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Behavior

मानव वसा के लिए एक Microphysiologic मंच: सैंडविच सफेद वसा ऊतक

Published: August 15, 2018 doi: 10.3791/57909
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Pharmacology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Surgery, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

व्हाइट वसा ऊतक (वाट) अपनी वर्तमान प्राथमिक संस्कृति मॉडल में महत्वपूर्ण कमी है, औषधीय विकास और चयापचय अध्ययन में बाधा । यहां, हम stromal कोशिकाओं की चादरें के बीच वाट सैंडविच द्वारा एक वसा microphysiological प्रणाली का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह निर्माण प्राथमिक वाट संस्कृति के लिए एक स्थिर और अनुकूलनीय मंच प्रदान करता है ।

Abstract

सफेद वसा ऊतक (वाट) वजन और हर रोज स्वास्थ्य को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । फिर भी, वहां उपलब्ध प्राथमिक संस्कृति मॉडल, जिनमें से सभी को ईमानदारी से वसा microenvironment दोहराऊंगा या दो सप्ताह से परे वाट व्यवहार्यता का विस्तार करने में विफल रहे है महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । एक विश्वसनीय प्राथमिक संस्कृति मॉडल की कमी गंभीर वाट चयापचय और दवा के विकास में अनुसंधान में बाधा उत्पंन । यह अंत करने के लिए हम एक microphysiologic प्रणाली के NIH मानकों का उपयोग किया है वाट प्राथमिक संस्कृति के लिए एक उपंयास मंच ' नामक ' स्वात (सैंडविच सफेद वसा ऊतक) का विकास । हम वसा की चादरें-व्युत्पंन stromal कोशिकाओं के बीच कीमा बनाया हुआ वाट समूहों सैंडविच द्वारा adipocytes के प्राकृतिक उछाल पर काबू पाने । इस निर्माण में, वाट नमूने संस्कृति में आठ सप्ताह से अधिक व्यवहार्य हैं । स्वात बरकरार ECM, सेल संपर्क करने के लिए सेल संपर्कों, और vivo वाट की स्थिति में शारीरिक दबाव का कहना है; इसके अतिरिक्त, स्वात एक मजबूत transcriptional प्रोफ़ाइल, exogenous रासायनिक संकेतन, और पूरे ऊतक समारोह के लिए संवेदनशीलता का कहना है । स्वात प्राथमिक वसा संस्कृति का एक सरल, reproducible, और प्रभावी विधि का प्रतिनिधित्व करता है । संभावित, यह वाट फिजियोलॉजी, pathophysiology, चयापचय, और दवा के विकास में अनुसंधान के लिए एक मोटे तौर पर लागू मंच है ।

Introduction

वसा ऊतक मोटापे का प्राथमिक अंग है, जो अमेरिका में1$१४७,०००,०००,००० और $२१०,०००,०००,००० के बीच प्रत्यक्ष वार्षिक चिकित्सा लागत वहन करती है । वसा ऊतक के संचय भी हृदय रोग, प्रकार द्वितीय मधुमेह, और2कैंसर के कुछ प्रकार के रूप में मौत के अन्य प्रमुख कारणों के लिए योगदान देता है । इन विट्रो में संस्कृति मॉडल चयापचय अध्ययन और दवा के विकास के लिए आवश्यक हैं, लेकिन वसा ऊतक के वर्तमान अनुसंधान मॉडल प्रमुख कमियों है । Adipocytes नाजुक, बोया, और टर्मिनल विभेदित कोशिकाओं है कि सेल संस्कृति प्लास्टिक का पालन नहीं होगा, और इसलिए पारंपरिक कोशिका संस्कृति के तरीकों का उपयोग नहीं किया जा सकता है । 1970 के दशक के बाद से, कई तरीकों कांच coverslips, छत संस्कृति, निलंबन संस्कृति के उपयोग सहित इन बाधाओं को दूर करने के प्रयास में इस्तेमाल किया गया है, और extracellular मैट्रिक्स3,4,5, 6 , 7. हालांकि, इन तरीकों सेल मौत और भेदभाव के द्वारा चिह्नित किया गया है, और वे आम तौर पर एक दो सप्ताह के अध्ययन अवधि से अधिक के लिए इस्तेमाल किया जाता है । इसके अलावा, इन मॉडलों का प्रयास नहीं दोहराऊंगा देशी वसा microenvironment के रूप में वे बरकरार ECM बनाए रखने नहीं है, adipocytes और stromal समर्थन कोशिकाओं के बीच बातचीत, और न ही सिकुड़ा बलों कोशिकाओं में एक दूसरे पर लागू vivo में वाट.

एक सोने के अभाव में मानक प्राथमिक वसा संस्कृति विधि, वसा अनुसंधान मुख्यतः विभेदित पूर्व adipocytes (diffAds) पर भरोसा किया है । DiffAds multilocular, अनुयाई, और चयापचयी रूप से सक्रिय हैं । इसके विपरीत, प्राथमिक सफेद adipocytes unilocular, nonadherent, और अपेक्षाकृत कम चयापचय प्रदर्शन कर रहे हैं । वर्तमान वसा संस्कृति मॉडल की विफलता स्वस्थ परिपक्व वसा ऊतक के फिजियोलॉजी दोहराऊंगा करने के लिए संभावना एफडीए के अभाव में एक प्रमुख कारक-दवाओं है कि सीधे लक्ष्य adipocytes को मंजूरी दे दी है । वास्तव में, इन विट्रो अंग मॉडल में शारीरिक की कमी सबसे अधिक अंगों और रोग के पार एक बड़ी समस्या है ।

अपनी स्थिति में अपने Microphysiological सिस्टम (एमपीएस) कार्यक्रम के निर्माण की घोषणा कागज में, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) ने बताया कि सभी मानव दवा नैदानिक परीक्षणों में २०१३ सफलता दर द्वितीय चरण के लिए केवल 18% और चरण III के लिए ५०% थी नैदानिक परीक्षण8. सांसदों के कार्यक्रम के लिए सीधे इन विट्रो monoculture मॉडल मानव फिजियोलॉजी के लिए अक्षमता का पता करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । NIH कोशिकीय 3d में मानव प्राथमिक या स्टेम कोशिकाओं के शामिल संस्कृति प्रणालियों के रूप में MPSs को परिभाषित करता है कि दोहराऊंगा अंग कामकाज का निर्माण । सजातीय, अमर कोशिका संस्कृतियों के गुटबंदी मॉडल के विपरीत, MPSs सही मॉडल सेल सेल, ड्रग सेल, नशीली दवाओं, और अंग दवा बातचीत9चाहिए । अल्पकालिक प्राथमिक संस्कृति के तरीकों के विपरीत, NIH मानकों8संस्कृति में 4 सप्ताह से अधिक सांसदों स्थिरता हुक्म । सांसदों के कार्यक्रम की अधिक जानकारी NIH के RFAs (#RFA-TR-18-001)10में पाया जा सकता है ।

हम एक सरल, उपंयास, अनुकूलनीय, और सस्ती वसा सांसदों "सैंडविच सफेद वसा ऊतक" (स्वात)11का कार्यकाल विकसित किया है । हम adipocytes के प्राकृतिक उछाल से उबरने "सैंडविच" वसा की चादरें-व्युत्पंन stromal कोशिकाओं (ADSCs) (चित्रा 1) के बीच प्राथमिक वसा ऊतक कीमा बनाया हुआ । परिणामस्वरूप 3 डी का निर्माण recapitulates सेल सेल से संपर्क करें और एक प्राकृतिक adipocyte समर्थन सेल जनसंख्या के साथ परिपक्व adipocytes आसपास द्वारा देशी वसा microenvironment । स्वाट 8 सप्ताह व्यवहार्यता, exogenous संकेत करने के लिए प्रतिक्रिया, adipokine स्राव, और एक पशु मॉडल में engraftment का प्रदर्शन करके मान्य किया गया है ।

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Protocol

सभी कार्यों प्रोटोकॉल #8759 और #9189 के पालन में प्रदर्शन किया, के रूप में LSUHSC के आईआरबी कार्यालय द्वारा अनुमोदित-नहीं थे । सभी पशु काम प्रोटोकॉल के पालन में प्रदर्शन किया गया था #3285 IACUC कार्यालय द्वारा अनुमोदित LSUHSC-NO ।

1. सैंडविच सेल शीट्स के सीडिंग

नोट: चित्र 1देखें ।

  1. बीज ADSCs में लगभग ८०% ऊतक संस्कृति प्लेटों में प्रवाह (6 सेमी या 6 अच्छी तरह से प्लेटें) । वांछित स्वात के प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, बीज 1 पारंपरिक ऊतक संस्कृति अच्छी तरह से और 1 पाली पर इसी आकार की अच्छी तरह से (N-isopropylacrylamide (pNIPAAm)-लेपित ऊतक संस्कृति प्लास्टिक की थाली ।
    नोट: तदनुसार, स्वात के एक 6 अच्छी तरह से प्लेट एक 6 अच्छी तरह से मानक ऊतक संस्कृति प्लेट (आधार परत) और एक 6 अच्छी तरह से pNIPAAm-लेपित ऊतक संस्कृति प्लेट (ऊपरी परत) पर कोशिकाओं बोने की आवश्यकता होगी । pNIPAAm-लेपित प्लेटों में वाणिज्यिक खरीदा जा सकता है या में उत्पादित-प्रयोगशाला12,13,14.
  2. ३७ ° c पर ADSCs बनाए रखने और 5 % कं Dulbecco में संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% FBS और 1x पेनिसिलिन/Streptomycin के साथ पूरक। बदलें मीडिया हर 2 दिन ।
  3. जब तक वे १००% धाराप्रवाह बन जाते है और एक धारीदार पैटर्न (लगभग 6-8 दिन) पर ले जाने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें ।
    नोट: इन कोशिकाओं के लिए एक एकल बरकरार सेल शीट के रूप में कार्य करने के लिए बोया वसा ऊतक को स्थिर करने की आवश्यकता होगी । अपर्याप्त धाराप्रवाह कोशिकाओं वाट के साथ बोने पर टुकड़ा होगा ।

2. स्वाट आपूर्ति की तैयारी

  1. 1x हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के कई 10 मिलीलीटर aliquots तैयार; पर्याप्त मात्रा के साथ प्लेटों की वांछित संख्या के लिए अतिरिक्त तैयार करें ।
  2. स्वाट बोने के लिए गोताख़ोर उपकरण तैयार करें । सरल एक्रिलिक प्लास्टिक का उपयोग कर गोताख़ोर का निर्माण, एक गोल डिस्क से जुड़ी स्टेम के शामिल । सुनिश्चित करें कि यह ऊतक संस्कृति कुओं की परिधि के भीतर फिट बैठता है (व्यास: 6 सेमी डिश के लिए < 6 cm, 6-वेल प्लेट के लिए < 3.5 cm; अनुमानित मास: 6 सेमी डिश के लिए ६.७ ग्राम, 6-वेल प्लेट के लिए ५.१ ग्राम) ।
    1. अतिरिक्त plungers तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया सुचारू रूप से चलेंगे मामले में कोई भी व्यक्ति गोताख़ोर के साथ एक समस्या है ।
    2. लपेटें गोताख़ोर डिस्क के रिम के आसपास लैब टेप, कम से 2x, जिलेटिन समाधान के रिसाव को रोकने के लिए ।
    3. स्प्रे एक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) ७०% ेतोः के साथ । खाली, 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के साथ बीएससी के अंदर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब रैक नीचे स्प्रे; ट्यूबों सुरक्षित जिलेटिन plungers की नियुक्ति में मदद मिलेगी ।
    4. प्रत्येक टेप-लपेटा गोताख़ोर अच्छी तरह से ७०% ेतोः के साथ स्प्रे और रैक पर एक 15mL शंकु ट्यूब में जगह है । स्प्रे धातु वाशर (अनुमानित मास ६.३ जी) और उंहें कांटे की शकल का संदंश की एक जोड़ी के साथ रैक पर जगह; वाशर स्वाट बोने के दौरान plungers के लिए वजन बढ़ जाएगा ।
    5. बंद बीएससी शश और यूवी लाइट चालू करने के लिए सुखाने और नसबंदी की सुविधा ।
      नोट: आदर्श रूप में, संचालन इस कदम 24 एच से पहले स्वात बोने की । वैकल्पिक रूप से, ऊतक संग्रह के दिन पर प्रक्रिया का संचालन/ हालांकि, इस मामले में, की अनुमति दें 15 – यूवी सुखाने के लिए 45 मिनट/

3. जिलेटिन Plungers की तैयारी — ऊपरी सेल शीट्स के लिए आवेदन

  1. ७५ डिग्री सेल्सियस के लिए एक पानी स्नान गर्मी ।
  2. ०.७५ जी को जिलेटिन पाउडर के 10 मिलीलीटर से जोड़कर जिलेटिन सॉल्यूशन तैयार करें 1x HBSS का स्टॉक । एक धुएं के हुड के तहत 1 मीटर NaOH के १०० µ एल जोड़ने के लिए समाधान के पीएच संतुलन ।
    1. पानी स्नान के लिए 10 मिलीलीटर स्टॉक जोड़ें और सख्ती से हर 5 मिनट हिला जब तक पाउडर समाधान में घुल । गर्म पानी के नहाने के लिए जोड़ने के बाद जल्द ही पाउडर जिलेटिन को भंग करने के लिए निशाना लगाओ ।
    2. बीएससी ब्लोअर को चालू करें, यूवी लाइट बंद कर दें, और बढ़ा कर शश करें । बीएससी की सतह पर स्प्रे करें और फिल्टर सप्लाई (5 एमएल luer-लॉक सीरिंज और ०.२ µm सिरिंज फिल्टर) तैयार कर लें । plungers के लिए लागू करने के लिए जिलेटिन की पर्याप्त मात्रा को कुशलतापूर्वक तनाव के लिए कई फिल्टर तैयार करें ।
  3. जब जिलेटिन समाधान एक समरूप स्थिरता तक पहुंचता है, समाधान फ़िल्टर और इसे लागू करने के लिए plungers । जिलेटिन के साथ सिरिंज लोड । सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से प्लास्टिक plungers करने के लिए जिलेटिन लागू करें (एक 6 अच्छी प्लेट के लिए ~ २.५ मिलीलीटर, ~ ४.५ एमएल एक 6 cm डिश के लिए) और जमना (~ 20 मिनट) की अनुमति दें ।
  4. एक बार जिलेटिन ठोस है, plungers के किनारे से टेप खोलना । के साथ झुका संदंश, गोताख़ोर के बाहरी छोर से जिलेटिन हटा (यानी, meniscus के उठाया किनारों) । सुनिश्चित करें कि गोताख़ोर के केंद्र में शेष जिलेटिन पूरी तरह से ADSC शीट के साथ संपर्क को अधिकतम करने के लिए स्तर है ।
  5. एक बार अतिरिक्त जिलेटिन हटा दिया जाता है, धीरे pNIPAAm-लेपित ADSC प्लेटों के लिए जिलेटिन plungers लागू होते हैं । गोताख़ोर नीचे वजन करने के लिए धातु वाशर का उपयोग करें । plungers लागू करते समय कतरनी सेल शीट्स न करें ।
  6. कक्ष के तापमान पर १.५ घंटे के लिए सेल शीट पर plungers छोड़ दें । pNIPAAm-लेपित प्लेट सतह से सेल शीट के पृथक्करण को पूरा करने के लिए १.५ ज के लिए एक बर्फ पानी स्नान में plungers/
    1. बर्फ स्नान में मशीनिंग करते समय सावधानी बरतें; बर्फ स्नान की अनुमति के लिए सेल मीडिया की मशीन के दौरान दूषित मत करो ।
    2. मशीन को पूरा करने के बाद, pNIPAAm-लेपित प्लेटों के नीचे साफ करने के लिए गैर बाँझ पानी हटा दें ।

4. व्हाइट वसा ऊतक प्रसंस्करण

  1. जब ऑपरेटिंग कमरे से मानव वसा ऊतक का संग्रह, एक बाँझ कंटेनर कि जब तक स्वात है बर्फ पर है में सभी नमूनों को रखने के लिए है । ऊतक स्थिरता के लिए वसा ऊतक कंटेनर के लिए, फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के रूप में बाँझ रखरखाव मीडिया, जोड़ें.
  2. कोल्ड सेल कल्चर को जोड़ने के लिए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से/डिश के लिए (१०० µ एल एक 6 अच्छी थाली के लिए, एक 6 सेमी डिश के लिए २०० µ एल) ।
  3. वसा ऊतक कीमा ।
    1. ठोस वसा ऊतक खंडों के लिए, निंनानुसार है ।
      1. बाँझ पंजाबियों में वसा ऊतक 3x के बड़े क्षेत्रों को धोने और संभव के रूप में ज्यादा पंजाब के रूप में हटा दें ।
      2. मोटे तौर पर संदंश और बाँझ रेजर के साथ ऊतक कीमा और जितना संभव हो उतना vasculature और प्रावरणी (अधिक विस्तार के लिए चर्चा देखें) निकालें ।
      3. पतले उस्तरा के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक मोटी, तरल स्थिरता पर ले जाता है जब तक ।
        नोट: आदर्श ऊतक वाट के कोई दिखाई व्यक्तिगत क्षेत्रों के साथ समरूप दिखाई देगा, हालांकि यह हमेशा संभव नहीं है ।
    2. प्रक्रिया lipoaspirate निम्नानुसार ।
      1. बीएससी के तहत, एक चोंच के शीर्ष पर टेप बाँझ धुंध, और किसी भी अतिरिक्त तरल इकट्ठा करने के लिए एक बड़ा चोंच में इस चोंच जगह है ।
      2. एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, के रूप में ज्यादा lipoaspirate की जरूरत के रूप में आकर्षित और बाँझ धुंध की सतह पर लागू होते हैं । lipoaspirated वसा को धोने और अतिरिक्त रक्त और लिपिड अवशेषों को हटाने के लिए इस सतह के लिए सीधे पंजाबियों लागू करें ।
      3. सूखा ऊतक ठीक करने के लिए संदंश का प्रयोग करें, यह एक बाँझ नख़रेबाज़ सतह के लिए स्थानांतरण, और lipoaspirate भरती.
  4. भरती ऊतक हस्तांतरण करने के लिए p1000 पिपेट सुझावों के बाहर के अंत में कटौती करने के लिए एक बाँझ रेजर का प्रयोग करें; यह कतरनी तनाव है कि adipocyte lysis के लिए नेतृत्व कर सकते है कम हो जाएगी । एक बार एक उचित ऊतक स्थिरता कीमा बनाया हुआ ऊतक के वांछित मात्रा प्रत्येक १.५ मिलीलीटर ट्यूब (300 – 6 के लिए 400 µ l-अच्छी तरह से थाली, 500 – 600 µ एल के लिए 6 cm डिश के लिए) हस्तांतरण तक पहुँच गया है । मिश्रण कीमा बनाया हुआ वाट और मीडिया संक्षेप ट्यूबों में ।
  5. आधार ADSC प्लेट्स ले लो और मीडिया महाप्राण/ प्रत्येक १.५ मिलीलीटर ट्यूब से वाट/मीडिया मिश्रण के साथ मीडिया बदलें ।
    1. धीरे pNIPAAm-लेपित प्लेटों से जिलेटिन plungers हटाने और उंहें आधार ADSC प्लेटों पर वाट मिश्रण करने के लिए लागू होते हैं । एक खुर्दबीन के नीचे pNIPAAm लेपित प्लेटों की monolayer की जांच करने के लिए सेलुलर टुकड़ी की पुष्टि करें ।
  6. बीएससी के तहत लगभग 37-40 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्मी ब्लॉक सेट करें । plungers के साथ अभी भी जगह में, गर्मी है ब्लॉक सतह के लिए प्लेटें ले जाएं । 2 जोड़ें-गर्म संस्कृति मीडिया के 3 मिलीलीटर कोशिकाओं को गर्मी और जिलेटिन पिघलने की सुविधा के लिए ।
  7. ~ 30 मिनट के बाद, धीरे प्लेट सतह से plungers निकालें । आधार ऊतक संस्कृति प्लेटों के ढक्कन की जगह और एक सेल संस्कृति मशीन के लिए कदम । एक बार जिलेटिन ३७ डिग्री सेल्सियस, महाप्राण पर पूरी तरह से तरलीकृत है और सेल संस्कृति मीडिया की जगह ।
  8. ३७ ° c पर स्वात बनाए रखने और 5 % सह phenol लाल मुक्त M199 मध्यम में 7 µ एम इंसुलिन के साथ, 30 µ m डेक्समेतएसॉनी, 1x पेनिसिलिन/Streptomycin । 6 के लिए लगभग 2 मिलीलीटर मीडिया में बनाए रखें-अच्छी तरह से प्लेटें और 6 सेमी व्यंजन के लिए 3 मिलीलीटर । बदलें मीडिया हर 2 दिन ।

5. स्वाती हार्वेस्ट

  1. तैयार collagenase (०.५ मिलीग्राम/एमएल collagenase, ५०० एनएम adenosine, पंजाब में) aliquots 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में (अनुमानित मात्रा 10 मिलीलीटर) । ट्यूब फ्रीज और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  2. कोशिकाओं से किसी भी संस्कृति माध्यम महाप्राण, पंजाबियों के साथ धो 1x, और फिर महाप्राण पंजाबियों । एक ३७ ° c पानी स्नान में उन्हें गल द्वारा collagenase aliquots तैयारी.
    नोट: आदर्श रूप से, collagenase समाधान ३७ ° c तक पहुंच जाएगा; इसके तुरंत बाद, ऊतक जोड़ें ।
  3. सभी ऊतक स्वाट प्लेट से व्यक्तिगत aliquots के लिए जोड़ें । हार्वेस्ट एक बाँझ सेल स्क्रेपर का उपयोग कर स्वाट और यह collagenase aliquots करने के लिए एक कट के साथ हस्तांतरण p1000 पिपेट टिप. collagenase समाधान युक्त 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों के लिए सीधे ऊतक जोड़ें ।
    1. वैकल्पिक रूप से, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ऊतक/collagenase मिश्रण मशीन; बढ़ी हुई सतह क्षेत्र आगे एंजाइमी पाचन की सुविधा होगी ।
  4. एक ४५ ° कोण पर एक मशीन कक्षीय शेखर में नमूना ट्यूबों प्लेस । २०० rpm पर मशीन, 30 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर-60 मिनट ।
  5. संग्रह के लिए एक नया 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक २५० µm मेष फिल्टर रखें । फिल्टर के माध्यम से पचा adipocyte समाधान डालो ।
    नोट: यह सभी कोशिकाओं जबकि रेशेदार ऊतक बाहर फ़िल्टरिंग के माध्यम से पारित करने की अनुमति देगा ।
  6. की अनुमति दें प्रवाह के माध्यम से कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए बैठने के लिए चरण जुदाई के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: adipocytes वसा stromal कोशिकाओं (ASCs) निचले चरणों में बसा होगा, जबकि समाधान के शीर्ष करने के लिए नाव होगा । ५०० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक भी सेल जुदाई या गोली में ADSCs आसपास की फसल को अधिकतम कर सकते हैं ।
  7. एक कट-ऑफ p1000 पिपेट टिप का प्रयोग, adipocytes (collagenase समाधान के शीर्ष पर चल परत) एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge संग्रह ट्यूब हस्तांतरण । एक समय में ~ २५० µ एल लेना, पिपेट धीरे ट्यूब के किनारे के साथ adipocytes इकट्ठा करने के लिए ।
    1. अंदर का पालन कोशिकाओं की वसूली को अधिकतम करने के लिए adipocytes इकट्ठा करते समय ट्यूब धीरे घुमाएँ. १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब भरा हुआ है जब तक अधिक कोशिकाओं ड्राइंग रखें ।
  8. एक सुई से जुड़ी एक सिरिंज का उपयोग अलग adipocytes से अतिरिक्त तरल निकालें (~ 21 जी). अस्थायी adipocyte परत के नीचे सुई जलमग्न. किसी भी सुई शाफ्ट का पालन कोशिकाओं को उखाड़ फेंक करने के लिए सुई संक्षेप में आंदोलन, और फिर शीर्ष करने के लिए नाव के लिए उखाड़ फेंका adipocytes के लिए प्रतीक्षा करें ।
  9. धीरे से अतिरिक्त तरल ड्रा, adipocytes के अवांछित हटाने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा. का प्रयोग करें microcentrifuge ट्यूब स्नातकों लगातार नमूना मात्रा अलग करने के लिए (उदा., । प्रत्येक नमूने के लिए ०.१ मिलीलीटर) ।
  10. डीएनए/आरएनए निष्कर्षण, ग्लूकोज के लिए अलग कोशिकाओं का उपयोग परख, lipolysis परख, आदि

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Representative Results

स्वात की व्यवहार्यता शुरू में व्यक्तिगत वाट क्लस्टर के सीरियल brightfield इमेजिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था (n = 12) लगभग ७.६ सप्ताह से अधिक है । क्लस्टर इस समय भर में monolayer पर जगह में सुरक्षित रहे । मामूली रूपात्मक परिवर्तन व्यक्तिगत adipocytes थोड़ा या स्थानांतरण पदों ताना के साथ मनाया गया । हालांकि, adipocytes न तो समय के साथ multilocular हो, भेदभाव की कमी का संकेत है, और न ही वे सेलुलर blebbing, lysis, या विखंडन के रूप में कोशिका मृत्यु के किसी भी दिखाई लक्षण प्रदर्शन किया (2 चित्रा) । क्लस्टर के Adipocyte पहचान दो सप्ताह पुरानी स्वाट पर लिपिड दाग नील लाल (NR) के साथ पुष्टि की गई थी । unilocular adipocyte समूहों की स्पष्ट NR धुंधला संकेत दिया कि ये वास्तव में बरकरार झिल्ली के साथ adipocytes थे, बजाय विरूपण साक्ष्य, अल्सर, या मृत adipocytes. आसपास के ADSC शीट्स में NR धुंधला का अभाव इंगित करता है कि इन कोशिकाओं को लिपिड जमते नहीं कर रहे है और इसलिए एक adipogenic वंश (3 ए आंकड़ा) की ओर अंतर नहीं है । Propidium आयोडाइड धुंधला ५३ दिन पुरानी स्वात पर प्रदर्शन किया गया । उंनत timepoints में adipocyte क्लस्टर के भीतर दाग का अपवर्जन कोशिका मृत्यु (चित्र बी) की कमी को दर्शाता है । तेल लाल-ओ (ओरो) दाग ५१ दिन पर प्रदर्शन किया गया था लिपिड दाग के साथ पुरानी स्वात तय adipocyte समूहों के भीतर स्थानीयकरण, यह दर्शाता है कि स्वात adipocytes बरकरार adipocytes के साथ व्यवहार्यता बनाए रखने के भी उंनत timepoints (आंकड़ा 3सी) ।

Immunocytochemistry (आईसीसी) की उंमीद प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्वात के भीतर परिपक्व adipocyte मार्करों के स्थानीयकरण प्रदर्शन किया गया । बरकरार स्वात प्लेटों perilipin (ab3526, 1:200 कमजोर पड़ने), PPARγ2 (अनुसूचित जाति-१६६७३१, 1:100 कमजोर पड़ने), और FABP4 (ab92501, 1:1000 कमजोर पड़ने) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग थे । 12 दिन पुरानी स्वात की फोकल छवियां लिपिड छोटी बूंद सतह (चित्रा 4a) के आसपास perilipin के स्थानीयकरण की उंमीद का प्रदर्शन किया । लिपिड काउंटर दाग BODIPY के साथ 3 दिवसीय स्वाट के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कोशिका द्रव्य (चित्रा 4b) के भीतर FABP4 स्थानीयकरण का प्रदर्शन किया, और PPARG और DAPI धुंधला से अतिव्यापी संकेत नाभिक को PPARG स्थानीयकरण प्रदर्शन ( चित्र 4c) ।

स्वात transcriptional प्रोफ़ाइल ऊतक में मूल्यांकन किया गया था कई विषयों से वरीयता प्राप्त (n = 4 दाताओं) । संग्रह पर, वसा ऊतक के एक हिस्से एक आधारभूत आरएनए निष्कर्षण (d0) के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि बाकी स्वाट प्लेटों बीज के लिए इस्तेमाल किया गया था । ये प्लेटें तो 24 ज, 14 दिन और स्वात संस्कृति में 28 दिनों में काटा गया । एक कदम मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (RT-qPCR) प्रतिलेखन स्तर निर्धारित करने के लिए किया गया था । छह प्रमुख adipocyte जीन की जांच की गई: PPARG, FABP4, LPL, CEBPA, HSL, और ADIPOQ (चित्रा 5) । ACTB का उपयोग आंतरिक नियंत्रण के रूप में किया गया था और transcriptional स्तर विषय-मिलान आधारभूत (d0) व्यंजक के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किए गए थे. सभी जीन स्वाट में मजबूत प्रतिलेखन का प्रदर्शन किया, हालांकि स्तर समय के साथ नीचे की प्रवृत्ति थी । हमें विश्वास है कि मनाया transcriptional प्रोफाइल आगे मीडिया अनुकूलन के साथ सुधार किया जा सकता है के रूप में हम चर्चा अनुभाग में विस्तृत ।

बेसल स्रावी समारोह transcriptional प्रोफ़ाइल के लिए इस्तेमाल किया एक ही संस्कृतियों पर मूल्यांकन किया गया था । Supernatant स्वात प्लेटों से एकत्र किया गया था और लेप्टिन स्तर एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) (ab100581) का उपयोग मापा गया । स्वात प्रदर्शित बेसल लेप्टिन स्राव दिन में 1, 14, और 28 (चित्रा 6a) । ADSC शीट एक नियंत्रण के रूप में स्वात प्लेटों के साथ समानांतर में बनाए रखा गया (यानी, सैंडविच वाट के बिना ADSC शीट) । इन नियंत्रणों में गुप्त लेप्टिन का पता नहीं लगाया जा सका (डेटा नहीं दिखाया गया) ।

निर्धारित करने के लिए कि क्या स्वाट समय के साथ एक inducible प्रतिक्रिया के लिए क्षमता बनाए रख सकता है, lipolysis (n = 4) की जांच की थी । inducible lipolytic क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हौसले से एकत्र वाट (d0) के एक हिस्से को भरती किया गया था और adipocytes ( प्रोटोकॉल खंड 5में स्वात फसल के समान) अलग-थलग enzymatically थे, जबकि बाकी स्वाट प्लेटों को बीज के लिए इस्तेमाल किया गया था । पृथक adipocytes के लिए 3 ज ३७ ° c में ३०० µ एल में 2% फैटी एसिड मुक्त HBSS में एल्ब्युमिन के साथ या तो १०० µ एम forskolin, 1 µ एम एड्रेनालाईन, या नियंत्रण बफर के साथ गोजातीय सीरम कर रहे थे । एकत्र मीडिया में ग्लिसरॉल स्तर नि: शुल्क ग्लिसरॉल एजेंट के साथ मापा गया था । स्वात तो 1 और 5 दिनों में काटा गया था और lipolytic क्षमता एक ही तरीके से मूल्यांकन किया गया । रासायनिक उत्तेजना बढी ग्लिसरॉल विज्ञप्ति काफी सभी तीन timepoints (फिगर घमण्ड) पर: इलाज adipocytes के ग्लिसरॉल रिलीज d0 वाट में ८२ ± ४६% (पी = ०.०१), 1-दिन स्वात द्वारा ५७७ ± ३८७% (पी = ०.०२), और पांच दिन स्वात द्वारा ३४८ ± ३४३% (पी = द्वारा वृद्धि हुई थी ०.०३). मतलब उत्तेजित adipocytes में ग्लिसरॉल स्तर सभी तीन timepoints भर में बहुत समान थे: प्राथमिक वाट ५.२ ± ०.८, 1 दिन स्वात ४.४ ± १.९ और 5 दिन स्वात ४.८ ± १.८ µ g ग्लिसरॉल/मिलीग्राम कुल प्रोटीन । नियंत्रण में ग्लिसरॉल स्तर मतलब (यानी, बेसल lipolysis) ताजा एकत्र वाट में अपेक्षाकृत अधिक थे (d0) के रूप में स्वाट-काटा कोशिकाओं की तुलना में । यह शल्य चिकित्सा उत्पाद, प्रयोगशाला के लिए परिवहन के दौरान d0 में वाट ऊतक को बढ़ा तनाव के कारण हो सकता है, और नख़रेबाज़ । हालांकि, इन प्रयोगों या तो 1 या 5 दिनों में स्वाट में lipolytic क्षमता में कोई कम के रूप में हौसले से एकत्र वाट की तुलना में प्रदर्शित करता है ।

स्वाट एक माउस मॉडल (n = 4) में प्रत्यारोपण और वसूली में सक्षम होने के लिए प्रदर्शन किया गया था जटिल, पूरे ऊतक समारोह के एक प्रदर्शन के रूप में । यह भी मंच के एक संभव आवेदन एक शोधकर्ता को एक पशु मॉडल में ऊतक प्रत्यारोपण से पहले इन विट्रो में वाट में हेरफेर करने के लिए स्वात का उपयोग करना चाहते है चाहिए । स्वाट 10 दिनों के लिए संस्कृति और मानक प्रोटोकॉल का उपयोग काटा गया था; स्वात प्लेटों से पृथक adipocytes तो एक 1 मिलीलीटर सिरिंज (एक सुई के बिना) में लोड किया गया । एक चीरा एक प्रतिरक्षा eGFP-व्यक्त चूहों (मंजूरी के पृष्ठीय पक्ष पर त्वचा के नीचे किया गया था । सीजी-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl टीजी (सीएजी-EGFP) 1Osb/SzJ). यह एक छोटे पृष्ठीय चमड़े के नीचे जेब जिसमें स्वाट-संस्कृतिपूर्ण adipocytes सिरिंज के साथ इंजेक्शन थे बनाया है, और जेब तो बंद टांका लगाया गया था । 10 दिन बाद प्रत्यारोपण के बाद चूहों की बलि दी गई । प्रत्यारोपण स्पष्ट रूप से दिखाई और आसानी से बरामद किया गया (चित्रा 7a) । दोनों बरामद प्रत्यारोपण और एक माउस contralateral वसा डिपो तय किया गया, आयल एंबेडेड, और खोदी । Immunohistochemistry GFP (A10262, 1:100 कमजोर पड़ने), और मानव PLIN (एससी-३९०१६९, 1:100 कमजोर पड़ने) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ खोदी गई स्लाइड पर प्रदर्शन किया गया था । चयनित विरोधी PLIN एंटीबॉडी प्रयोग मानव PLIN लेकिन माउस नहीं दाग को मांय किया गया । बरामद प्रत्यारोपण से Adipocytes लगभग थे 50 – 120 µm आकार में, जो मानव Adipocytes के लिए उम्मीद की सीमा है, और GFP के लिए पूरी तरह से नकारात्मक थे (चित्रा 7b). हालांकि, लगभग 31% adipocytes मानव PLIN के लिए सकारात्मक थे, मेजबान में सफल engraftment का संकेत है । माउस वसा डिपो में adipocytes 20 आकार के थे-40 µm, जो माउस adipocytes के अनुरूप है, जबकि धुंधला GFP के लिए पूरी तरह से सकारात्मक और मानव PLIN (चित्रा 7c) के लिए पूरी तरह से नकारात्मक । ADSC चादरें (कोई सैंडविच वाट के साथ) सेल संस्कृति व्यंजन से scraped और नियंत्रण के रूप में चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । हालांकि, इन किसी भी वसूली ऊतक (नहीं दिखाया डेटा उपज नहीं) । यह संकेत दिया कि बरामद adipocytes परिपक्व संस्कृति स्वात से थे, और विभेदित मानव ADSCs का परिणाम नहीं है ।

Figure 1
चित्रा 1: स्वात विधि । (एक) eGFP के एक पत्रक के हस्तांतरण-एक pNIPAAm से ASCs लेबल, एक मानक ऊतक संस्कृति पकवान पर हो ASCs के एक दूसरे, unlabel्ड शीट पर ऊतक संस्कृति पकवान से चिह्नित स्वात की योजनाबद्ध । कीमा बनाया हुआ, प्राथमिक मानव वाट 2 ASCs शीट के बीच सैंडविच है । (ख) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन Brightfield, GFP, और एक (ए) में वर्णित तकनीक के द्वारा बनाई गई स्वाट के विलय चैनलों । स्केल बार = १०० µm. (ग) एक प्रतिनिधि के डिजिटल तस्वीर, 5 दिन पुरानी स्वात एक मानक 6 अच्छी तरह से थाली में संस्कृति । वाट की बड़ी मात्रा में अच्छी तरह से के नीचे करने के लिए छुरा सुरक्षित है । चित्रा लाऊ एट अलसे संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: स्वात संस्कृति में 8 सप्ताह में व्यवहार्य रहता है । सीरियल brightfield इमेजिंग ५५ दिनों से अधिक एक एकल स्वाट क्लस्टर के सेल मौत के अनुरूप कोई सुघड़ परिवर्तन प्रदर्शित करता है । स्केल बार्स = १०० µm. चित्रा लाऊ एट अलसे संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: स्वात अधिक से अधिक ५० दिनों में व्यवहार्य रहता है । (क) नील लाल दाग 15 दिनों के लिए संस्कृति वाले स्वात को धुंधला प्रतिबंध दर्शाता है, जीना व्यवहार्य adipocytes का संकेत है । आसपास के stromal कोशिकाओं पर दाग नहीं लगा । चित्रा 40X आवर्धन पर हैं, और स्केल बार = १०० µm. (ख) Propidium आयोडाइड (PI) स्वाट के धुंधला ५३ दिन के लिए प्रसंस्कृत का पता चलता है पूरा PI अपवर्जन, कोई adipocyte मौत का संकेत; स्केल बार = १०० µm. (ग) तेल-एक ५१ दिन पुरानी स्वात के लाल-O धुंधला adipocytes के लिए तटस्थ लिपिड के प्रतिबंध को दर्शाता है, adipocyte कोशिका झिल्ली की दीर्घकालिक स्थिरता का संकेत है । चित्रा लाऊ एट अलसे संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Immunocytochemistry दर्शाता है कि स्वात दाग की उंमीद स्थानीयकरण के साथ परिपक्व adipocyte सेल मार्कर के लिए सकारात्मक । (क) 2 सप्ताह पुरानी स्वात की फोकल माइक्रोस्कोपी लिपिड छोटी बूंद सतह के लिए स्थानीयकरण के साथ मानव PLIN + unilocular कोशिकाओं का पता चला । स्केल बार = १०० µm. (ख) 3 दिन पुरानी स्वात की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी कोशिका द्रव्य और (ग) PPARγ + कोशिकाओं को स्थानीयकरण के साथ सेल नाभिक के लिए स्थानीयकरण के साथ मानव FABP4 + कोशिकाओं का पता चला । स्केल बार = १०० µm. चित्रा लाऊ एट अल से संशोधित किया गया है । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: स्वात कुंजी adipocyte पहचान जीन अभिव्यक्ति रखता है । स्वात क्लस्टर collagenase 1, 14 के बाद पचा रहे थे, और संस्कृति और जीन में आरटी-qPCR द्वारा निर्धारित अभिव्यक्ति में 28 दिन । RT-qPCR दर्शाता है कि 1 दिन पुरानी और 14 दिन पुरानी स्वात (अ) PPARG, (ख) FABP, (ग) HSL, (घ) CbEBPA, (ङ) LPL और (च) ADIPOQ के उच्च स्तरों को संरक्षित करता है । ACTB का उपयोग संदर्भ जीन के रूप में किया गया. त्रुटि पट्टियां = मानक त्रुटि । चित्रा लाऊ एट अलसे संशोधित किया गया है। 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: स्वात बेसल adipokines स्रावित करता है और catecholamine उत्तेजना के लिए शारीरिक रूप से प्रतिक्रिया करता है । (a) एलिसा ठहराव की 24 ज बेसल लेप्टिन स्राव संस्कृति में 28 दिनों के बाद कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाता है । (ख) एड्रेनालाईन और forskolin के साथ एड्रीनर्जिक उत्तेजना हौसले से काटा प्राथमिक वाट में एक महत्वपूर्ण glycolytic प्रतिक्रिया उत्पंन (1.7 x) और विषय-1 पर और 5 दिन संस्कृति में मिलान स्वात । दिन 1 स्वाट एक ६.३-बेसल glycolysis से अधिक गुना वृद्धि के साथ catecholamine उत्तेजना के लिए जवाब दिया, जबकि दिन 5 स्वात एक ३.३-बेसल glycolysis से अधिक गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया । उत्तेजित glycolysis के मिलान ताजा वाट की तुलना में स्वाट में काफी अलग नहीं था (पी = ०.५३, एन = 4) । त्रुटि पट्टियां = मानक त्रुटि । फिगर को संशोधित किया है लाऊ एट अल. 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: स्वात vivo मेंreimplantित किया जा सकता है, संरक्षित पूरे ऊतक समारोह का प्रदर्शन । (एक) स्वात आसानी से एक प्रतिरक्षा माउस (तारांकन) में प्रत्यारोपण के बाद 10 दिनों visualized था । स्वाट सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित नहीं किया था, 10 दिनों से गल स्वात तरलीकृत गया होता । (ख) बरामद स्वात के वर्गों के बड़े प्रदर्शन किया, unilocular adipocytes (व्यास ५० १२० µm) कि eGFP थे । adipocytes के ३१.३% मानव PLIN + थे । मानव PLIN + adipocytes छोटी है, जो मानव जहां छोटे adipocytes अधिक हस्तांतरण जीवित रहने की संभावना है में कलम बांधने की वसा के नैदानिक टिप्पणियों के साथ फिट होगा किया जाता है । स्केल बार = १०० µm, 200X आवर्धन । (ग) Contralateral वसा एक ही चूहों से लिया पैड बहुत छोटे adipocytes (20-40 µm) का प्रदर्शन किया और मानव PLIN थे । स्केल बार = १०० µm, 200X आवर्धन । चित्रा लाऊ एट अल से संशोधित किया गया है । 11. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ADSCs के उपयोग के लिए सैंडविच मानव सफेद वसा ऊतक विवरण; मानव ADSC सेल लाइनों अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल15के माध्यम से अलग किया जा सकता है । हालांकि, प्रणाली व्यक्तिगत अनुसंधान आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (जैसे सैंडविच माउस वाट के लिए 3T3L-1 कोशिकाओं का उपयोग कर के रूप में) । इस प्रक्रिया में प्राथमिक मानव ऊतक हैंडलिंग शामिल है । मानक सुरक्षा सावधानियों कार्यरत होना चाहिए; बीएसएल-2 रोगजनकों (जैसे, एचआईवी, HepC) के रूप में मानव ऊतकों को संभालना । केवल एक बीएससी के तहत सीधे ऊतक संभाल । सभी उपयुक्त पीपीई के रूप में संस्थागत सुरक्षा मानकों द्वारा तय पहनें-डबल दस्ताने अत्यधिक की सिफारिश की है । ठीक से 10% ब्लीच समाधान या फिर से पहले ७०% इथेनॉल समाधान के साथ सभी की आपूर्ति और अपशिष्टों को संक्रमित उपयोग या निपटान ।

स्वात संस्कृति में पहली महत्वपूर्ण कदम की खरीद और बनाए रखने pNIPAAm-लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटें है । इस तरह के प्लेटें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, या वे स्थापित तरीकों12,13,14के माध्यम से उत्पादित किया जा सकता है । इन प्लेटों तापमान उत्तरदायी सेल संस्कृति सतहों हैं । महत्वपूर्ण तापमान (~ ३२ डिग्री सेल्सियस) के ऊपर, सतह hydrophobic है और कोशिकाओं का पालन करेंगे, ऊतक संस्कृति के लिए अन्य इलाज प्लास्टिक के समान । हालांकि, इस महत्वपूर्ण तापमान के नीचे, सतह हाइड्रोफिलिक हो जाता है और कोशिकाओं को प्लास्टिक की सतह से16अलग कर देना होगा । एक परिणाम के रूप में, देखभाल स्थापित करने के लिए लिया जाना चाहिए: 1) कैसे जल्दी से एक दिया सेल प्रकार पूर्ण प्रवाह तक पहुंचने से पहले monolayer से अलग कर देना जाएगा (यानी, सामांय मीडिया में परिवर्तन के दौरान) और 2) जिलेटिन के साथ तापमान कम करने के लिए आवश्यक समय गोताख़ोर pNIPPAm-लेपित प्लेट के लिए लागू है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरे सेल शीट dissociates । मीडिया परिवर्तन ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गरम मीडिया के साथ किया जाना चाहिए; यदि कक्ष त्वरित पृथक्करण के लिए प्रवण हैं, तो बीएससी के अंतर्गत ३७ ° c पर सेट हीट ब्लॉक पर मीडिया परिवर्तन करें ।

दूसरा महत्वपूर्ण कदम वसा ऊतक प्रसंस्करण के लिए स्वाट बोने की तैयारी है । हम नख़रेबाज़ वाट द्वारा निष्फल संदंश के साथ हमारे लक्षण वर्णन किया और रेजरों निष्फल । हालांकि, मानव प्रावरणी एक रेजर के साथ आसानी से नहीं काटा जा सकता है । adipocyte को अधिकतम करने-प्रावरणी अनुपात एक दीर्घकालिक अवधि में संभव के रूप में स्वाट के भीतर ज्यादा वसा ऊतक के रूप में बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । बरकरार प्रावरणी के बड़े टुकड़ों ADSCs और adipocytes, जो स्वाट एक साथ रखने के लिए आवश्यक है के बीच सेल सेल संपर्क को रोकने जाएगा । प्रावरणी की अत्यधिक मात्रा भी एक "एक धागे पर खींच" प्रभाव हो सकता है । जबकि एक भी वाट क्लस्टर पड़ोसी समूहों को प्रभावित किए बिना एक थाली से अलग कर देना कर सकते हैं, एकाधिक प्रावरणी द्वारा जुड़े समूहों एक monolayer से काफी समूहों खींच एक स्वात अच्छी तरह से व्यर्थ प्रदान कर सकते हैं । Liposuction, जो वाट के मशीनी नख़रेबाज़ शामिल है इस मुद्दे को दरकिनार कर सकते है के रूप में प्रावरणी पतले सर्जरी के दौरान भरती है । हालांकि, liposuction के दौरान रोगियों एड्रेनालाईन की उच्च खुराक के साथ नियमित इलाज कर रहे हैं; ऊतक (और बाद में प्रयोगों) पर इस उपचार के संभावित परिणामों के लिए एक अध्ययन के दौरान हिसाब होना चाहिए ।

स्वाट संस्कृति में अंतिम महत्वपूर्ण कदम एक प्रयोगात्मक संस्कृति मीडिया का चयन है । हम एक मानक सेल संस्कृति निर्माण का उपयोग हमारे प्रारंभिक लक्षण वर्णन प्रयोगों प्रदर्शन (10% FBS, DMEM में 1x पेनिसिलिन/Streptomycin) । हालांकि, adipocyte प्रतिलेखन अधिकतम के बारे में उपलब्ध साहित्य के आधार पर, हम एक विशेष निर्माण का इस्तेमाल किया (7 µ एम इंसुलिन, 30 µ एम डेक्समेतएसॉनी, Streptomycin मीडिया में 1x पेनिसिलिन/M199)17. इस निर्माण प्रतिलेखन के प्रारंभिक स्तर में सुधार, लेकिन समय के साथ कम स्तर । हमारा मानना है कि इस वजह से शरीर में, adipocytes रासायनिक संकेतों की एक विस्तृत विविधता को उजागर कर रहे हैं, अक्सर फेड और एक दिन के पाठ्यक्रम पर भूखे राज्यों के बीच साइकिल चालन । इस प्रकार, यह और हमारे सेल संस्कृति मीडिया के लिए पूरक अनुकूलन द्वारा समय पर मनाया transcriptional प्रोफ़ाइल में सुधार संभव होना चाहिए ।

स्वाट हार्वेस्ट (प्रोटोकॉल, खंड 5) संस्कृति से adipocytes अलग, नमूना मात्रा कम कर देता है, और आसपास के ADSC शीट से हस्तक्षेप को हटा । यह adipocyte homogenization पहले कर सकते है (जो प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड अलगाव के लिए आवश्यक है), या बरकरार adipocytes की कार्यात्मक परख (जैसे glycolysis या ग्लूकोज के रूप में आगे परख) । वैकल्पिक रूप से, बरकरार स्वात प्लेट immunocytochemical धुंधला के लिए काटा जा सकता है, जो ADSC शीट monolayer को धुंधला प्रक्रिया भर में वाट समूहों को सुरक्षित करने की अनुमति देता है । इस मामले में, संस्कृति मीडिया महाप्राण और मानक प्रोटोकॉल के माध्यम से पूरी संस्कृति को ठीक । हालांकि, हम 3d adipocyte क्लस्टर को समतल करने और परिणामी छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए इमेजिंग से पहले एक ग्लास coverslip जोड़ने का सुझाव देते हैं ।

हमारा मानना है कि स्वात एक दवा स्क्रीनिंग मंच के रूप में प्रमुख क्षमता है । तकनीक सरल, reproducible है, और पारंपरिक ऊतक संस्कृति प्लेटों का इस्तेमाल करता है । इसलिए, दवा स्क्रीनिंग प्रयोगों के संस्कृति माध्यम के लिए एक औषधीय सक्रिय यौगिक जोड़कर निष्पादन योग्य हैं । Adipocytes तो जीन अभिव्यक्ति पर यौगिक के प्रभाव की जांच करने के लिए काटा जा सकता है, epigenetic प्रोफ़ाइल, इंसुलिन संवेदनशीलता, आदि संस्कृति माध्यम को पर्यावरण विषाक्त पदार्थों के अलावा इसी तरह Adipocytes पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . क्योंकि स्वात शोधकर्ता समय पर व्यक्तिगत adipocyte समूहों को ट्रैक करने के लिए अनुमति देता है, यह विशिष्ट एक इलाज है कि adipocytes के लिए एक दृश्य phenotypic परिवर्तन करता है मूल्यांकन करने के लिए अनुकूल है । एक प्रमुख उदाहरण मानव adipocyte "तमंचा होगा," जिसमें एक सफेद, लिपिड भंडारण adipocyte "भूरे रंग का हो जाता है" या एक thermogenic, multilocular ब्राउन adipocyte18के समान हो जाता है । यह संभावित प्रमुख नैदानिक प्रासंगिकता है कि माउस मॉडलों में प्रदर्शन किया गया है की एक घटना है, लेकिन एक मानव में कभी नहीं । स्वाट पर सह-कल्चरल रूपांतर भी जबरदस्त शोध क्षमता रखते हैं । स्वात एक प्राकृतिक सह संस्कृति प्रणाली है कि मानक सेल संस्कृति कुओं का इस्तेमाल होता है । इसलिए, एक सैंडविच कोशिकाओं को बदलने या ऊतक संस्कृति झिल्ली आवेषण का उपयोग करके अन्य नैदानिक प्रासंगिक सेल प्रकार के बीच adipocytes बनाए रख सकते हैं । उदाहरण के लिए, हेपैटोसाइट्स ऊपरी सैंडविच सेल शीट के रूप में एक दवा है कि वसा ऊतक तक पहुंचने से पहले जिगर के माध्यम से फ़िल्टर्ड है स्क्रीन के रूप में कार्य सकता है । इसी तरह, कैंसर की कोशिकाओं को एक झिल्ली डालने पर स्वाट पर उगाया जा सकता है की जांच कैसे adipocytes कैंसर विकृति में योगदान ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक LSU स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र, जो परियोजना वित्त पोषित द्वारा प्रदान की संस्थागत समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x HBSS Thermofisher 14185052
Gelatin Sigma-aldrich G9391
Collagenase Sigma-aldrich C5138
Adenosine Sigma-aldrich A9251
DMEM Thermofisher 11995065
M199 Media Thermofisher 11043023 Phenol red-free 
250 µm Mesh Filter Pierce 87791
0.2 µm Syringe Filter Celltreat 229747
5 mL Luer-Lok syringes  BD 309646
Metal Washers These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3 g 
Name Company Catalog Number Comments
Heated Equipment
Incubated Orbital Shaker VWR 10020-988 Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion
Heat Block Set to 37-40 °C and placed under Biosafety Cabinet
Water Bath Set to ~75 °C
Name Company Catalog Number Comments
Specialized Plastics
Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell Nunc 174902  or 174901 These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6 cm for 6 cm dish, <3.5 cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6 cm dish, 5.1 g for 6-well plate
Plastic Plunger Apparatus These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics

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References

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