Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.
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Articolo metodologico
Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trapianto in utero (IUT) è un modo unico e versatile di terapia che può essere utilizzato per introdurre le cellule staminali, vettori virali o altre sostanze all'inizio della gestazione. La spiegazione razionale dietro IUT a scopo terapeutico è basata sulle piccole dimensioni del feto, l'immaturità fetale immunologica, l'accessibilità e la natura proliferativa delle cellule staminali o progenitrici fetale e il potenziale di trattare una malattia o l'insorgenza di sintomi prima della nascita. Approfittando di queste proprietà inerente allo sviluppo normale del feto, la fornitura di cellule staminali ematopoietiche (HSC) tramite un IUT ha il potenziale per il trattamento di disordini congeniti ematologici quali anemia falciforme, senza la necessaria i trapianti mieloablativa o immunosoppressiva condizionata necessaria per HSC postnatale. Allo stesso modo, l'accessibilità delle cellule progenitrici in organi multipli durante lo sviluppo potenzialmente permette per un targeting più efficiente delle cellule staminali/progenitrici dopo un IUT di vettori virali per la terapia genica o editing genomico. Inoltre, IUT può essere usato per studiare i processi inerenti allo sviluppo normali tra cui, ma non limitato a, lo sviluppo di tolleranza immunologica. Il modello murino fornisce un mezzo prezioso e conveniente per comprendere le potenzialità e le limitazioni di IUT prima studi pre-clinici di animali grandi e un'eventuale applicazione clinica. Qui, descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un IUT nel feto murino attraverso vie endovenosa e intra-amniotic. Questo protocollo è stato usato con successo per delucidare i meccanismi dietro nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, induzione della tolleranza e la terapia genica nell'utero e le condizioni necessarie.
Introduzione
Recenti progressi nella diagnosi e lo screening prenatale hanno portato alla luce la possibilità di trattare il feto per un certo numero di disordini congeniti che non hanno opzioni di adeguato trattamento postnatale e provocare la morbosità e mortalità significative. In particolare, nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (IUHCT) e la modifica di gene terapia/genoma hanno il potenziale per approfittare delle proprietà inerente allo sviluppo normale del feto per trattare congenita ematologica, sistema immunitario e genetico i disordini più efficientemente postnatale trapianto di HSC e gene terapia/genoma modifica può fare....
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Protocollo
I protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato di uso presso The Children Hospital di Philadelphia e istituzionali Animal Care.
1. creazione delle pipette di iniezione
- Utilizzando un estrattore micropipetta verticale, tirare una pipetta di microcapillary 100 µ l (Figura 1A - 1C). Calibrare la levetta della micropipetta in modo che la parte conica è > 1 cm di lunghezza.
Nota: Inizialmente, le impostazioni dell'estrattore devono essere regolate per una lunghezza ottima. Un'impostazione di calore superiore farà la punta più a lungo, e un'impostazione di tiro superiore far....
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Risultati
Sopravvivenza e attecchimento sono misure importanti di successo per gli esperimenti IUHCT. A seconda degli specifici endpoint di un esperimento, i feti che ha ricevuto un IUHCT possono essere analizzati prenatally con un taglio cesareo o dopo la nascita. In media, i tassi di sopravvivenza dopo iniezioni endovenose vanno da 75-100%. I tassi di sopravvivenza dopo le iniezioni intra-amniotic tendono a Fiera meglio di iniezioni endovenose, a circa 85-100%.
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Discussione
Il trapianto in utero è una potenziale terapia per molte patologie congenite che possono essere diagnosticate presto nella gestazione. Il modello murino per IUT permette ai ricercatori di esplorare l'ambiente fetale o di sperimentare con diverse terapie. A seconda di ciò che è stato iniettato e che cosa è presi di mira, per via endovenosa o intra-amniotic nell'utero trapianto può fornire una consegna affidabile di un injectant nello spazio desiderato.
Quando la destinazione o.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Guanti | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Pinze con denti | Strumenti per le scienze fini | 11027-12 | |
| Pinze Adson senza denti | Strumenti per le scienze | 11006-12 | |
| Forbici curve Strumenti per | le scienze | 14075-11 | |
| Forbici pesanti | Strumenti per le scienze | 14002-13 | |
| Cacciavite per aghi | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| Pipetta di trasferimento | Medline | GSI135010 | |
| applicatori con punta in cotone Medline | MDS202000 | ||
| 50 mL Tubo conico | Fischer Scientific | 14-432-22 | |
| Nastro | 3M | 1527-1 | |
| Lubrificante per gli occhi | Major LubriFresh | 0904-6488 | |
| Cuscinetto riscaldante | K& H | 3060 | |
| Stereomicroscopio | Leica | MZ16 | |
| Iniettore | Narishige | HI01PK01 | |
| Tubi capillari in vetro | Kimble | 71900-100 | |
| Estrattore verticale per micropipette | Sutter Instruments | P-30 | |
| Smussatore per microelettrodi | Sutter Instruments | BV-10 | |
| IM-300 Microiniettore pneumatico | Narishige | IM-300 | |
| Siringa da insulina | BD | ||
| Filtro | Genesee Scientific | 25-244 | |
| Compac5 Macchina per anestesia | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| Isoflurano | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Gas N2 | Airgas | NI 125 | |
| Gas O2 | Airgas | OX 125 | |
| Ad-GFP vettore virale | Penn Vector Core | H5'.040.CMV.eGFP |
Riferimenti
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoieti....
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Ristampe e permessi
