Summary
Alteraciones en los metabolitos de quinurenina vía (KP) neuroactivos implicados en enfermedades psiquiátricas. Investigar los resultados funcionales de un alterado quinurenina vía metabolismo en vivo en los roedores puede ayudar a elucidar nuevos enfoques terapéuticos. El protocolo actual combina enfoques bioquímicos y de comportamiento para investigar el impacto de un desafío de quinurenina aguda en ratas.
Abstract
La vía de la quinurenina (KP) de la degradación de triptófano ha sido implicada en trastornos psiquiátricos. Específicamente, el metabolito derivado de astrositos ácido quinurénico (KYNA), un antagonista en ambos N-metil-d-aspartato (NMDA) y α7 los receptores nicotínicos de la acetilcolina (α7nACh), se ha implicado en procesos cognitivos en la salud y la enfermedad. Como los niveles KYNA son elevados en los cerebros de pacientes con esquizofrenia, un mal funcionamiento en los receptores colinérgicos y glutamatérgicos se cree que la causal se relaciona con disfunción cognitiva, un dominio de base de la psicopatología de la enfermedad. KYNA puede jugar un papel patofisiológico importante en individuos con esquizofrenia. Es posible elevar el KYNA endógena en el cerebro de roedor por tratar a los animales con la quinurenina bioprecursor directa y estudios preclínicos en ratas han demostrado que elevaciones agudas en KYNA pueden afectar sus procesos de aprendizaje y la memoria. El protocolo actual describe este acercamiento experimental en detalle y combina a) un análisis bioquímico del nivel de quinurenina y cerebro formación KYNA (utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento), b) comportamiento de prueba para probar la memoria contextual dependiente de hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y c) una evaluación de comportamiento de sueño y vigilia [grabaciones telemétricas combinar señales de electromiografía (EMG) y Electroencefalografía (EEG)] en ratas. Tomados en conjunto, se estudia una relación entre el elevado KYNA, sueño y cognición, y este protocolo describe en detalle un enfoque experimental para comprender los resultados de la función de elevación de la quinurenina y KYNA formación en vivo en ratas. Resultados obtenidos a través de las variaciones de este protocolo pondrá a prueba la hipótesis que el KP y KYNA sirven papeles fundamentales en la modulación de sueño y cognición en Estados de salud y enfermedad.
Introduction
El KP es responsable de degradar casi el 95% del aminoácido esencial triptófano1. En el cerebro mamífero, quinurenina en los astrocitos se metaboliza en la molécula pequeña neuroactivos KYNA principalmente por la enzima aminotransferasa (KAT) quinurenina II2. KYNA actúa como un antagonista en los receptores NMDA y α7nACh en el cerebro2,3,4, y también objetivos de señalización como el receptor de hidrocarburo de arilo (AHR) y la proteína G de receptores juntados receptor 35 (GPR35)5 ,6. En animales de experimentación, elevaciones en cerebro KYNA han demostrado para deteriorar su rendimiento cognitivo en una matriz de análisis conductual2,7,8,9,10 . Una hipótesis emergente sugiere que KYNA desempeña un papel integral en la modulación de las funciones cognitivas afectando sueño-vigilia comportamiento11, apoyando así aún más el papel de moléculas derivadas de astrositos en la modulación de la neurobiología del sueño y 12de la cognición.
Clínicamente, se han encontrado elevaciones en KYNA en líquido cefalorraquídeo y tejido fino del cerebro post mortem de pacientes con esquizofrenia13,14,15,16, un debilitante trastorno psiquiátrico caracterizado por debilitaciones cognoscitivas. Pacientes con esquizofrenia a menudo se ven afectados por trastornos del sueño que pueden exacerbar la enfermedad17. Entender el papel del metabolismo de KP y KYNA en la modulación de una relación entre el sueño y cognición, particularmente entre el aprendizaje y la memoria, puede conducir al desarrollo de nuevas terapias para el tratamiento de estos pobres resultados en la esquizofrenia y otros enfermedades psiquiátricas.
Un método confiable y consistente para la medición de metabolitos de KP es importante para garantizar que la investigación de distintas instituciones puede ser integrada en la comprensión científica de la biología de KP. En la actualidad, se describe la metodología para medir la quinurenina en plasma de rata y KYNA en el cerebro de la rata por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). El presente Protocolo, que hace uso de una detección fluorimétrica en presencia de Zn2 +, primero fue desarrollado por Shibata18 y más recientemente adaptado y optimizado para derivatize con acetato de zinc 500 mM como el reactivo de la columna, lo que permite la detección de endógeno, cantidad nanomolar de KYNA en el cerebro11.
Para estimular la producción endógena de KYNA de novo como se describe en el presente Protocolo, la quinurenina bioprecursor directa se inyecta por vía intraperitoneal (i.p.) en ratas. En combinación con evaluaciones bioquímicas para determinar el grado de producción de KYNA, los impactos de un quinurenina desafían la memoria dependiente del hipocampo (paradigma de evitación pasiva) y la arquitectura de sueño-vigilia (señales de EEG y EMG) es también investigar11. Una combinación de estas técnicas permite el estudio de los efectos bioquímicos y funcionales de un quinurenina reto en vivo en ratas.
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Protocol
Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal institucional de la Universidad de Maryland y siguieron a guía los institutos nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Nota: Se utilizaron ratas de Wistar macho adulto (250-350 g) en todos los experimentos. Distintas cohortes de animales fueron utilizados para el análisis bioquímico, experimentos conductuales y grabaciones de sueño-vigilia. Los animales fueron alojados en un centro de control de temperatura en el centro de investigación de Maryland psiquiátrico. Se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h, con luces momento de zeitgeber (ZT) 0 y apagar las luces a las 12 de la ZT. Los animales recibieron acceso ad libitum al alimento y al agua durante los experimentos. La instalación fue totalmente acreditada por la Asociación Americana para la acreditación de laboratorio Animal.
1. administración de quinurenina intraperitoneal a las ratas
Nota: En el presente Protocolo, quinurenina fue administrado en ZT 0 (el principio de la fase de luz) y tejido se recolectó en 2 ZT y ZT 4 determina un tiempo para el metabolismo de la quinurenina. Inyección de solución salina animales fueron utilizados como control. Por ejemplo, si una rata pesa 500 g y la dosis deseada es de 100 mg/kg, la rata debe recibir una inyección de 5 mL de una solución de 10 mg/mL de quinurenina.
- Pesar sulfato de L-quinurenina ("quinurenina") y lo coloca en un frasco de vidrio de 20 mL. Asegúrese de mantener la quinurenina en hielo en todo momento.
-
Añada solución salina para lograr la concentración deseada y ajustar el pH a 7,6 con 1 N de hidróxido de sodio (NaOH). Vórtice y someter a ultrasonidos la solución hasta que la quinurenina se disuelva completamente.
PRECAUCIÓN: Siga todas las precauciones de la recomendación durante la manipulación de NaOH.- Por ejemplo, para lograr una solución de 10 mg/mL, pesar 200 mg de quinurenina y colocar en un frasco de vidrio. Añadir 15 mL de solución salina y de vortex y someter a ultrasonidos (20 kHz para 5 – 10 s, 1/8 de pulgada de diámetro microtip) se disuelva. NaOH, ajustar el pH de la solución. Por último, utilizar una solución salina para ajustar el volumen a 20 mL.
- Pesan cada rata experimental y calcular el volumen de cada inyección basado en el peso del cuerpo del animal y la dosis de tratamiento deseado. Cuidadosamente retire el animal de su jaula casera, inyectar la solución por vía intraperitoneal y devolver el animal a su jaula.
2. quinurenina mediciones utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento
- Colección de tejido
Nota: En el presente Protocolo, quinurenina fue administrado en ZT 0 (el principio de la fase de luz) y tejido se recolectó en 2 ZT y ZT 4 determina un tiempo para el metabolismo de la quinurenina. Inyección de solución salina animales fueron utilizados como control.- Utilizar dióxido de carbono a la eutanasia del animal. Después de han cesado los signos de respiración durante 1 minuto, realizar un método de eutanasia secundaria por decapitación.
- Para recoger la sangre del tronco entero, colocar un embudo desechable en un tubo de 15 mL que contiene 20 μL de K3-EDTA (0.5 M). Permitir que la sangre en el tubo de drenaje del cuerpo. Invertir el tubo varias veces para asegurar el EDTA se mezcla todo.
- Con unas tijeras, cortadas la piel en la parte superior de la cabeza hacia abajo de la línea media para exponer el cráneo. Retire cualquier músculo de cuello exceso en la parte posterior del cráneo y, en la inauguración de la médula espinal, corte a través del cráneo de atrás hacia adelante.
- Suavemente Abra los dos lados del cráneo para exponer el cerebro y luego retire con cuidado el cerebro con pinzas para que no se dañe. Sacar los bulbos olfativos con una cuchilla de afeitar y cortar el cerebro por la mitad hacia abajo de la línea media. Con unas pinzas, diseccionar la hemibrain en las regiones de interés (es decir, el hipocampo y la corteza).
- Poner todos los pedazos de cerebro disecado en papel de aluminio en hielo seco. Después de que el tejido se ha congelado completamente, transferir a un frasco plástico de 20 mL y almacenar a-80 ° C.
- Centrifugar la sangre del tronco entero a 300 x g por 10 minutos retirar el sobrenadante (plasma) y transferir a tubos de centrífuga de nuevo antes del almacenamiento a-80 ° C.
- Preparación de la muestra
- Plasma: recogida de los animales tratados
- Descongelar lo congelado tubo con plasma (consulte el paso 2.1 para la colección de tejido) en hielo húmedo.
- En un nuevo tubo de centrífuga, diluir la muestra con agua ultrapura (1:2 para quinurenina, 1:10 para KYNA). A 100 μL de la muestra diluida, añadir 25 μL de ácido perclórico de 6%.
PRECAUCIÓN: Siga todas las precauciones de la recomendación durante la manipulación de ácido perclórico. - Vortex todas las muestras, les Centrifugue luego a 12.000 x g durante 10 minutos. Una vez terminado, retirar 100 μL del sobrenadante (cada tubo) y colocarlos en un tubo de microcentrífuga de pequeño 0.25 mL para la quinurenina o determinación de KYNA.
- Cerebro: recogida de los animales tratados
- Colocar los tubos con las muestras de cerebro congelado (ver paso 2.1 para la colección de tejido) en hielo seco. Pesar individualmente cada muestra de cerebro en una balanza analítica precisa. Volver al tubo y coloque en hielo seco.
- Después de todas las muestras han sido sopesadas, mover los tubos en hielo húmedo. Diluir cada muestra 1:10 p/v con agua ultrapura y homogeneizarlas utilizando un sonicador (20 kHz para 5 – 10 s, 1/8 de pulgada de diámetro microtip). Por ejemplo, para 100 mg de tejido cerebral, agregar 900 μL de agua ultrapura.
- Alícuota de 100 μL de cada uno diluidas de la muestra a un tubo nuevo y acidificar con 25 μL de ácido perclórico de 25%. Vórtice, entonces lo centrifugar a 12.000 x g durante 10 minutos.
- Después de la centrifugación, retirar 100 μL del sobrenadante y colocar en tubos de microcentrífuga de pequeño 0.25 mL para la determinación de KYNA.
- Plasma: recogida de los animales tratados
- Gestión y configuración HPLC
- Preparar la fase móvil del acetato de sodio 50 mM. Disolver 6,81 g de acetato de sodio trihidrato en 1 L de agua ultrapura. Ajustar el pH a 6.2 utilizando ácido acético glacial y luego vacío la filtro en material de vidrio limpio. Transferencia de la fase móvil de acetato de sodio a una limpia botella de vidrio de 1 L.
- Preparación de acetato de zinc y 500 mM. Disolver 54,88 g de acetato de zinc en 500 mL de agua ultrapura, entonces vacío filtrarla. Transferir a un frasco de vidrio limpio de 500 mL. Llenar una botella de 1 L con agua ultrapura y una botella de 500 mL con acetonitrilo de calidad CLAR.
- Coloque el tubo de entrada de la máquina HPLC por separado en la fase móvil, el agua ultrapuro y el 100% de acetonitrilo. Bomba de la solución de acetato de zinc por separado a través de una bomba peristáltica que combina con la columna posterior de la fase móvil y antes de la derivatización.
- Usando el panel de control en la máquina, programar para ejecutar 5% acetonitrilo y agua ultrapura de 95% a 0,5 mL/min permiten que funcione durante 20-30 min alcanzar una presión estable y línea de base.
- Al establecer una línea base estable, cambiar la composición de la solución al 5% acetonitrilo y fase móvil del acetato de sodio 95%. Equilibre durante 30 minutos.
- Encender la lámpara en el detector de fluorescencia y deje que se caliente.
- Mientras tanto, también encienda la bomba de la columna a un caudal de 0,1 mL/min permiten alcanzar una presión estable de aproximadamente 500 psi después de aproximadamente 20 minutos.
- Preparar los estándares.
- KYNA, comienzan con una solución stock de 1 mM y diluir para preparar 5 concentraciones estándar (es decir, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM 1 nM y 500 pM).
Nota: Esto producirá una curva estándar que van desde 200 fmoles 10 fmoles por inyección μL 20. - Quinurenina, comienzan con una solución stock de 1 mM y diluir para preparar 5 concentraciones estándar (es decir, 10 μM, 5 μM, 2.5 μM, 1 μM y 500 nM).
Nota: Esto producirá una curva estándar que van desde 200 pmoles a 10 pmoles por inyección μL 20.
- KYNA, comienzan con una solución stock de 1 mM y diluir para preparar 5 concentraciones estándar (es decir, 10 nM, 5 nM, 2.5 nM 1 nM y 500 pM).
- Configurar el software del sistema HPLC para controlar los parámetros de la secuencia de muestra y permitir la autoinjections de muestras múltiples.
- Cuando en la pantalla de "Muestra de ejecutar", haga clic en "Archivo" y arrastre hacia abajo a "Crear nueva muestra Set". Cuando se abre la nueva ventana, selecciona "Empty". Individualmente una lista de todas las normas (ver paso 2.3.8) o muestras en el orden que deben ejecutar.
- En la columna de "Función", señalan los estándares y las muestras. Las normas deben ensayarse al principio y al final de la secuencia. Inyectar agua entre cada 5 muestras.
- Establecer el tiempo de ejecución para cada muestra en 15 minutos inyectar 20 μL de la muestra de las normas y la preparación de plasma o inyectar 30 μL de la muestra de la preparación de homogeneizado de cerebro.
- Ajustar las longitudes de onda de excitación y emisión (dependiente en el compuesto evaluado) de quinurenina a excitación: 365 nm, emisión: 480 nm y el tiempo de retención: ~ 6 min y KYNA a excitación: 344 nm, emisión: 398 nm y el tiempo de retención: ~ 11 min.
- Una vez establecidos todos los parámetros y la máquina se ha equilibrado, ejecute la secuencia.
- Para cuantificar los datos, desplácese a la pantalla de "Project navegar". En la pestaña de "Conjuntos de muestra", haga doble clic en la muestra a cuantificar. En la lista de todas las inyecciones, resalte todas las normas y haga clic. En la nueva ventana, seleccione "Proceso" y, a continuación, utilice el menú desplegable para seleccionar "Calibrar y cuantificar" junto al "Cómo":.
- Destacar otra vez todas las normas, haga clic derecho y seleccionar "Examinar". Cuando los cromatogramas se abren, utilice los botones en la parte superior para "Integrar" y luego "calibrar" a cada estándar; Esto creará automáticamente la curva estándar.
- Volver a la ficha "Muestra fija" y haga doble clic en el conjunto de la muestra. A continuación, resalte todas las normas. Repita el proceso indicado arriba, pero en su lugar, seleccionando "Cuantificación" del menú desplegable. Destacar todas las muestras una vez más, luego haga clic derecho y seleccionar "Examinar". Cuando los cromatogramas se abren, utilice los botones en la parte superior para "Integrar" y luego "Cuantificar" cada uno muestra.
Nota: Esto producirá la concentración de cada muestra partiendo de la curva de estándar previamente creada.
3. paradigma de evitación pasiva
Nota: Estos experimentos conductuales fueron diseñados en base a nuestros hallazgos bioquímicos con el reto de quinurenina aguda. Para maximizar un aumento de cerebro KYNA, quinurenina (100 mg/kg) fue administrado en ZT 0, 2 h antes de la sesión de entrenamiento en el paradigma de evitación pasiva a prueba de aprendizaje mediada por el hipocampo, que se produjo en el ZT 2. El aparato consiste en 2 igual tamaños compartimentos (21,3 cm de alto, 20,3 cm de ancho y 15,9 cm de profundidad) separada por una puerta de guillotina y contenida dentro de una caja insonorizada. Los dos compartimientos del aparato de prueba se denominan "lado luminoso" y el "lado oscuro". Las paredes del lado luminoso son claras y, durante los ensayos, una luz enciende para iluminar más este compartimiento. Las paredes del compartimiento oscuro están completamente cubiertas para mantener una condición de negro.
-
1 día: ensayo de formación
- Antes de la prueba, limpie el aparato con etanol al 70%.
- Llevar los animales a la sala de pruebas.
- Suavemente Coloque el animal experimental en el lado luminoso de los aparatos y el cierre y cierre la puerta del aparato y la caja insonorizada.
- Utilizando el software asociado, iniciar el ensayo. En la pantalla principal, seleccione "Archivo" y luego "Abrir sesión" del menú desplegable. En la nueva ventana, asegurar que el correcto procedimiento y aparatos son seleccionados y haga clic en "Close". A continuación, seleccione "Configurar" y "Señales". En la nueva ventana, seleccionar el aparato correcto y haga clic en "Asunto".
Nota: El software iniciará una luz en el lado luminoso del aparato y abra la puerta de guillotina entre los dos compartimientos. Se iniciará un temporizador. - Cuando el animal entra totalmente en el lado oscuro del aparato, la cerrará la puerta guillotina y un choque inevitable de pie (0,56 mA 1 s) será entregado.
- Registrar el tiempo transcurrido antes de que el animal entró en el compartimiento oscuro.
- Después de que el animal ha recibido el choque, permiten 30 s de tiempo de recuperación antes de retirar al animal del aparato.
- Colocar la espalda del animal en su jaula casera.
- Antes de comenzar el ensayo con el siguiente animal, limpie el aparato con una toalla mojada y elimine cualquier pelotillas fecales.
- Después de todos los animales han sido entrenados, les devuelva al centro de animales.
-
Día 2: pruebas de ensayo
- Traer animales a la sala de prueba 24 h después del proceso de formación. Comenzar el ensayo de prueba para el primer animal colocándola en el lado luminoso del aparato, cierre y traba la puerta y la caja insonorizada.
- Iniciar el prueba ensayo utilizando los mismos comandos de software como el día anterior; la luz se enciende en el lado luminoso del aparato y se abrirá la puerta de guillotina entre los dos compartimientos. Se iniciará un temporizador.
- Cuando el animal entra en el compartimento oscuro, se cerrará la puerta de guillotina. Registrar el tiempo transcurrido.
Nota: El ensayo finalizará mediante el software después de un máximo de 300 s si el animal permanece en el lado luminoso de los aparatos de prueba. - Colocar la espalda del animal en su jaula casera y limpie el aparato (como se describe en el paso 3.1.9) antes de comenzar el ensayo con el siguiente animal.
4. Análisis de sueño
- Implantación quirúrgica de un transmisor inalámbrico de EEG/EMG
Nota: Los transmisores de telemetría deben ser esterilizados y preparados antes de la cirugía.- Usando una cuchilla de afeitar, retire con cuidado una pequeña longitud de recubrimiento plástico para revelar que el alambre conduce. Colocar los emisores en un tubo cónico de 50 mL con solución de esterilización [p. ej., Wavecide (2.65% glutaraldehído)].
- Deje los transmisores en la solución desinfectante durante al menos 12 h. Entonces, antes de la cirugía, transferir la solución a un contenedor de residuos. Enjuague el transmisor con solución salina estéril.
- En el día de la cirugía, peso del animal antes de ser colocado en una cámara de anestesia. Inducir a 3 – 5% isoflurano con 100% O2.
- Una anestesia exitosa, retirar el animal y cuidadosamente afeitado, use una afeitadora eléctrica, la parte superior de la cabeza y cuello, así como un pequeño parche de pelo en la parte posterior del cuerpo, ligeramente a la izquierda y por debajo de la caja torácica.
- Administrar carprofen (5 mg/kg) por vía subcutánea para analgesia postoperatoria.
- Coloque una almohadilla de calefacción agua caliente termostáticamente controlado establecido a 37 ° C en el animal para mantener la temperatura del cuerpo del animal durante la cirugía.
- En un marco estereotáxicas, coloque el animal en un cono de nariz para mantener el estado anestésico y colocar barras de oído para estabilizar la cabeza. Esterilizar la piel depilada por la alternancia de hisopos de betadine scrub y el 70% de etanol. Aplicar pomada de opthalamic en los ojos para lubricarlos.
- Para garantizar la adecuada anestesia antes de la primera incisión, utilice la prueba del pellizco del dedo del pie.
- Con un bisturí estéril, hacer una incisión de apenas detrás de los ojos hasta la parte posterior del cuello. El cráneo y el músculo del cuello cervical dorsal deben estar expuestas.
- Si es necesario para exponer el cráneo, use aplicadores con punta de algodón para quitar cualquier membranas. Micro-Bulldogs pueden utilizarse para mantener la piel del cráneo. Localice y marque la posición de la bregma. Taladro 2 agujeros de las rebabas e inserte los tornillos metal anterior 2,0 mm / + 1,5 mm lateral y 7,0 mm posterior /-1.5 mm laterales en relación con el bregma. Completadas 2 vueltas para apretar los tornillos. Cubre el cráneo expuesto con un trozo de Gasa.
- Usando tijeras quirúrgicas estériles, haga una incisión en la cavidad del cuerpo, justo debajo de las costillas.
- En la hoja quirúrgica, asegúrese de registrar el número de serie del transmisor para ser implantado.
- Inserte el transmisor estéril dentro de la cavidad del cuerpo. Los cables deben estar fuera del cuerpo.
- Usar suturas absorbibles para coser la pared muscular, asegurando que todos los cables están reunidos a un extremo de la incisión.
- Quitar la gasa de la cabeza y levanta la piel justo debajo de la incisión. Ejecutar un par de pinzas hemostáticas estériles largo debajo de la piel de la incisión principal para la incisión en el lado. Mantener la presión sobre la piel para reducir al mínimo cualquier lesión.
- Una vez que las pinzas hemostáticas son visibles cerca de la incisión del cuerpo, clip cualquier membrana que pueda cubrir con tijeras quirúrgicas y agarrar que el transmisor cuatro plomos con las pinzas hemostáticas. Lentamente extraer las pinzas hemostáticas, por lo que los cables ponen debajo de la piel y acumular en el cráneo.
- Señalar que 2 cables se conectarán a la calavera. Con unas pinzas, sujete el extremo de un alambre con una mano y justo debajo el extremo de la envoltura del plástico con el otro. Tire del cable hasta lazos individuales sólo se pueden hacer.
- Envuelva firmemente el alambre expuesto alrededor de uno de los tornillos de metal x 3 – 4. Una vez seguro, apriete el tornillo para evitar que el cable de desenredar y clip de cualquier cable adicional. Repetir este proceso con el segundo cable y tornillo.
- Tire de ambos conductores de EEG de la cavidad del cuerpo para que se sientan cómodamente contra el cráneo.
- Cemento dental del uso para cubrir los tornillos y cortical conduce, creando un tapón sobre el cráneo expuesto. Asegúrese de que ningún cemento dental se adhiere a la piel o músculo y que no hay bordes afilados son creados. Permita que el cemento dental secar.
Nota: La tapa debe ser lo suficientemente pequeña como para que la piel puede ser suturada sobre la parte superior. - Para los conductores de EMG, sostenga el extremo del alambre y envoltura plástica como se describe en el paso 4.1.15. Estire el alambre hasta que los lazos individuales son claramente discernibles.
- Ejecute una aguja de 22 G en el músculo del cuello en el lado derecho de 2 – 3 mm antes de permitir que surjan. Utilizando suturas no absorbibles, coloque una sutura simple, floja alrededor de la aguja incrustada.
- Enrosque el cable de la EMG en la aguja y tire de la aguja hacia fuera, permitiendo que el alambre EMG al hilo bajo el músculo. Apretar la sutura para asegurar el cable permanece en su lugar y clip extra de alambre puede surgir del músculo.
- Repita los pasos 4.1.20 y 4.1.21 el segundo plomo EMG, aproximadamente 1 mm abajo de la primera ventaja.
- Jale ambos conductores EMG de la cavidad del cuerpo para que se sientan cómodamente contra el músculo.
- Utilizar puntos de sutura no reabsorbibles para cerrar la incisión de cabeza y cuello. Meter todos los cables extra debajo de la piel del cuerpo y utilizar clips de herida para cerrar la incisión del cuerpo.
- Aplicar pomada de lidocaína a ambos sitios de incisión para ayudar a los animales con dolor postoperatorio.
- Devolver el animal a su jaula de casa, permitiendo que la jaula se siente en el cojín de calentamiento hasta que el animal se ha recuperado de la anestesia.
Nota: El animal debe recuperarse durante 7 – 10 días antes de comenzar las grabaciones.
- Usando una cuchilla de afeitar, retire con cuidado una pequeña longitud de recubrimiento plástico para revelar que el alambre conduce. Colocar los emisores en un tubo cónico de 50 mL con solución de esterilización [p. ej., Wavecide (2.65% glutaraldehído)].
- Grabación de EEG/EMG
Nota: En el presente Protocolo, administrar solución salina o quinurenina en ZT 0 y luego registran patrones de sueño-vigilia del animal durante 24 h.- Completa todas las grabaciones del sueño en un sitio designado donde los animales no se interrumpirá durante la duración de la grabación.
- Coloque la jaula casera del animal (teniendo el transmisor implantado de EEG/EMG) en una unidad receptora. Encienda el transmisor implantado quirúrgicamente usando un imán.
Nota: Debe aparecer una luz en la unidad de receptor cuando el transmisor está activado. - Configurar el registro de los datos de EEG/EMG utilizando el software asociado.
- Seleccione "Experimento" y "Crear" en el menú desplegable. Nombre del experimento y luego guardarlo. A continuación, seleccione "Hardware" y luego "Editar configuración de MX2".
- En la nueva ventana, seleccione todos los transmisores utilizados en el experimento e indicar que tecla receptora se empareja con. Cuando esté listo, inicie la grabación pulsando "Iniciar todo continuo".
- En la terminación de los experimentos, seleccione "Detener todo continuo" en el software asociado y apagar los transmisores con el imán.
- Eutanasia a los animales por CO2 asfixia seguida por una punción cardiaca. Retire con cuidado el transmisor por reabrir la incisión a lo largo de la parte superior de la cabeza con tijeras quirúrgicas y corte las puntas libres del músculo cemento y cuello dental.
- A continuación, abra la cavidad del cuerpo, ubique el transmisor y Extraiga lentamente del cuerpo.
- Análisis de EEG/EMG
- Utilice el software asociado para analizar los datos de sueño-vigilia. Abrir el programa y seleccionar "Agregar nueva ubicación". En la nueva ventana, seleccione los datos a importar en el software de calificación.
Nota: Esto creará un nuevo archivo en el software que contiene ondas crudas todos recogidos durante el experimento. - Marcar manualmente los Estados de vigilancia para los experimentos deseados. Después de anotar, analizar los parámetros como la duración total, el número de episodios y la duración promedio de combate de los diferentes Estados de vigilancia [movimiento de ojo rápido (REM), no - REM NREM y vigilia].
Nota: El análisis se realizó durante toda la grabación o acortado a momentos específicos de interés. Aquí, el análisis se realizó para el periodo de grabación 0 ZT ZT 2.
- Utilice el software asociado para analizar los datos de sueño-vigilia. Abrir el programa y seleccionar "Agregar nueva ubicación". En la nueva ventana, seleccione los datos a importar en el software de calificación.
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Representative Results
Para validar el uso de una inyección intraperitoneal de quinurenina como método para elevar el cerebro KYNA, se realizó un análisis HPLC de tejido. Curvas estándar (figura 1) fueron construidas usando el software asociado y permite la cuantificación de las muestras de tejido. Cromatogramas representativos de quinurenina y KYNA se presentan en la figura 2. Quinurenina se observó en un tiempo de retención de 6 min y KYNA tenía un tiempo de retención de 11 min. Para observar la dinámica de KP, se administró 100 mg/kg de quinurenina en este protocolo y tejido se recoge inmediatamente después de la inyección, o 2 o 4 h después de la inyección (figura 3a). Se cuantificaron quinurenina de plasma (figura 3b) y KYNA hipocampo (Figura 3C). Los parámetros específicos utilizados en la determinación del HPLC de quinurenina metabolitos se contornean en la tabla 1. La curva de dosis-respuesta producida por este protocolo es compatible con la descripción de una inyección de quinurenina aguda como forma de incrementar los niveles KYNA de cerebro, con un pico alcanzado después de la inyección 2 h y los niveles de KYNA regresado a su base 4 h después de la inyección.
Basado en los resultados bioquímicos antes mencionados, la formación en el paradigma de evitación pasiva se realizó 2 h después de la inyección de quinurenina (figura 4a). Se observó ninguna diferencia de grupo durante el proceso de formación (Figura 4b). Durante el juicio pruebas, los animales de control muestran un incremento significativo en latencia para entrar en el lado oscuro, indicando aprendizaje contextual. Animales inyectados con quinurenina el día anterior no se mostraban el mismo aumento en la latencia, que demuestra un déficit en el aprendizaje. Basado en estos resultados, podemos concluir que elevación aguda de la quinurenina, durante el tiempo de adquisición de memoria y consolidación, resulta en una reducción del rendimiento en una tarea mediada por el hipocampo.
Para investigar el impacto de una elevación de la quinurenina agudo durante la fase de luz en la arquitectura de sueño y vigilia, los animales fueron inyectados con solución salina el día 1 y quinurenina en el día 2 en ZT 0 (figura 5a). Las señales de EEG/EMG se registraron telemetrically para el período entero de 48 h. Se hicieron comparaciones entre la inyección de solución salina (vehículo) el día 1 y la inyección de quinurenina en día 2. Los resultados indicaron una reducción en la duración total del sueño REM (presentado como un cambio de porcentaje desde la línea de base) durante las primeras 2 h (figura 5b) después de una inyección. Esto se refleja por un aumento en la duración del despertar durante estos períodos de tiempo y una ligera reducción en el sueño NREM. Estos resultados demuestran que una elevación aguda de la quinurenina causa alteraciones en la dinámica de sueño-vigilia.
Figura 1: curvas estándar para una inyección de KYNA y quinurenina. 20 μl de cada norma se inyectó para crear la curva estándar de quinurenina (A) y (B) KYNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cromatogramas representativos de quinurenina y KYNA. Las normas fueron funcionadas antes una muestra para confirmar sus tiempos de retención. Estos paneles muestran las muestras representativas de quinurenina de suero (A) y (B) cerebro KYNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de suero y tejidos hipocampales por HPLC siguiendo un desafío de quinurenina. (A) quinurenina (100 mg/kg) o solución salina fueron administradas por inyección intraperitoneal en momento zeitgeber (ZT) 0. Los tejidos fueron recogidos después h 2 o 4 de la inyección. Los siguientes paneles muestran exposición a quinurenina de quinurenina elevada del suero (B) y (C) hippocampal KYNA niveles 2 h después de la inyección. P < 0.001 indica el significado por una doble vía análisis de varianza (ANOVA) seguido de Bonferroni t-corrección de la prueba. N = 4 – 5 por grupo. Todos los datos son medias ± SEM. Esta figura ha sido modificada de Pocivavsek et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: efecto de una elevación de la quinurenina en memoria dependiente del hipocampo en el paradigma de evitación pasiva. (A) quinurenina (100 mg/kg) o solución salina fueron administradas por inyección intraperitoneal en momento zeitgeber (ZT) 0. Los animales fueron entrenados en la tarea en el ZT 2. 24 h después de la capacitación, los animales fueron probados para la formación de la memoria. (B) una exposición de quinurenina antes el entrenamiento reduce la latencia para evitar el compartimiento oscuro aversivo en el día de la prueba. P < 0.01, *** P < 0.001 indican la importancia de una doble vía análisis de varianza (ANOVA) seguido de Bonferroni t-corrección de la prueba. N = 8 – 14 por grupo. Todos los datos son medias ± SEM. Esta figura ha sido modificada de Pocivavsek et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: efecto de una elevación de quinurenina en dormir-despiertan arquitectura. (A) solución salina (día 1) y quinurenina (100 mg/kg, día 2) fueron administradas por inyección intraperitoneal en momento zeitgeber (ZT) 0. El comportamiento de sueño-vigilia fue grabado para la posterior 24 h. (B) se redujo la duración del sueño de movimientos oculares rápidos (MOR) y la duración de la estela se incrementó en las primeras 2 h tras la inyección de la quinurenina. P < 0.05 indica el significado por una doble vía análisis de varianza (ANOVA) seguido de Bonferroni t-corrección de la prueba. N = 6 – 8 por grupo. Todos los datos son medias ± SEM. Esta figura ha sido modificada de Pocivavsek et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Composición de la fase móvil | acetato de sodio 50 mM pH 6.2 |
| 5% acetonitrilo | |
| Tasa de flujo de fase móvil | 0.5 mL/min. |
| Reactivo de derivatización post columna | acetato de zinc y 500 mM |
| Caudal de derivatización post columna | 0,1 ml/min |
| Tipo de columna | ReproSil Pur C18 |
| Dimensiones de la columna | 4 x 150 mm2 |
| Temperatura del detector | 4.0 ° C |
| Longitud de onda de quinurenina | Ej.: 365, Em: 480 |
| Tiempo de retención de quinurenina | ~ 6 min. |
| Longitud de onda KYNA | Ej.: 344, Em: 398 |
| Tiempo de retención KYNA | ~ 11 min. |
Tabla 1: Parámetros para una determinación del HPLC de metabolitos de vía quinurenina.
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Discussion
Para una evaluación confiable de KYNA en el cerebro después de una administración periférica de la quinurenina, es fundamental combinar e interpretar experimentos bioquímicos y funcionales. Aquí, presentamos un protocolo detallado que permite a los usuarios nuevos para establecer métodos eficaces para la medición de la quinurenina de plasma y el cerebro KYNA de ratas. La medición de la quinurenina en plasma confirma la inyección precisa y la medición del metabolito KYNA confirma la síntesis de novo en el cerebro. Hay varias ventajas el método fluorométrico HPLC descrito, adaptado de Shibata18, para derivatize de KYNA en presencia de Zn2 +, incluyendo la habilidad de detectar precisamente cantidades endógenas de KYNA en el cerebro en el rango nanomolar . Además, el método ha sido adaptado para detectar la quinurenina bioprecursor en el plasma en el rango micromolar ajustando el fluorométrico longitudes de onda de excitación y emisión, como se describe en el protocolo.
Pasos críticos en el protocolo, como momentos específicos entre el tratamiento y la eutanasia, se describen con precisión determinar el curso del tiempo de la formación de KYNA en el cerebro y guiar el diseño y análisis de la conducta y sueño-vigilia experimentos de controles. Aprendizaje mediado por el hipocampo se evaluó utilizando el paradigma de evitación pasiva y se realizó un análisis de sueño-vigilia con grabaciones telemétricas de datos EEG/EMG. Como se determinó que los niveles KYNA cerebro eran más alto 2 h posterior a la inyección, nos el tiempo de la sesión de entrenamiento del paradigma conductual en consecuencia, para que la adquisición en la tarea de evitación pasiva se produjo cuando los niveles KYNA eran más altos, en 2 ZT. Además, también enfocamos el análisis del comportamiento del sueño-vigilia en el ZT crítico 0 a ZT 2 marco de tiempo durante el cual los niveles KYNA fueron más elevados en el cerebro. Tomados en conjunto, el diseño experimental cuidadosamente considerado nos ha permitido cerrar juntos los resultados de experimentos bioquímicos y funcionales, introduciendo KYNA como modulador de la cognición y sueño-vigilia comportamiento11.
Debe considerar una serie de limitaciones en el protocolo descrito. Para estimular la producción endógena de KYNA, la quinurenina bioprecursor directa fue inyectado periféricamente en ratas. Quinurenina cruza fácilmente la barrera hematoencefálica y el metabolismo de KP estimulado ocurre en una variedad de regiones de cerebro2. Actualmente nos centramos en la elevación en KYNA astrositos deriva en el hipocampo; sin embargo, es importante considerar que las inyecciones sistémicas de quinurenina elevan también metabolitos de la rama neurotóxico del KP, 3-hydroxykynurenine (3-HK) y el ácido quinolínico. Para embromar aparte los efectos causados por las elevaciones en la 3-HK, en comparación con los causados por elevaciones de KYNA, la metodología debe ajustarse. Además, la perfuse elevación en el metabolismo de KP en todo el cerebro11 ofrece una visión limitada a las regiones específicas del cerebro que están mediando las alteraciones en el comportamiento.
Al diseñar el experimento conductual descrito aquí, hemos optimizado el paradigma de evitación pasiva con respecto a los métodos existentes, como se describe en detalle, a mediada por el hipocampo memoria contextual. Memoria está conformada por tres grandes subprocesos: codificación, consolidación y recuperación. Las condiciones óptimas para los procesos de consolidación de la memoria ocurren durante el sueño cuando recién codificada memoria se integra de19,de almacenamiento a largo plazo20. Estudios en roedores han enfocado windows estrecho tiempo de consolidación de la memoria e identificado esa memoria aparece más sensible al sueño se retrasa después de la adquisición, decidió elevar la quinurenina y formación de KYNA en el cerebro durante esta sensible ventana de tiempo, que afectan a la adquisición y la consolidación, para probar la hipótesis de este artículo. No, sin embargo, en la actualidad Probamos si la recuperación de la memoria fue impactada por elevaciones de quinurenina, como se muestra anteriormente21. Es muy importante también considerar las regiones del cerebro participadas en roedores para realizar una tarea. Mientras que para este estudio, fueron en su mayoría interesados en el papel del hipocampo en la modulación de la cognición, modificaciones en el protocolo pueden ser útiles en animales de prueba en paradigmas conductuales alternativos que han demostrado para ser afectado por una aguda quinurenina desafío, como el miedo acondicionado y trabajando en tareas de memoria2,7,8,9,10.
Además, en lugar de inyecciones sistémicas de quinurenina elevar el cerebro KYNA, estrategias alternativas a considerar incluyen la infusión directa de KYNA en un área de interés o la específica inhibición de la enzima sintetizadora KAT II por farmacológicas herramientas o aproximaciones moleculares de la precipitación en regiones específicas del cerebro, para probar las hipótesis mecanicistas. Estos enfoques también pueden introducir procedimientos potencialmente invasoras que afectan a los resultados funcionales medidos independientemente, pero es importante para el diseño de experimentos con condiciones de control óptimo.
Por último, el sueño protocolo de EEG/EMG que se describe aquí la grabación tiene la ventaja de ser telemétrica más que atado, eliminando el riesgo de lesiones en un animal que ha tirado los cables tethered, ruido eléctrico y artefactos de movimiento. El tamaño físico y peso ligero de la telemétrico y su colocación por vía subcutánea en lugar de por vía intraperitoneal en ratas para optimizar la recuperación post quirúrgica, permite grabaciones inalámbricas que capturan el comportamiento de sueño-vigilia naturalista con un libre rango de movimiento. Sin embargo, una consideración importante cuando se utiliza el sistema telemétrico es la limitada capacidad para la grabación de canales múltiples simultáneos. El paradigma actual pares un canal de EEG y un canal de EMG y permite la puntuación de REM, NREM y vigilia comportamiento.
La combinación de métodos descritos en la actualidad proporciona la penetración en ensayos de comportamiento y bioquímicos para aclarar los resultados funcionales de una elevación de la quinurenina. Estos protocolos demuestran una relación entre la KP, la cognición y el sueño, una dinámica previamente inexplorada. Utilizando los métodos experimentales detallados aquí mejorará la comprensión científica de los efectos funcionales de quinurenina y Neurobiología KYNA en animales. En última instancia, la labor continuada en este campo puede conducir a nuevos enfoques terapéuticos para aliviar los resultados en individuos combatir disturbios psiquiátricos y trastornos en el sueño.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El presente estudio fue financiado en parte por los institutos nacionales de salud (R01 NS102209) y una donación de la Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D) |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
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