnatante.
    4. Aggiungere 10 mL di soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS) per il pellet e vortexare energicamente fino a quando completamente in sospensione.
    5. Ripetere i passaggi 1.4.2 - 1.4.4 due volte, per un totale di 3 lavaggi.
  5. Regolare la concentrazione di sospensione batterica.
    1. Utilizzando uno spettrofotometro che misura la densità ottica a 600 nm (OD600), misurare la densità ottica della sospensione batterica.
    2. Aggiungere PBS sterile alla sospensione batterica fino a quando la densità ottica dell'inoculo scende a un OD600 pari a 0,5, utilizzando l'equazione Cho× Vho = Cf× Vf, dove "C" è la concentrazione, "V" è il volume, "io" è iniziale, e "f" è definitiva. * Cf dovrebbe sempre essere 0,5; Vf è la variabile da risolvere.
    3. Se la sospensione batterica scende sotto un OD600 di 0,5, e centrifugare a 4.000 × g per 5 min a pellet i batteri e rimuovere una quantità appropriata di surnatante per raggiungere un OD600 pari a 0,5.
    4. Effettuare diluizioni seriali nel PBS sterile (ad esempio, tre diluizioni 1: 100 per raggiungere 1 × 10-6) e la piastra su agar sterili per determinare il coefficiente di correlazione che rivela la concentrazione batterica in formanti colonie unità / mL (CFU/mL) a un OD600 pari a 0,5.
      Nota: Il valore di questo coefficiente di correlazione varia per ogni ceppo di ogni specie e deve essere determinato prima della preparazione dell'inoculo per un'infezione.
    5. Dopo aver determinato il coefficiente di correlazione, utilizzarlo per creare un inoculo di ottenere la concentrazione desiderata (ad es., 2 × 108- 1 × 109 CFU/mL); Se l'inoculo desiderata è maggiore rispetto al OD600 pari a 0,5, centrifugare la sospensione batterica a 4.000 × g per 5 min a pellet i batteri e rimuovere una quantità appropriata di surnatante per raggiungere la concentrazione desiderata.
    6. Eseguire in vivo studi pilota per determinare la virulenza di ogni isolato batterico in ogni sforzo del topo come questi valori variano tra gli isolati batterici della stessa specie e topi di diverso background genetico. Per diverse specie gram-negativi, LD100 nei topi è generalmente 1-5 × 108 CFUs/mouse, anche se alcuni ceppi sono letali a inoculi inferiori.
  6. Congelare aliquote identiche per uso futuro come inoculi on demand, precisi, come precedentemente pubblicati8 (opzionale).
    1. Preparare 1 L di inoculo batterico come descritto sopra, trasferimento a due fiale coniche 500 mL e centrifugare a 4.000 × g per 5 min.
    2. 450 mL di surnatante da ogni flaconcino conico di scartare e risospendere il pellet di batteri nel surnatante rimanente.
    3. Trasferire l'inoculo batterico concentrato in un becher da 250 mL contenente un'ancoretta magnetica e mescolare continuamente sopra una piastra stir a 300 giri/min.
    4. Trasferire con cautela esattamente 600 μL di concentrato inoculo batterico (ad es., 1 × 1010 CFU/mL) usando una pipetta un flaconcino criogenico di 1,6 mL contenente esattamente 300 μL di sterile H2O e 300 μL di glicerolo sterile; mescolare e conservare a-80 ° C.
      Nota: Il necessario per la memorizzazione di glicerolo può confondere i risultati sperimentali e causare mortalità in eccesso, quindi è necessario lavare fuori.
    5. Quando si è pronti per l'uso, scongelare il campione per 10 min a temperatura ambiente.
    6. Trasferire 1 mL in un flacone conico da 50 mL, aggiungere 9 mL di PBS sterile e centrifugare a 4.000 × g per 5 min appallottolare i batteri. Aspirare il supernatante e risospendere il quantitativo predeterminato di CFUs (mL 1 × congelati stock concentrazione in CFU/mL) in un volume adeguato di PBS per raggiungere la concentrazione desiderata per l'inoculo infettiva.

2. anestetizzante topi

  1. Chetamina/xilazina
    Nota: L'anestesia con chetamina/xilazina ha una lunga durata, che offre il tempo sufficiente per il ricercatore che è di nuovo a questa tecnica per completare la procedura di inoculo prima che il mouse si risveglia.
    1. Preparare 10 mL di soluzione iniettabile combinando 8,5 mL di pharmaceutifcal grado PBS, 1 mL di 100 mg/mL soluzione di riserva di ketamina (concentrazione finale 10mg/mL) e 0,5 mL di 20 mg/mL soluzione stock xilazina (concentrazione finale di 10 mg/mL).
    2. Somministrare 10 μL/g tramite l'iniezione intraperitoneale (IP) (ad es., 250 μL per un mouse 25-g).
    3. Applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi anestetizzati con chetamina/xilazina perché i loro occhi sono soggette a danni durante periodi prolungati di anestesia.
    4. Posizionare il mouse in una gabbia e monitorare fino a quando si sveglia dall'anestesia.
      Nota: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.
  2. Isoflurano
    Nota: Topi rapidamente sveglia dall'anestesia indotta da isoflurane dopo essere stato rimosso dalla camera di induzione, quindi questo metodo di anestesia dovrebbe essere utilizzato solo dopo essere diventato abile alla procedura di inoculo.
    1. Posizionare i topi ingenuo in una camera di dimensioni adeguate ad induzione con ossigeno che scorre.
    2. Dopo che la camera è sigillata, anestetizzare i topi utilizzando un vaporizzatore di precisione per aggiungere isoflurano al 4% (v/v) per almeno 5 min; confermare l'anestesia rimuovendo un mouse dalla camera di induzione e misura quanto tempo ci vuole per svegliarsi dall'anestesia (~ 60 s).
      Nota: Tenere presente che l'anestesia, i tempi possono variare basato sulle linee guida istituzionali e alcuni animali potrebbero necessitare di più di 5 min per diventare completamente anestetizzato.
    3. Mantenere l'anestesia per fino a 10 min regolando la concentrazione di isoflurane per 2-3%; Se la durata totale dell'anestesia è > 15 min, applicare unguento oftalmico agli occhi dei topi anestetizzati.
    4. Posizionare il mouse in una gabbia e monitorare fino a quando si sveglia dall'anestesia, come descritto al punto 2.1.

3. Inoculare/infettando topi

  1. Sospendere un mouse anestetizzato, appeso da suoi incisivi superiori su una stringa forte, sottile (ad es., filo interdentale) fissati ad un oggetto fisso ad un'altezza circa due volte del mouse lunghezza del corpo (ad es., 20 cm) sopra la superficie operativa (ad es. banco di laboratorio).
  2. Tirare delicatamente la linguetta del mouse fuori dalla sua bocca utilizzando pinze sterili, smussato-conclusa. Trasferire la lingua un dito guantato, sterile antischiacciamento accidentale della linguetta del mouse. Tenere la lingua fuori della bocca, consentendo l'accesso all'orofaringe e impedendo la deglutizione dell'inoculo al lato.
  3. Tenendo la linguetta del mouse, inserire l'inoculo di 50 μL (sospensione batterica) l'orofaringe utilizzando una micropipetta; l'orofaringe è situato all'incrocio tra la cavità orale e della faringe verso il retro della bocca.
    Nota: È molto importante trasmettere solo liquido di pipettaggio per la prima tappa della micropipetta. Il mouse sarà smettere di respirare per alcuni secondi quando l'inoculo è collocato nell'orofaringe; alla fine, riflessivo aspirazione causerà il mouse per inalare la sospensione batterica, indicata dal rumore caratteristico crepitio di liquido di penetrare nei polmoni, che si traduce nell'infezione di polmonite.
  4. Se l'inoculo è posizionato non lontano indietro abbastanza per bloccare la respirazione normale, pizzicare le narici con il forcipe per forzare riflessivo aspirazione attraverso la bocca e la successiva inalazione dell'inoculo.
  5. Dopo l'inoculazione, sganciare la linguetta, rimuovere il mouse dalla stringa di sospensione, metterlo in una gabbia e monitorare fino a quando si sveglia dall'anestesia, come descritto al punto 2.1.

4. monitorare la progressione della malattia

Nota: A causa di sofferenza animale, vari indicatori dovrebbero essere utilizzati per indicare quando i topi diventano moribondi; l'eutanasia deve essere eseguita seguendo questa determinazione, secondo un protocollo IACUC precedentemente approvato; i vari indicatori di moribundity includono la temperatura corporea, perdita di peso, aspetto, andatura e altri biomarcatori che possono essere ottenuti dal sangue (ad es., tramite iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.

  1. Eutanasia i topi secondo protocollo IACUC precedentemente approvato (ad es., CO2 seguita da dislocazione cervicale).
  2. Rimuovere i polmoni da mouse eutanasizzato tagliando trachea, arteria polmonare e della vena polmonare vicino ai polmoni.
    1. Microscopia
      1. Posizionare i polmoni (o parte) in uno stampo di esemplare.
      2. Riempite lo stampo di esemplare con ottimale taglio temperatura (t.o.c.) composto, sommergendo completamente il tessuto.
      3. Congelare il campione a-80 ° C.
      4. Inviare il campione ad un laboratorio di patologia di sezione e montare su vetrini per microscopia.
    2. Carica batterica
      1. Pesare il tessuto polmonare una bilancia analitica.
      2. Trasferire il tessuto polmonare al flaconcino conico da 50 mL contenente 2-5 mL di PBS sterile (a seconda delle dimensioni del tessuto).
      3. Omogeneizzare il tessuto polmonare con un omogeneizzatore del tessuto.
      4. Effettuare diluizioni seriali dell'omogenato in PBS sterile fino a raggiungere circa 1.000 CFU/mL, basato su previsto carica batterica nei polmoni.
        1. Ad esempio, se è previsto 1 × 109 CFU/mg, eseguire tre diluizioni 1: 100: trasferire 100 μL di omogenato a 9,9 mL di PBS e vortice; Questa è la prima diluizione di 1: 100. Trasferire 100 µ l della diluizione 1: 100 prima a 9,9 mL di PBS e vortice; Questa è la seconda diluizione 1: 100. Trasferire 100 µ l della diluizione 1: 100 seconda a 9,9 mL di PBS e vortice; Questa è la diluizione di 1: 100 terzo e finale.
        2. Se la carica batterica nei polmoni è sconosciuto, eseguire una serie di diluizioni di catturare nell'intervallo previsto.
      5. Diluizioni di piastra su agar sterile.
        1. Preparare sterile Tryptic Soy brodo (TSB) con piastre di agar (TSA): 30 g di TSB Combine, 15 g di agar e 1 L di acqua, mescolare con un agitatore magnetico e riscaldare fino ad ebollizione a ~ 100 ° C per 5 min, Consenti per raffreddare e quindi autoclave su ciclo liquido per 15 min. Consenti raffreddare a ~ 55 ° C, trasferimento 10 mL appena sterilizzato nell'autoclave TSA di Petri sterili e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Lasciate asciugare su benchtop per 2-5 d o scoperto sotto una cappa di biosicurezza per 10 min.
        2. Trasferire 100 µ l della diluizione a una piastra Petri contenente TSA sterile e si sono diffuse attraverso TSA utilizzando una spatola o perline di vetro.
        3. Memorizzare la capsula di Petri durante la notte a 37 ° C in un incubatore (cioè, incubatore 37 ° C contenente un becher 1L scoperto riempito d'acqua)
      6. Determinare omogeneato del polmone CFU/mL sulla placcatura agar basata (ad esempio, 100 CFUs sulla piastra TSA con 100 μL di terza e ultima diluizione sopra descritto sarebbe 100 CFU/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil n. 3 = 1 × 109 CFUs/mL).
      7. Calcolare il tessuto polmonare CFUs/mg basato dividendo omogeneato del polmone CFU/mL di mg del polmone omogenato di tessuto/mL (per esempio, se utilizza un campione descritto sopra 100 mg di tessuto polmonare omogeneizzato in 5 mL di PBS, poi 1 × 109 CFU/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 CFUs/mg).

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Risultati

Seguendo scrupolosamente il protocollo, riproducibili e affidabili dati possono essere facilmente ottenuti. È fondamentale rispettare rigorosamente di uno protocollo di preparazione dell'inoculo su misura per esperimenti per essere paragonato a una vicenda. Inoltre è importante gestire correttamente topi durante la procedura di infezione. Assicurarsi di posizionare i topi in una camera di anestesia privo di isoflurane. Topi panico se vengono inseriti in una camera che è stato pre-riempita...

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Discussione

Per essere sicuri, topi non sono esseri umani in miniatura. Risultati ottenuti da modelli murini devono essere considerati nel contesto e successivamente interpretati per applicabilità agli esseri umani, basata su differenze e similitudini tra le due specie6. È anche importante scegliere il ceppo del mouse appropriato come certi sono più suscettibili di alcune infezioni rispetto ad altri; lo stesso vale per il ceppo patogeno di scelta16.

È essenz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Allergy e malattie infettive presso il National Institutes of Health [Grant numeri R01 AI117211, R01 AI130060, la R21 AI127954 e R42 AI106375 BS] e US Food and Drug Administration [contratto HHSF223201710199C a BML].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarBD214530Combinare con TSB per realizzare perline TSA
135003 Kimblevetro borosilicatoSterilizzare mediante cottura o sterilizzazione in autoclave prima di ogni utilizzo
Becher, 250 mLPyrex1003Utilizzato durante l'aliquotazione precisa di inoculi batterici concentrati
CentrifugaSorvallST 40RCapace di 4.000&volte; g a 4 gradi;
Camera C per anestesiaKent Scientific CorporationVetFlo-0720Ospita fino a 5 topi
Cryomold, dimensioni intermedieSakura Tissue-Tek4566Stampi monouso per campioni di vinile, 15& 15&volte;
Filo interdentaleOral-B37000469537Legare al perno stabile a circa 6" sopra l'altezza del tavolo
PinzeVWR82027-440Utilizzato per estrarre delicatamente la lingua dalla bocca del topo
Omogeneizzatore per tessuto polmonareOmni InternationalTM125-115prima del primo utilizzo; risciacquare tra i campioni
Isoflurano per anestesiaAbbott10015516È possibile utilizzare farmaci alternativi; modificare la procedura di conseguenza
Cartuccia iSTATAbbott03P79-25Sono disponibili varie cartucce per soddisfare le vostre esigenze
Ketamina, 100 mg/mLWestern Medical Supply4165Diluire 1:10 in PBS a 1 mg/mL e combinare con xilazina a 1 mg/mL
Unguento per gli occhiAkornRinnovato Evitaredi toccare gli occhi con la punta del dosatore
Temperatura di taglio ottimale (O.C.T.) CompostoFisher Scientific23-730-571Utilizzato per congelare campioni polmonari a -80 ° C per preparare il sezionamento patologico
Piastra di PetriVWR25384-302Polistirene, monouso, sterilizzato, 100&volte; Soluzione
salina tamponata con fosfato (PBS)mmCorning21-031-CMPBS di Dulbecco senza calcio e magnesio Puntali
pipette, 200-μ LVWR10017-044Autoclave prima dell'uso
Pipetta, 200-μ LGilsonPipetman P200Autoclave e calibrare prima dell'uso
Spalmatore, cellula battericaBel-ArtF377360006Sterilizzare mediante cottura o sterilizzazione in autoclave prima di ogni utilizzo
Barra di agitazione, magnetica, 7,9 mm Diametro e tempi; 38,1 mm LunghezzaVWR58948-150Utilizzato per mescolare inoculi batterici concentrati durante l'aliquotazione
Piastra di agitazione,CorningPC-620DUtilizzato per mescolare inoculi batterici concentrati durante l'aliquotazione
Brodo di soia triptico (TSB)BD211822Combinare con l'agar per ottenere
fiala TSA, conica, sterile, 50 mLCorning431720Utilizzata per la preparazione di inoculi batterici
Fiala, conica, sterile, 500 mLCorning431123Utilizzata per concentrare inoculi per la preparazione di inoculi congelati
Fiala, criogenica, 2,0 mLCorning430659Utilizzato per la conservazione criogenica di inoculi batterici concentrati
Xilazina, 20 mg/mLAkornAnaSed InjectionDiluire 1:20 in PBS a 1 mg/mL e combinare con ketamina a 1 mg/mL
, in da 5 mm Autoclave Lacrime di da 15 per magnetico una

Riferimenti

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