Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trapianto in utero (IUT) è un modo unico e versatile di terapia che può essere utilizzato per introdurre le cellule staminali, vettori virali o altre sostanze all'inizio della gestazione. La spiegazione razionale dietro IUT a scopo terapeutico è basata sulle piccole dimensioni del feto, l'immaturità fetale immunologica, l'accessibilità e la natura proliferativa delle cellule staminali o progenitrici fetale e il potenziale di trattare una malattia o l'insorgenza di sintomi prima della nascita. Approfittando di queste proprietà inerente allo sviluppo normale del feto, la fornitura di cellule staminali ematopoietiche (HSC) tramite un IUT ha il potenziale per il trattamento di disordini congeniti ematologici quali anemia falciforme, senza la necessaria i trapianti mieloablativa o immunosoppressiva condizionata necessaria per HSC postnatale. Allo stesso modo, l'accessibilità delle cellule progenitrici in organi multipli durante lo sviluppo potenzialmente permette per un targeting più efficiente delle cellule staminali/progenitrici dopo un IUT di vettori virali per la terapia genica o editing genomico. Inoltre, IUT può essere usato per studiare i processi inerenti allo sviluppo normali tra cui, ma non limitato a, lo sviluppo di tolleranza immunologica. Il modello murino fornisce un mezzo prezioso e conveniente per comprendere le potenzialità e le limitazioni di IUT prima studi pre-clinici di animali grandi e un'eventuale applicazione clinica. Qui, descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un IUT nel feto murino attraverso vie endovenosa e intra-amniotic. Questo protocollo è stato usato con successo per delucidare i meccanismi dietro nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, induzione della tolleranza e la terapia genica nell'utero e le condizioni necessarie.
Introduzione
Recenti progressi nella diagnosi e lo screening prenatale hanno portato alla luce la possibilità di trattare il feto per un certo numero di disordini congeniti che non hanno opzioni di adeguato trattamento postnatale e provocare la morbosità e mortalità significative. In particolare, nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (IUHCT) e la modifica di gene terapia/genoma hanno il potenziale per approfittare delle proprietà inerente allo sviluppo normale del feto per trattare congenita ematologica, sistema immunitario e genetico i disordini più efficientemente postnatale trapianto di HSC e gene terapia/genoma modifica può fare1,2. In particolare, a causa delle piccole dimensioni del feto, la cellula donatrice o dose di vettore virale può essere ingrandita per il peso del destinatario. Inoltre, l'immaturità immunologica del feto consente donatore HSCs per essere iniettato senza il mieloablativa e immunosoppressiva condizionata che è necessaria in protocolli di trapianto postnatale. Allo stesso modo, vettori virali che trasportano un transgene terapeutico o la tecnologia di editing del genoma possono essere iniettati senza una risposta immunitaria limitante per il prodotto di transgene o il vettore virale. Infine, l'accessibilità e la natura proliferativa delle cellule embrionali staminali/progenitrici diano la possibilità di un più efficiente trasduzione delle cellule del progenitor di destinazione, nonché taluni modi di genoma editing (regia di omologia riparazione) che richiedono ciclismo cellule si verificano in modo efficiente. Il modello murino serve come un mezzo penetrante e conveniente per affrontare questioni importanti in biologia delle cellule staminali e immunologia prima della sperimentazione in modelli pre-clinici di animali grandi e, come tale, ha servito come il modello primario in cui IUHCT e nell'utero terapia genica sono stati esplorati1,2,3.
Anche se molte variabili svolgono un ruolo importante nel successo di IUHCT e nell'utero gene editing terapia/genomico in modelli murini e grandi animali, una variabile fondamentale è il metodo di consegna del vettore virale o HSCs. La consegna di grandi dosi di donatore HSCs con un effetto di primo passaggio che si verificano nel fegato fetale, l'organo ematopoietico al momento della IUHCT, ha dimostrata di essere determinante nel raggiungimento di livelli macrochimeric di attecchimento in mouse e modelli animali di grandi dimensioni4 ,5. Questo è stato raggiunto tramite un'iniezione di donatore cellule tramite la vena vitellina nel modello del topo e tramite un'iniezione intra-cardiaca nel modello canino. Il percorso di iniezione anche gioca un ruolo fondamentale nell'ottimizzazione del progenitor di diversi organi durante lo sviluppo. Ad esempio, un'iniezione endovenosa tramite la vena vitellina ha dimostrata in modo efficiente trasduce cardiomyocytes ed epatociti segue un fine gestazione iniezione6,7. In alternativa, un'iniezione intra-amniotic dei vettori virali permette il targeting degli organi che sono fisicamente esposti basati su pieghevole/sviluppo embrionale al momento dell' iniezione8. Questo è meglio esemplificato dal targeting di epitelio respiratorio tramite un'iniezione intra-amniotic nel tardo la gestazione per approfittare dei normali movimenti fetali "respirazione", che espone le vie respiratorie per il vettore virale nell'amniotico fluido9. Queste due modalità di IUT, per via endovenosa tramite la vena vitellina e intra-amniotic, sono state la base per esperimenti multipli passate e in corso nel nostro laboratorio. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente le modalità di esecuzione per via endovenosa e intra-amniotic IUT nel modello murino.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
I protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato di uso presso The Children Hospital di Philadelphia e istituzionali Animal Care.
1. creazione delle pipette di iniezione
- Utilizzando un estrattore micropipetta verticale, tirare una pipetta di microcapillary 100 µ l (Figura 1A - 1C). Calibrare la levetta della micropipetta in modo che la parte conica è > 1 cm di lunghezza.
Nota: Inizialmente, le impostazioni dell'estrattore devono essere regolate per una lunghezza ottima. Un'impostazione di calore superiore farà la punta più a lungo, e un'impostazione di tiro superiore farà il diametro della punta più stretta. - Tagliare l'estremità conica in modo che è ≥ 1 cm di lunghezza. Assicurarsi che il diametro interno sulla punta dell'ago è tra 70 µm e 100 µm e che è inversamente proporzionale alla lunghezza dell'estremità conica.
Nota: Il diametro interno dipende anche la calibrazione dell'estrattore della micropipetta. Vedere le istruzioni del produttore dell'estrattore della micropipetta verticale o qualsiasi tipo di estrattore micropipetta preferito. - Dopo aver verificato che l'ago ha il diametro interno corretto, creare la smussatura del 15-20 gradi di affilare la punta utilizzando una Smussatrice micropipetta con un diamante Affilatura ruota (Figura 2A - 2C). Assicuratevi di appoggiare la punta delicatamente sulla ruota senza troppa pressione, a diminuire le possibilità di rottura o la punta di cracking.
Nota: Un pennello può essere utilizzato per spazzare via i detriti che si accumula sulla punta dell'ago. - Valutare la punta sotto un microscopio e assicurarsi che la punta sia rotonda senza chip o crepe. Rivalutare il diametro interno per assicurarsi che è tra 70 µm e 100 µm (Figura 2D - 2 H).
- Disegnare linee sul resto dell'ago per designare 5 µ l di volume tra di loro (ad esempio, gli aghi con un diametro interno di 1,3 mm dovrebbero avere linee disegnate a incrementi di 3,77 mm).
- Sterilizzare in autoclave il priore di aghi da usare in chirurgia e maneggiarli con guanti sterili.
2. nell'utero iniezioni
- Preparare i necessari strumenti in autoclave li prima del tempo. Includono strumenti essenziali come porta aghi microinjector, un driver di ago chirurgico, un paio di Adson da, un paio di forbici curve regolare del tessuto, una siringa da insulina 1 mL, un paio di applicatori con punta di cotone, una pipetta di trasferimento, una provetta conica da 50 mL e un Pack di suture polyglactin 910 4-0.
- Usando una tecnica sterile, inserire l'ago per il porta-aghi e collegarlo al microinjector.
Nota: Le impostazioni dell'azoto compresso utilizzato sono come segue: iniettare 4-6 psi, equilibrio 0 psi. A seconda di ciò che è stato iniettato, in particolare, la viscosità della per iniettato, così come la dimensione della micropipetta, i tempi di iniezione variano tra 0.3 - 1.5 s. - Pulire la punta dell'ago di tutti i possibili residui di elaborazione di 5-10 µ l di sterile 1x tampone fosfato salino (PBS) e quindi di sgombrare. Ripetere questo x 2-3.
- Preparare incinto topi femmina di 2 - 6 mesi per la chirurgia di rasatura loro addomi con un clipper. Fare attenzione a non danneggiare i capezzoli. Somministrare i farmaci di dolore orale (ad esempio, 100 µ l di 1,5 mg/mL sospensione orale di meloxicam per topo).
- Iniziare a riempire l'ago con il materiale desiderato (cellule/vettore/droga) al volume desiderato. Fare attenzione a non rompere la punta dell'ago durante il riempimento l'ago.
Nota: Il volume di iniezione al feto varia in base alla specifica progettazione sperimentale. 20 µ l funziona bene per l'iniezione di un gran numero di cellule (cioè, fino a 107 cellule nella vena vitellina. Per esempio, abbiamo consegnato 1 x 107 intero midollo osseo cellule isolate da C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 verde fluorescente Protein (GFP)"] topi tramite la vena vitellina in feti di Balb/c gestazionale giorno-14. Per preparazioni iniettabili vettore virale, una singola iniezione di 10 µ l di un vettore diluito 1:1 con PBS funziona bene. - Per calibrare il tempo di iniezione, eseguire la procedura seguente.
- La modalità pulsante 3x su microinjector per raggiungere la schermata di calibrazione di iniezione. Regolare il tempo di iniezione con l'aggiunta di intervalli di 10 o 100 ms e spingere la modalità pulsante 2x.
- Premere il pulsante di equilibrio e spingere il pedale una volta. Ora premere nuovamente il pedale e valutare quanto volume viene svuotato fuori l'ago a spingere. Se non calibrata al volume desiderato di 5-20 µ l per pedale, ripetere i passaggi 2.6.1 e 2.6.2.
Nota: In generale, è buona calibrare ogni push-to-consegnare la metà del volume totale di destinazione in un momento. Mentre è possibile iniettare più di 30 µ l o addirittura 40 µ l di volume totale, non generalmente andiamo oltre 20 µ l al feto, per via endovenosa o intra-amniotic.
- Riempire l'ago fino al livello desiderato.
- Iniziare a consegnare l'anestesia al mouse regolando il flussometro ossigeno a 1 L/min e il vaporizzatore di isoflurane al 3%.
- Confermare se il mouse è anestetizzato controllando per l'assenza del riflesso del pedale. Trasferire il mouse a un rilievo di riscaldamento in posizione supina.
- Applicare il gel lubrificante occhio per evitare disidratazione corneale. Fissare il mouse nel posto registrando gli arti superiori e inferiori al pad.
- Preparare l'addome con clorexidina scrub seguita dall'alcool e iniettare un anestetico locale (ad esempio, 100 µ l di bupivacaina 0,25%) per via sottocutanea (Figura 3A).
- Con le forbici, fare un'incisione della pelle di 1-2 cm in modo che il bordo inferiore è no più vicino di 1 cm per il introitus; la fascia sotto è molto sottile e traslucido.
- Identificare la linea mediana della fascia che è più trasparente rispetto all'area circostante. Fare attenzione a non danneggiare i vasi epigastrici che si trovano su entrambi i lati della linea mediana. I vasi epigastrici dovrebbero farsi male, mantiene la pressione con applicatori di punta di cotone per fermare l'emorragia.
- Utilizzando forcipe Adson, pizzicare la fascia senza afferrare uno qualsiasi degli organi sottostanti come l'intestino, vescica o feti. Aprire la fascia con le forbici, facendo attenzione a non danneggiare gli organi. Una volta in modo sicuro nell'addome, estendere l'incisione fascia. Renderlo non più che l'incisione cutanea.
- Applicatori di punta di cotone consente di spostare l'intestino nella parte superiore dell'addome, esponendo in tal modo l'utero gravido. Consegnare l'utero fuori l'incisione, identificare accuratamente le ovaie destra e sinistra per garantire che tutti i feti sono contati (Figura 3B).
- Posizionare l'utero sinistro indietro nell'addome in modo che solo l'utero giusto è esposto; Questo impedisce l'essiccazione dell'utero e mantiene i feti non iniettato caldo.
- Tenere più laterale feto/amniotico tra il pollice e il dito indice della mano non dominante dell'operatore (Figura 3C). Sempre essere gentile da non provocare alcun danno per i feti.
- Posizionare il microscopio di dissezione (un ingrandimento 10x è l'ideale) e regolare la messa a fuoco in modo che il feto è in vista. Regolare l'illuminazione per una migliore visualizzazione.
- Identificare la parte che verrà iniettata (vena vitellina, Amnios). Per iniezioni endovenose, visualizzare sia le vene vitellina e loro anastomosi. Per iniezioni intra-amniotic, orientare il feto con il lato destro in vista.
- Raggiungere lo spazio di destinazione con l'ago come descritto di seguito.
- Per un' iniezione endovenosa, procedere come segue.
- Ruotare l'utero in modo che la vena vitellina che è stata iniettata è parallela alla punta dell'ago; Tenete a mente che le iniezioni devono essere effettuate verso l'anastomosi di due vene.
- Gettare l'ago sull'utero ad un angolo di 5° e perforare la parete uterina. Ora che la punta è tra la parete uterina ed il sacco amniotico, posizionare la punta direttamente in cima la vena vitellina.
- Ad un angolo quasi tangenziale, scivolare l'ago sopra la vena fino a quando la smussatura trafigge e avanza nel recipiente; Questo è evidente da un lampo di sangue visto nella punta dell'ago (Figura 3D).
Nota: L'accesso alla vena potrebbe richiedere alcuni tentativi, come l'ago non può perforare la vena con la prima planata sopra la vena.
- Per un' iniezione intra-amniotic, procedere come segue.
- Ruotare il sacco amniotico e trovare una posizione priva di vasi a trafiggere.
- Scegliere l'ago perpendicolare alla parete uterina e perforare l'utero, il sacco vitellino e quindi il sacco amniotico. Fare attenzione a non perforare attraverso qualsiasi tessuto fetale. Assicurarsi che l'ago è passato tra le membra come questo conferma che l'ago è nel sacco amniotico. Quindi procedere con l'iniezione.
- Per un' iniezione endovenosa, procedere come segue.
- Iniettare il volume appropriato di materiale desiderato (solitamente 10-20 µ l) premendo il pedale.
Nota: Poiché l'iniettore deve mantenere la visualizzazione della punta dell'ago attraverso il microscopio a tutte le volte, una seconda persona deve leggere le marcature sul ferro per quantificare la quantità iniettata e informare l'iniettore quanto volume resta da iniettare. Una discussione prima dell'iniezione tra l'iniettore e assistente è importante evitare qualsiasi confusione e ritardi. Questo è particolarmente importante per le iniezioni endovenose perché una ritardata rimozione dell'ago vi permetterà un riflusso di sangue venoso nell'ago e il risultato in un dosaggio errato. - Una volta che il volume desiderato è consegnato, ritirare l'ago dal sito di iniezione. Come ci può essere qualche sanguinamento da nave puntura sito con iniezioni endovenose, tenere la pressione con il lato dell'ago per 10-15 s fermare l'emorragia.
- Procedere al feto prossimo. Continuare fino a quando tutti i feti del corno uterino di destra sono stati iniettati.
- Rimuovere il corno uterino sinistro dall'addome e sostituire il corno uterino destra indietro all'interno della cavità peritoneale.
Nota: In alcuni casi, l'ago deve essere riempito con il injectant. - Una volta che tutti i feti sono stati iniettati, sostituire l'utero nell'addome (Figura 3E). Assicurarsi di evitare un volvolo intestinale o uterino.
- Con una pipetta monouso, posto circa 2 mL di 1X PBS nell'addome per sostituire eventuali perdite insensibili.
- Chiudere la gronda e addome in uno strato continuo con 4-0 polyglactin 910 punti di sutura per evitare di ferire gli organi sottostanti durante la chiusura (Figura 3F - 3G).
- Rimuovere il nastro e trasferire il mouse a una gabbia sotto una lampada di calore. Fare attenzione a non posizionare la lampada di calore troppo vicino al mouse. Assicurarsi che la gabbia dispone di biancheria da letto, cibo e acqua.
Nota: Una camera calda termostaticamente controllata può essere utilizzata anche. Il mouse è sveglio quando è in posizione verticale e a piedi. - Osservare il mouse quotidianamente e dare antidolorifici come necessario.
Nota: Ordinariamente diamo meloxicam giorni postoperatori 1 e 2 e a volte il giorno 3 Se il mouse Mostra segni di dolore. - Se facendo un intervento di batch con lo stesso materiale di iniezione, pulire l'ago per iniezione con PBS sterile. Se l'iniezione con un materiale diverso, smaltire l'ago in un contenitore di sharps e usi un nuovo ago.
Nota: Si consiglia di favorire i cuccioli con madri surrogate immediatamente dopo la nascita, nel caso in cui la diga monta una risposta immunitaria agli anticorpi injectant e trasferimenti per cuccioli via latte.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Sopravvivenza e attecchimento sono misure importanti di successo per gli esperimenti IUHCT. A seconda degli specifici endpoint di un esperimento, i feti che ha ricevuto un IUHCT possono essere analizzati prenatally con un taglio cesareo o dopo la nascita. In media, i tassi di sopravvivenza dopo iniezioni endovenose vanno da 75-100%. I tassi di sopravvivenza dopo le iniezioni intra-amniotic tendono a Fiera meglio di iniezioni endovenose, a circa 85-100%.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Il trapianto in utero è una potenziale terapia per molte patologie congenite che possono essere diagnosticate presto nella gestazione. Il modello murino per IUT permette ai ricercatori di esplorare l'ambiente fetale o di sperimentare con diverse terapie. A seconda di ciò che è stato iniettato e che cosa è presi di mira, per via endovenosa o intra-amniotic nell'utero trapianto può fornire una consegna affidabile di un injectant nello spazio desiderato.
Quando la destinazione o...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Guanti | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Pinze con denti | Strumenti per le scienze fini | 11027-12 | |
| Pinze Adson senza denti | Strumenti per le scienze | 11006-12 | |
| Forbici curve Strumenti per | le scienze | 14075-11 | |
| Forbici pesanti | Strumenti per le scienze | 14002-13 | |
| Cacciavite per aghi | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Pipetta di trasferimento | Medline | GSI135010 | |
| applicatori con punta in cotone Medline | MDS202000 | ||
| 50 mL Tubo conico | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Nastro | 3M | 1527-1 | |
| Lubrificante per gli occhi | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Cuscinetto riscaldante | K& H | 3060 | |
| Stereomicroscopio | Leica | MZ16 | |
| Iniettore | Narishige | HI01PK01 | |
| Tubi capillari in vetro | Kimble | 71900-100 | |
| Estrattore verticale per micropipette | Sutter Instruments | P-30 | |
| Smussatore per microelettrodi | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Microiniettore pneumatico | Narishige | IM-300 | |
| Siringa da insulina | BD | ||
| Filtro | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Macchina per anestesia | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurano | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Gas N2 | Airgas | NI 125 | |
| Gas O2 | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP vettore virale | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Riferimenti
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoietic cell transplantation: recent progress and the potential for clinical application. Cytotherapy. 15, 525-535 (2013).
- Peranteau, W., et al. Correction of murine hemoglobinopathies by prenatal tolerance induction and postnatal nonmyeloablative allogeneic BM transplants. Blood. 126 (10), 1245-1254 (2015).
- Vrecenak, J., et al. Stable Long-Term Mixed Chimerism Achieved in a Canine Model of Allogeneic in utero Hematopoietic Cell Transplantation. Blood. 124 (12), 1987-1995 (2014).
- Peranteau, W., et al. CD26 Inhibition Enhances Allogeneic Donor-Cell Homing and Engraftment after in utero Hematopoietic-Cell Transplantation. Blood. 108 (13), 4268-4274 (2006).
- Waddington, S., et al. In utero gene transfer of human factor IX to fetal mice can induce postnatal tolerance of the exogenous clotting factor. Blood. 101 (4), 1359-1366 (2003).
- Stitelman, D., et al. Developmental Stage Determines Efficiency of Gene Transfer to Muscle Satellite Cells by in utero Delivery of Adeno-Associated Virus Vector Serotype 2/9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 1, 14040(2014).
- Endo, M., et al. Gene Transfer to Ocular Stem Cells by Early Gestational Intraamniotic Injection of Lentiviral Vector. Molecular Therapy. 15 (3), 579-587 (2007).
- Boelig, M., et al. The Intravenous Route of Injection Optimizes Engraftment and Survival in the Murine Model of In utero Hematopoietic Cell Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22 (6), 991-999 (2016).
- Wu, C., et al. Intra-amniotic Transient Transduction of the Periderm with a Viral Vector Encoding TGFβ3 Prevents Cleft Palate in Tgfβ3-/-. Mouse Embryos. Molecular Therapy. 1, 8-17 (2013).
- Roybal, J., Endo, M., Radu, A., Zoltick, P., Flake, A. Early gestational gene transfer of IL-10 by systemic administration of lentiviral vector can prevent arthritis in a murine model. Gene Therapy. 18 (7), 719-726 (2011).
- Reay, D., et al. Full-Length Dystrophin Gene Transfer to the Mdx Mouse in utero. Gene Therapy. 15 (7), 531-536 (2008).
- Ahmed, S., Waddington, S., Boza-Morán, M., Yáñez-Muñoz, R. High-Efficiency Transduction of Spinal Cord Motor Neurons by Intrauterine Delivery of Integration-Deficient Lentiviral Vectors. Journal of Controlled Release. 273, 99-107 (2018).
- Haddad, M., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. Fetal Brain-Directed AAV Gene Therapy Results in Rapid, Robust, and Persistent Transduction of Mouse Choroid Plexus Epithelia. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2, 101(2013).
- Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., MacKenzie, T. A mouse model of in utero transplantation. Journal of Visualized Experiments. (47), e2303(2011).
- Davey, M., et al. Jaagsiekte Sheep Retrovirus Pseudotyped Lentiviral Vector-Mediated Gene Transfer to Fetal Ovine Lung. Gene Therapy. 19 (2), 201-209 (2011).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
