Summary
Beta-celle funksjonen er viktig for blodsukker homeostase, som er evaluert encellede oppløsning bruker genetisk kodet reporter for kalsium tilstrømningen.
Abstract
Bukspyttkjertelen beta-cellene svare på økende blod glukose konsentrasjoner av sekresjon hormon insulin. Dysfunksjon av beta-cellene fører til hyperglykemi og alvorlig, livstruende konsekvenser. Forstå hvordan beta-cellene opererer under fysiologiske forhold og hvilke genetiske og miljømessige faktorer kan føre deres dysfunksjon kan føre til bedre behandlingstilbud for diabetiker pasienter. Muligheten til å måle kalsium nivåer i beta-cellene fungerer som en viktig indikator for beta-celle funksjonen, som tilstrømningen av kalsium ioner utløsere insulin utgivelsen. Her beskriver vi en protokoll for overvåking glukose-stimulert kalsium tilstrømningen i sebrafisk beta-cellene ved hjelp av GCaMP6s, en genetisk kodet sensoren av kalsium. Metoden kan overvåke intracellulær kalsium dynamikken med encellede oppløsning i ex vivo montert holmer. Glukose-responsen til beta-cellene i den samme Holmen kan hentes samtidig under forskjellige glukose konsentrasjoner som antyder tilstedeværelsen av funksjonelle heterogenitet blant sebrafisk beta-cellene. Videre er gir teknikken høy timelige og romlig oppløsning, som avslører oscillasjon natur kalsium tilstrømningen på glukose stimulering. Vår tilnærming åpner dørene for å bruke sebrafisk som modell for å undersøke bidrag av genetiske og miljømessige faktorer beta-celle funksjonen og dysfunksjon.
Introduction
Våre blodsukker opprettholdes i et lite område, i stor grad på grunn av funksjon av endokrine bukspyttkjertelen. Endokrine rollen bukspyttkjertelen utføres av holmer Langerhans, som inneholder hormon-sekresjon celler. Insulin sekresjon beta-cellene er ansvarlige for å redusere nivået av blodsukker etter et karbohydrat inneholder måltid. Utilstrekkelig insulinsekresjon fra beta-celle kan føre til diabetes1, som er preget av vedvarende høyt blodsukker. Type 1 og Type 2 Diabetes, som nå rammer mer enn 400 millioner mennesker over hele verden, fører til sykelighet og dødelighet2. Ved å undersøke de molekylære og miljømessige faktorene som bidrar til beta-celle dysfunksjon, vil vi forstå bedre hvordan type 2 diabetes starter og utvikler seg. I tillegg kan muligheten til å skille menneskelige stamceller i funksjonelle beta-cellene i vitro gi en kilde til nye beta-cellene for celle-erstatning terapi i Type 1 Diabetes. Dette er det viktig å studere beta-celle funksjonen og modning i genetisk modell organismer for å få den nødvendige kunnskapen for å gjøre funksjonelle beta-cellene i en rett.
Beta-celle funksjonen kan overvåkes på hele-Holme nivå av kvantifisere den totale mengden insulin utskilles i respons på glukose-stimulering. Denne kumulative studier Holmen som en enkelt gruppe celler uten skille en celle personlige egenskaper. Men avslørte analyse av glukose svar på beta-enkeltceller et mangfold i beta-cellene funksjonelle egenskaper og tilstedeværelsen av heterogenitet3. For å vurdere funksjon av beta-enkeltceller, er det mulig å overvåke intracellulær endringene føre til insulin sekresjon4. Insulinsekresjon er foran en oppføring av glukose i beta-cellene. Glukose som angir i beta-cellene metaboliseres raskt til ATP. Høyere intracellulær ATP konsentrasjoner reduserer åpne sannsynligheten for ATP-sensitive kalium ionekanaler fører til beta-celle depolarization. Depolarization åpner spenning-sensitive kalsium ion kanalene og øker intracellulær kalsium. I sin tur utløser kalsium exocytosis av insulin, som er utgitt i sirkulasjon og senker blodsukkeret ved å fremme glukose-utnyttelse5,6,7.
Flere strategier er brukt for å undersøke funksjonen av beta-cellene, inkludert overvåking av membran potensialet8, direkte visualisering av insulin-blemmer exocytosis9og kvantifisering av intracellulær Ca2 + strøm som en proxy for glukose-respons10. Blant dem gir bildebehandling av intracellulær Ca2 + fordelen av opp-skalering analyse på flere individuelle celler i den samme Holme11,12, tillater for direkte sammenligning av glukose-responsen mellom enkelte beta-cellene. Intracellulær Ca2 + konsentrasjon kan overvåkes ved hjelp av kalsium-sensitive fluorescerende fargestoffer13 eller genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs)14. Mens kalsium-indikator fargestoffer mangel celle-type spesifisitet, GECIs kan uttrykkes i en bestemt celle type av bestemte arrangørene. Dessuten gir den nye generasjonen av GECIs, som GCaMP6, bedre signal-til-støy-forhold med raskere timelige dynamics15. Her beskrive vi nytten av den nye generasjonen av GECIs, i bestemte GCaMP6s, visualisere kalsium i beta-celler i én celle oppløsning. Vi bruke denne metoden sebrafisk primære Holmen som vår modell av valg. Under embryonale utviklingen, beta-cellene i den primære Holmen kommer fra den rygg og ventrale bukspyttkjertelen knopper16. Den primære Holmen ligger en stereotype anatomisk posisjon innenfor sebrafisk bukspyttkjertelen, slik at dens enkel identifisering og isolering. Beta-cellene i den primære Holmen er nødvendig for glukose-regulering, som deres genetisk ablasjon fører til hyperglykemi17,18. Videre svarer disse beta-cellene glukose under tidlig sebrafisk utvikling19. Denne protokollen kan også brukes i imaging sekundære øyene, som er under den etter embryonale stadier. Protokollen lar bildet beta-cellene ex vivo, ved senere stadier av utvikling og under definerte glukose konsentrasjoner.
Protocol
Alle prosedyrer inkludert dyr fag er godkjent av det dyr velferd gjerning og med tillatelse fra Landesdirektion Sachsen, Tyskland (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016).
1. forberedelse
Merk: Denne protokollen er ex vivo avbilding av sebrafisk primære Holme fra dobbel transgene Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); VS (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 sebrafisk. På denne transgene linjen insulin arrangøren (ins) kjører beta-celle bestemte uttrykk for to effekter av transgener: nls-Renilla-mKO2, som markerer kjernen av beta-cellene med monomerisk Kusabira oransje 2 (mKO2) fluorescens; og GCaMP6s15, som avgir grønne fluorescens Svar å øke i intracellulær kalsium nivåer. Beta-celle-spesifikk av GCaMP6s kan studere glukose-responsen til beta-cellene uten innblanding fra kalsium endringer i rundt celletyper.
- Forberede frisk fibrinogen lager (10 mg/mL) ved å løse opp 10 mg av bovin fibrinogen i 1 mL av Ca2 +/Mg2 +-inneholder Hanks' balansert Salt løsning (HBSS) i en 1,5 mL sentrifuge rør. Vortex kraftig til fibrinogen pulver oppløses helt. Holde løsningen ved romtemperatur for minst 15 minutter mer.
Merk: Lager kan oppbevares ved romtemperatur for 2-3 h. Forkast aksjen løsningen begynner å danner og blir tyktflytende. - Forberede fibrinogen fungerende løsning (3,3 mg/mL) fortynne fibrinogen lager tre ganger i HBSS. For eksempel bland 300 µL av fibrinogen aksjer i 600 µL av HBSS å forberede 900 µL av fibrinogen fungerende løsning.
- Forberede trombin løsning (10 U/mL) ved å løse opp 10 enheter av trombin i 1 mL av HBSS eller fosfat bufret saltvann (PBS).
Merk: Denne løsningen kan være forberedt på forhånd, aliquoted i 50 µL deler og frosset ved 20 ° C. - Forberede 200 mM D-glukose løsning ved å løse opp 1,8 g D-glukose i 50 mL vann. Vær 4 ° C for langtidslagring.
- Klargjør 300 mM KCl løsning ved oppløsning 1.1 g KCl i 50 mL vann. Vær 4 ° C for langtidslagring.
- Skaffe 35 mm diameter glass bunn retter for montering av holmer.
- Bruk stereo mikroskop fluorescens lampe og røde filteret kuben for disseksjon og montering av øyen (TRITC: eksitasjon: 532-554 nm, utslipp: 570-613 nm; eller Texas-rød: eksitasjon: 540-580 nm, utslipp: 592-667 nm).
- For imaging kalsium tilstrømningen i beta-cellene, bruk en invertert AC confocal mikroskop (Zeiss LSM 780 eller lignende) med 20 X (0,8 NA) luft mål og utstyrt med en plate holder 35 mm diameter glass bunn rettene.
- Forberede en 200 mg/L løsning av tricaine metan sulfonate (MS222) euthanizing sebrafisk.
- Anskaffe 90 mm Petri retter for sebrafisk dissection.
2. sebrafisk primære Holme disseksjon og montering
- Euthanize en fisk med langvarig inkubasjon i MS222. For dette, forsiktig fjerne fisken fra fisken tank med et fiskegarn og Inkuber det i en Petriskål som inneholder den MS222 løsningen til dyret viser ingen opercular (gjellene) bevegelse; vanligvis dette tar 5 min. overføring fisken til en Petriskål som inneholder den HBSS løsningen med Ca2 +/Mg2 +.
-
Under en stereo mikroskop fluorescens lampe og røde filteret kuben, dissekere huden dekke høyre side av magen på dyret å isolere bukspyttkjertelen.
- Kutt huden på sebrafisk fra munn til Gattfinnen med skarpe tang for dette. Skrelle bort kutt huden til å utsette magen; Denne snipping viser de indre organene. Ved hjelp av den røde fluorescensen mKO2 uttrykk i beta-cellene, fastslå plasseringen av øyene av visuell undersøkelse under mikroskopet. Eventuelt fjerne lobes av leveren, som de kunne dekke Holme, gjør det vanskelig å finne.
Merk: Den primære Holmen ligger nær den fremre delen av magen, vanligvis på høyre side.
- Kutt huden på sebrafisk fra munn til Gattfinnen med skarpe tang for dette. Skrelle bort kutt huden til å utsette magen; Denne snipping viser de indre organene. Ved hjelp av den røde fluorescensen mKO2 uttrykk i beta-cellene, fastslå plasseringen av øyene av visuell undersøkelse under mikroskopet. Eventuelt fjerne lobes av leveren, som de kunne dekke Holme, gjør det vanskelig å finne.
- Rengjør den primære Holmen ved nøye fjerne omkringliggende vev som leveren og adipocytter. Ta forholdsregler for ikke å skade eller rote Holmen; etter clearing av de omkringliggende vev, blir de enkelte cellene på Holme overflaten synlig.
- Pipetter en 30 µL dråpe HBSS på midten av et glass-bottom rett. Overføre dissekert Holmen til dette slipp.
- Nøye vask Holmen én gang med HBSS og med 30 µL fibrinogen arbeider løsningen (3,3 mg/mL). Sørg for å unngå tørking av øyen under vask trinnene fordi gjøres fører til celledød.
- Sakte og forsiktig legge 10 µL av trombin løsningen (10 U/mL). La Holmen og parabolen urørt i 15-20 min. observere at fibrinogen-trombin drop blir flytende og litt ugjennomsiktig på dette punktet.
3. Ex Vivo Live bildebehandling GCaMP fluorescens intensitet i sebrafisk primære holmer
- Legg til 200 µL av HBSS på toppen av mold og plasser rett nøye på plate innehaver av AC confocal mikroskop. Bruk en 20 X 0,8 NA, air målsetting for AC confocal bildebehandling. Finn Holmen bruke alternativet brightfield.
- Bruker filteret for rød fluorescens å se den kjernefysiske mKO2 fluorescensen i beta-cellene, fokus på Holmen. Individuelle kjerner bør være synlig.
- Finn et klart tenkelig fly ved å manuelt endre fokalplanet av AC confocal mikroskop for å flytte gjennom tykkelsen på Holmen langs z-aksen. Kontroller at tenkelig flyet inneholder et tilstrekkelig antall (50-100) av beta-cellene for bildebehandling og lysstyrken på kjernefysiske mKO2 fluorescens er uniform, særlig i midten av Holme.
- Definere en sekvensiell oppkjøpet til GCaMP6s og mKO2 fluorescens bruker følgende innstillinger i "Smart oppsettmenyen": GCaMP6s, eksitasjon: 488 nm, utslipp: 500-555 nm, falske farger: grønn (Velg "GFP"); mKO2, eksitasjon: 561 nm (mCherry), utslipp: 570-630 nm, falske farger: rød (Velg "mCherry").
Merk: Denne innstillingen, den røde kanalen vil registrere plasseringen av beta-celle kjerner, mens den grønne kanalen registrerer GCaMP fluorescens intensiteten. - I "Oppkjøpet modus" Angi bildeoppløsningen 1024 x 1024 piksler, hastighet på 10 og snitt på 1. Initiere a kontinuerlig opptak ved å velge alternativet for "Tid-serien" og angi "Tid" for 500 sykluser, med ca 2 s oppkjøpet tid per bilde.
Merk: Første 50 rammene av tiden-serien tilsvarer aktiviteten til beta-cellene på 5 mM glukose konsentrasjon. Dette er svaret som planlagt. En svarer beta-celle vises voksing og avtagende i grønne fluorescens intensiteten med tid. Vi har observert at noen (1-5%) av beta-cellene svinge på 5 mM glukose. -
Hold øye med imaging syklusen. Etter først øke 50 rammer, glukose konsentrasjonen av 10 mM rundt løsningen uten å stoppe innspillingen.
- Uten perturbing bilde oppkjøpet, Pipetter forsiktig 5 µL av 200 mM D-glukose løsning på gel holder Holmen. Tilegne seg 150 rammer på 10 mM glukose.
Merk: Økningen i glukose konsentrasjonen vil øke antall beta-cellene gjennomgår GCaMP fluorescerende svingninger i den grønne kanalen. - Sikre at kjerner i cellene forblir stabil under prosessen. Hvis Holmen rister mye under oppkjøpet og kjerner er flytting av fokalplanet, forkaste prøven (hvis nødvendig).
- Vent en tilstrekkelig lang tid å aktivere av fibrinogen-trombin mold for å sikre stabilitet i etterfølgende prøvene.
- Uten perturbing bilde oppkjøpet, Pipetter forsiktig 5 µL av 200 mM D-glukose løsning på gel holder Holmen. Tilegne seg 150 rammer på 10 mM glukose.
- Ved 200 bilder, øke konsentrasjonen av løsningen på 20 mM ved forsiktig pipettering 10 µL av 200 mM D-glukose løsning. Tilegne seg 150 rammer for 20 mM konsentrasjonen.
- Etter 350 rammer, depolarize Holmen bruker 30 mM KCl. For dette, legger du til 20 µL av 300 mM KCl lagerløsning. På dette stadiet, observere at GCaMP6s fluorescens svingninger stopper og fikse med høy intensitet; Beta-cellene som ikke svarte på glukose kan også vise en økning i grønn-fluorescens intensitet på KCL tillegg.
4. kvantifisering av GCaMP fluorescens spor for Beta-enkeltceller
Merk: For å spore og kvantifisere svar på beta-enkeltceller varierende nivåer av glukose, kvantifisere GCaMP fluorescens intensiteten for hele tenkelig. Kvantifisering utføres på mobilnettet oppløsning. Til dette bruker du FIJI20 trekke ut intensitetsverdiene for GCaMP fluorescens fra bilder (trinn 4.1-4.6), og regneark eller R21 utføre analyse (trinn 4.8-4,9).
- Åpne bildefilen i FIJI bruker "LSM verktøykasse". For dette, velg "Plugin | LSM verktøykassen | Vis LSM verktøykasse". I "LSM verktøykassen" Klikk "Åpne LSM" og velge bildefilen.
Merk: For formater støttes ikke av den "LSM verktøykasse", konvertere dem først tiff for analyse. - Ekstra svarene på celler ved hjelp av verktøyet regionen steder (ROI) i FIJI. Åpne "Avkastningen Manager" i "Analysere" menyen under "Verktøy". Manuelt trekke Avkastningen ved hjelp av "polygon markeringsverktøyet" i verktøylinjen.
- Tegne Avkastningen i den røde kanalen som beta-celle kjerner er synlige. Velg Avkastningen slik at den dekker et område som er større enn en celle kjerne for å inkludere noen av cellens cytoplasma. Kontroller at Avkastningen er samsvar mellom rammer og Juster posisjon om nødvendig.
- Legge til de valgte ROIs "Avkastningen manager" ved å klikke på knappen "Add [t]". Velg og legge til flere ROIs Avkastningen for å skaffe data på flere celler.
- Deretter menyen "Analysere", velg "Satt mål". Velg "Integrert tetthet" for å angi utvinning av totale fluorescens intensiteten i området.
- Skifte til den grønne kanalen som inneholder GCaMP fluorescens og velg "Multi tiltak" i "Avkastningen Manager".
Merk: Dette vil gi intensitet målene for cellene i hele tiden-serien. - I tilfelle ROI plasseringen må justeres på grunn av bevegelse av øyen, manuelt kompilere intensitet målene på forskjellige rammer. Kopier og lim verdiene i et separat regneark.
- Få tidsstempler av delbildene fra "LSM verktøykasse". Bruk "bruke frimerker | Bruke t frimerker | Navnet | Dump til tekstfil"for å få tidsstempler. Lagre tidsstempler alternativet "Lagre som", eller kopiere dem til regnearket.
- På kompilering intensitetsverdiene for alle celler, kan du utføre den analyse én cellen om gangen eller automatisk (f.eksbruker Excel-formler eller R).
-
Analysere individuelle celler i to trinn.
- I det første trinnet, beregne fluorescens intensiteten over grunnlinjen. Dette beregne baseline fluorescerende intensiteten (F0) som et gjennomsnitt av fluorescens intensiteter for de første 50 rammene (5 mM glukose). Deretter trekke grunnlinjen (F0) fra hele tiden-serien (F-F0).
Merk: noen celler kan vise klart GCaMP svingninger under basale glukose, som vanligvis fortsette etter stimulering med høyere konsentrasjoner. For slike celler er det bare mulig å anslå F0 ved å bety intensiteten av de første rammene der cellene viste en nedgang i fluorescens. - I det andre trinnet av analyse, hente siste GCaMP fluorescens intensiteten ved normalisering fluorescens intensiteten.
Merk: Dette utføres for å fjerne forskjellene mellom holmer fra forskjellige dyr. Individuelle holmer vise varierende grad av fluorescens utslipp på glukose stimulering. - Normalisere fluorescens intensiteten deles med høyeste intensitetsverdien. For dette, beregne peak intensiteten (FMaks -F0) og dividere planlagte trukket verdiene av topp intensitet til siste GCaMP fluorescens intensiteten (F-F0) / (FMaks -F0).
- I det første trinnet, beregne fluorescens intensiteten over grunnlinjen. Dette beregne baseline fluorescerende intensiteten (F0) som et gjennomsnitt av fluorescens intensiteter for de første 50 rammene (5 mM glukose). Deretter trekke grunnlinjen (F0) fra hele tiden-serien (F-F0).
- Kast cellene som ikke forårsaker en endring i intensiteten etter KCl stimulering, som de er ugyldig eller skadet.
- Utfører analyse (trinn 4.9-4.10) i R, bruke skriptet R (plotcelltrace. R) gitt dette manuskriptet.
Representative Results
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet ovenfor, ble glukose svarene av beta-cellene i en Holme fra en 45 dager etter befruktning (dpf) sebrafisk analysert. For dette, var den primære Holmen dissekert fra en euthanized dyr og montert i fibrinogen-trombin mold i et glass-bottom rett. Øyen var oppslukt i HBSS som inneholder 5 mM glukose. Glukose konsentrasjonen økt på en step-wise måte å 10 mM og 20 mM. Svar av beta-cellene i økende glukose konsentrasjoner ble registrert. Til slutt, beta-cellene var depolarized med 30 mM KCl (figur 1). Depolarization bruker KCl induserer kalsium oppføring i sunn beta-cellene.
Bruke FIJI og en dataanalyse programvare, GCaMP6s fluorescens intensiteten av enkelte beta-cellene er utdraget og normalisert (figur 2). Sett fra spor av fluorescens intensitet, vise beta-enkeltceller svingninger i GCaMP6s fluorescens på glukose stimulering, som stopper ved KCl stimulering. Teknikken gir en mobil løsning beta-cellens glukose-respons og et vindu i funksjonaliteten.
Figur 1: Ex vivo live bildebehandling av kalsium tilstrømningen bruker GCaMP6s i sebrafisk beta-cellene. En primær Holme fra Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) sebrafisk (45 dpf) ble montert i fibrinogen-trombin mold og inkubert med 5 mM (basale) glukose. Beta-cellene var merket med en rød kjernefysiske markør, mens GCaMP6s fluorescens finnes i den grønne kanalen. Øyen ble stimulert med en glukose-rampe bestående av sekvensiell inkubasjon med 10 mM og 20 mM D-glukose og depolarized via tillegg av 30 mM KCl. pilspisser merke enkelte beta-cellene der aktiviteten ble analysert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: normalisert GCaMP6s fluorescens intensitet-spor for beta-enkeltceller. Normaliserte GCaMP6s fluorescens intensitet-spor for beta-cellene merket med pilspisser i figur 1. X-aksen angir tiden i sekunder. Øverst skildrer barer konsentrasjonen av glukose og KCl i HBSS medium. Y-aksen angir normalisert fluorescens intensiteten i løpet av tiden-serien. For dette beregnes planlagte intensitet (F0) som betyr intensiteten under inkubasjonen i 5 mM glukose. Dette trekkes fra hele tiden-serien data (F - F0). Intensitet over grunnlinjen er normalisert av den maksimale intensiteten vises av cellen (F - F0) / (FMaks- F0). Normalisert sporingen viser en oscillasjon respons av beta-cellene til glukose, som stabiliserer når cellene er depolarized med 30 mM KCl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her viser vi en teknikk for kvantifisering av beta-celle glukose respons på encellede oppløsning. Dette er gjort mulig ved å overvåke intracellulær kalsium konsentrasjon med en genetisk kodet kalsium indikator, GCaMP6s. Beta-celle aktiviteten er fanget ex vivo montering Holme i en fibrinogen-trombin mold. En kritisk trinn av protokollen er stabilitet av mold. Tilstrekkelig tid må gis for fibrinogen å oppløse i HBSS løsningen. Uten dette, mold ikke danner tilstrekkelig for å gi stabilitet under imaging-økten. En Holme montert i fibrinogen-trombin mold og midt i celle kultur medier kan være levedyktig i minst en uke (data ikke vist). Alternativer til fibrinogen-trombin mold, som lav-smelte agarose, kan benyttes for å montere det Holme22. En annen viktig parameter er Disseksjon av øyen. I dette trinnet må i vevet rundt Holmen fjernes uten skade eller poking Holmen. En dyktig disseksjon kommer med praksis.
En begrensning av tenkelig protokollen er begrensning til en AC confocal plan Holmen. Dette gjøres for å fange dynamikken i kalsium tilstrømningen i beta-enkeltceller. En Z-stabel gjennom hele tykkelsen på Holmen fører til lav tenkelig hastigheter og tap av oscillasjon signal fra enkeltceller. Denne begrensningen kan forbedres ved hjelp av raskere hjelp av AC confocal-imaging som spinner disken mikroskopi, aktivere fange kalsium dynamikken i 3-dimensjoner. En grense ville være i vivo kalsium tenkelig12. Gjennomsiktig natur sebrafisk embryo eller bruk av pigment-mindre stammer av sebrafisk voksne23 kunne åpne muligheten for i vivo imaging i fremtiden.
Avbilding av beta-celle aktivitet på romlige og tidsmessige høyoppløselig kan undersøke den funksjonelle heterogeniteten blant enkelte beta-cellene. Denne tilnærmingen kan bidra til å belyse eksistensen av beta-celle undergrupper. Nylig har flere studier vist eksistensen av subpopulasjoner nominelt homogen beta-cellene24,25,26. Ex vivo bildebehandling kan kombineres med genetisk journalister å karakterisere sub-befolkningen respons til glukose. I tillegg kan kombinerer tenkelig oppsettet med farmakologiske stimulering gi screening av stoffer som kan forbedre beta-celle funksjonen.
Oppsummert kan teknikken presenteres her kvantifisering og sammenligning av glukose responsen for beta-enkeltceller. Det gir et direkte vindu i beta-celle funksjonen, en viktig parameter i utviklingen av diabetes.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Ninov laboratorium for kommentarer på manuskriptet, medlemmer av Center for regenerativ terapier Dresden (CRTD) fisk og mikroskopi anlegg for teknisk assistanse. N.N. støttes av finansiering fra DFG-CRTD, Cluster of Excellence ved TU Dresden, tysk Research Foundation (DFG) og tysk Center for Diabetes forskning (DZD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) | By request from authors | ||
| Stereo microscope | ZEISS | 495015-0001-000 | SteREO Discovery.V8 |
| Fluorescence lamp | ZEISS | 423013-9010-000 | Illuminator HXP 120 V |
| Red Filter Cube | ZEISS | 000000-1114-462 | Filter set 45 HQ TexasRed |
| Confocal Microscope | ZEISS | LSM 780 | |
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630 | |
| HBSS (Hanks' Balanced Salt solution) | ThermoFisher | 14025092 | |
| Thrombin | Sigma | T4648 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| 35 mm diameter glass-bottom dishes | ThermoFisher | 150680 | |
| tricaine methane sulfonate | Sigma | E10521 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11445-12 | |
| FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e | https://fiji.sc/ | ||
| R, version 3.2.4 | https://www.r-project.org/ | ||
| RStudio | https://www.rstudio.com/ | ||
| plotcelltrace.R | A custom script provided with the manuscript |
References
- Kahn, S. E. The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes. Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).
- Ogurtsova, K., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).
- Pipeleers, D. G.
- MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P.
- Hellman, B., et al. Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells. Diabetologia. 37, Suppl 2. S11-S20 (1994).
- Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets. J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).
- Wollheim, C. B., Pozzan, T. Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).
- Pace, C. S., Price, S. Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli. Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).
- Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release. J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).
- Soria, B., Martin, F. Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).
- Kenty, J. H. R., Melton, D. A. Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression. PLoS One. 10 (4), e0122044 (2015).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nat Commun. 8 (1), 664 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676 (2012).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
- Friedman, R. S., et al. An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function. Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nat Commun. 7, 11756 (2016).
- Johnston, N. R., et al. Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose. Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).
