Summary
För att testa de hämmande effekterna av farmakologiska agenter på fosfolipas C (PLC) i olika regioner av honungsbinas hjärnan, presenterar vi en biokemisk analys för att mäta PLC verksamhet i dessa regioner. Denna analys kan vara användbara för att jämföra PLC aktivitet hos vävnader, liksom hos bina uppvisar olika beteenden.
Abstract
Honungsbiet är en modellorganism för utvärdering av komplexa beteenden och högre hjärnfunktion, såsom lärande, minne och arbetsfördelning. Svamp kroppen (MB) är ett högre hjärnans centrum föreslås bli neurala underlaget av komplexa honungsbinas beteenden. Även om tidigare studier identifierat gener och proteiner som uttrycks differentially i MBs och andra regioner i hjärnan, är verksamhet av proteiner i varje region ännu inte helt förstått. För att avslöja funktionerna av dessa proteiner i hjärnan, farmakologiska analys är en genomförbar strategi, men det är först nödvändigt att bekräfta att farmakologiska manipulationer verkligen förändra proteinaktiviteten i dessa regioner av hjärnan.
Vi tidigare identifierat ett högre uttryck av gener som kodar fosfolipas C (PLC) i MBSNA än i andra regioner av hjärnan och bedömas farmakologiskt PLC engagemang i honungsbinas beteende. I den studien vi biokemiskt testat två farmakologiska agenter och bekräftade att de minskade PLC aktivitet i MBs och andra regioner i hjärnan. Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av hur man upptäcker PLC aktivitet i Honungsbinas hjärna Homogenatet. I detta test system, homogenates härrör från olika hjärnregioner är reagerade med ett syntetiskt fluorogenic substrat och fluorescens följd PLC aktivitet är kvantifierade och jämfört mellan regioner i hjärnan. Vi beskriver också våra utvärdering av de hämmande effekterna av vissa läkemedel på PLC aktivitet använder samma system. Även om detta system sannolikt påverkas av andra endogena fluorescens föreningar eller absorbansen assay komponenter och vävnader, mätning av PLC aktivitet med detta system är säkrare och enklare än att använda traditionella analysen, som kräver radiomärkt substrat. Det enkla förfarandet och manipulationer tillåter oss att undersöka PLC aktivitet i hjärnan och andra vävnader av honungsbin inblandade i olika sociala aktiviteter.
Introduction
Europeiska honungsbiet (Apis mellifera L.) är en eusociala insekter och kvinnliga bin Visa kast-beroende reproduktion och åldersberoende arbetsfördelning. Till exempel i sterila kasten av bin som kallas 'arbetare', föda yngre individer barnaskaror medan äldre födosöker nektar och pollen utanför kupan1. Inlärning och minne förmåga är kritiskt viktigt i livet av honungsbiet, eftersom halvöknar måste upprepade gånger gå fram och tillbaka mellan födokällor och boet och sedan kommunicera platserna för bra matkällor till deras nestmates genom Dans meddelande1. Tidigare studier har visat att MB, en högre hjärnan center i insekter, är inblandade i inlärning och minne förmåga av honungsbinas2,3,4. Differentiellt uttryckta gener och proteiner identifierats i olika hjärnregioner av honungsbinas5,6,7,8,9,10 ,11, vilket tyder på att de är relaterade till de unika funktionerna i varje hjärna region. Men farmakologisk hämning eller aktivering av ett protein av intresse är ett väl använt tillvägagångssätt att avslöja funktionen av proteinet i honungsbinas beteende12,13,14, är det okänt huruvida alla droger har funktionella effekter i olika regioner av honungsbinas hjärnan. Validering av fungerar av sådana droger stärker slutsatserna i studierna av beteendemässiga farmakologi.
Här fokuserar vi på PLC, en av de enzymer som är inblandade i mus kognition15,16,17,18. PLC utlöser calcium signalering av förnedrande fosfatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) till inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) och diglyceridolja (DAG)19,20,21. IP3 öppnar IP3 receptorer på endoplasmatiska retiklet (ER), leder till utsläpp av kalciumjoner från ER. Släppta kalcium aktiverar både kalcium/calmodulin-beroende proteinkinas II (Chytridiomycota) med calmodulin och proteinkinas C (PKC) i närvaro av DAG. Båda proteinkinaser är inblandade i inlärning och minne22,23, konsekvent med PLC deltagande i denna process. Aktiebolagen kategoriseras in i subtyper, inklusive PLCβ, PLCγ och PLCε, baserat på deras strukturer20. Varje PLC undertyp aktiveras i ett annat sammanhang20, och gener som kodar för dessa subtyper är Differentiellt uttryckta i olika vävnader. Vi har tidigare visat att honungsbinas MBs express gener som kodar för PLCβ och PLCε undertyper på högre nivåer än de återstående hjärna regioner24och att två pan-PLC-hämmare (edelfosine och neomycin sulfat [neomycin]) minska PLC aktiviteten i olika regioner av hjärnan och, faktiskt påverkar inlärning och minne på honungsbinas24.
Traditionellt, har den enzymatiska aktiviteten av PLC mätts med hjälp av radioaktivt märkt PIP225, vilket kräver lämplig utbildning, utrustning och faciliteter. Syntetiska fluorogenic substrat till PLC har nyligen varit etablerade26, vilket gör det enkelt att bedöma PLC aktivitet i standard laboratorium. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll att upptäcka PLC aktivitet i olika hjärnregioner av honungsbiet använder fluorogenic substratet och därefter testa de hämmande effekterna av edelfosine och neomycin på PLC i dessa vävnader. Eftersom protokollet kräver endast grundläggande manipulationer, kan det gälla studier av PLC aktivitet i andra vävnader eller hjärnområden i bina fördelas till olika sociala aktiviteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fånga av födosök honungsbin
- Köp honungsbinas kolonier från en lokal återförsäljare.
- Använda en insekt nätet, fånga forager bin som tillbaka till kupan med pollen påsar på sina bakben. Överföra bina till en standard 50 mL koniskt plaströr och locket röret (figur 1). Placera röret på is att söva bina.
Observera: Bära de utsedda jackorna för biodling att undvika bistick. Omvårdnad bin kan också samlas beroende på experimentet. Att fånga sjuksköterska bin, Observera biets beteende på vax kammen och fånga sjuksköterska bin, som Petar sina huvuden i kullen celler att mata larverna, av vingen eller bröstkorgen med hjälp av pincett. Placera sedan, bina i ett 50 mL plaströr, cap röret och lägga den på is som nämns i steg 1.2. - Fånga 12 halvöknar slumpmässigt.
Obs: Detta protokoll använder två bin per parti, vilket resulterar i sex massor. Flera bin kan fångas i en tub, och numrera av bina i ett enda rör är inte viktigt, eftersom bina i varje parti kombineras senare (se steg 3.1.1). Hålla röret sval på sommaren, eftersom den höga temperaturen i röret skadar bina.
2. dissektion av honungsbinas hjärnan
- I laboratoriet, placera 50 mL röret på is för minst 30 min6 att söva bina.
- För att förbereda dissektion scenen, vik en bit av dentalvax i hälften (Razmer är ca 3,5 x 7,5 cm) och tryck in det i en plast skål (60 x 15 mm).
Obs: Vikta vaxet ordentligt rymmer insekt stiften. - Under ett binokulärt Mikroskop, separat biets huvudet från dess kropp med pincett och fixa det på dental vaxet genom att infoga insekt stift vid basen av varje antenn till hålla den främre av huvudet i en uppåtgående position (figur 2A).
Obs: Tvätta pincetten före användning, med etanol eller steriliserat vatten. - Häll tillräckligt saltlösning (0.13 mol/L NaCl, 5 mmol/L KCl och 1 mmol/L CaCl2-2 H2O) på huvudet för att täcka den. Hål i huvudet igen med stiften om huvudet svävar i lösningen. Använd en iskall saltlösning, om nödvändigt.
Obs: Detta protokoll fungerar dock utan den kalla saltlösning. - Ta bort antenner med pincett (figur 2B).
- Göra ett horisontellt snitt nära baserna antenner och längsled vid gränsen av sammansatta ögon, med en skalpell. Gör därefter ett horisontellt snitt på toppen av huvudet. Ta bort nagelbanden för att öppna ett fönster över hjärnan (figur 2C).
Obs: Om det behövs tvätta skalpell med etanol eller steriliserat vatten före användning. - Ta bort retinae från vingribborna och luftstrupar på den främre ytan av hjärnan, med hjälp av pincett (figur 2D).
- Expandera snittet på gränsa av fasettögon dorsalt och ventralt, med hjälp av skalpell (figur 2E). Nästa, ta bort bindväven mellan nagelbanden förening ögon och retinae genom att infoga pincetten direkt under ögat nagelbanden (figur 2F).
- Kassera nagelbanden förening ögon. Plocka de dorsala tips av retinae förening ögon med pincett och flytta pincetten i ventrala riktning noggrant lossnar retinae (figur 2G).
- Ta försiktigt bort de återstående luftstrupar på den främre ytan av hjärnan, med hjälp av pincett (figur 2H).
- Skär bindväv mellan hjärnan och runt vävnader, med pincett, och dissekerar hjärnan från huvudet kapseln (figur 2H).
- Lossna luftstrupar på den bakre ytan av hjärnan, med hjälp av pincetten (figur 2jag).
- Med en skalpell skära anslutningen mellan MBs och andra regioner i hjärnan bredvid de vertikala lober, som är en del av MBSNA (figur 2J).
- Plats de dissekerade MBs och återstående hjärnans vävnader i 1,5 mL rör och snabbt frysa dem med torr-is eller flytande kväve (figur 2K). Förvaras frysta vävnader vid-80 ° C fram till användning.
Obs: Hanterar flytande kväve med utsedda handskar och ventilation för att undvika kalla burn och kvävning. Torr-is bör också behandlas varsamt med handskar. Protokollet kan pausas här. Dissektion och lagring av hjärnans vävnader bör utföras en bee samtidigt för att undvika proteinnedbrytning.
3. beredning av hjärnan Homogenates
- Tillsätt 10 µL av homogenisering buffert bestående av 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl och 1,0 mmol/L CaCl2 till de frusna hjärnvävnad och homogenisera vävnaden i 1,5 mL röret genom att manuellt sätta press med en plast mortelstöt. Stroke i vävnaden minst 200 x.
Obs: Utföra de manipulationer som beskrivs i avsnitt 3 på is. Använd en mortel passande just i röret att tillräckligt krossa vävnader, som enkelt flyta omkring i den homogenisering buffert.- Överför homogeniserad vävnad lösningen i nästa vävnad i partiet och homogenisera vävnaden på samma sätt.
Obs: Honungsbin i varje parti kombineras i detta steg. Detta protokoll använder sex massor.
- Överför homogeniserad vävnad lösningen i nästa vävnad i partiet och homogenisera vävnaden på samma sätt.
- Tillsätt 30 µL av den homogenisering buffert.
- Centrifugera provet homogeniserad vävnad i 10 min på cirka 900 x g27 och 4 ° C.
- Överför supernatanten till en ny 1,5 mL tub och centrifugera det igen i 20 min på ca 9 500 x g27 och 4 ° C.
- Placera supernatanten i en ny 1,5 mL tub. Lagra Homogenatet vid-20 ° C fram till användning.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Bestämma proteinkoncentration med bicinchoninic syra (BCA) analys.
- Späd 2,5 µL av Homogenatet med 17,5 µL av steriliserat vatten (således späda Homogenatet åttafaldig) och använda alla utspädda Homogenatet.
Obs: Provtagning Homogenatet med hjälp av en mikropipett måste utföras noggrant på grund av dess höga viskositet. - Utföra BCA analysen med 0, 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 och 2,0 mg/mL bovint serumalbumin (BSA) i 20 µL som standarder.
Obs: Ändra omfattningen av BCA analysen som behövs baserat på volymen av Homogenatet och standardproven. Protokollet kan pausas här.
- Späd 2,5 µL av Homogenatet med 17,5 µL av steriliserat vatten (således späda Homogenatet åttafaldig) och använda alla utspädda Homogenatet.
4. PLC reaktion i hjärnan Homogenates
- Förbereda stamlösning av fluorogenic substrat WH-1526 upplöst i steriliserat vatten på 50 µmol/L och förvara den vid-80 ° C.
Obs: Täcka de lösningar som innehåller underlaget med folie för att förhindra blekning. - Förbereda reaktion förblandningen i volymen som krävs för att uppnå följande sammansättning i 10 µL av reaktionsblandningen: 50 mmol/L HEPES-KOH (pH 7,2), 70 mmol/L KCl, 1,0 mmol/L CaCl2, 2,0 mmol/L Ditiotreitol, 50 mg/L BSA och 12,5 µmol/L WH-15.
- Späd blandningen med homogenisering buffert, om det behövs.
- Blanda reaktion förblandningen och Homogenatet innehållande 1,3 µg av proteiner i ett polymeras-kedjereaktion (PCR) rör för att uppnå en slutlig volym av 10 µL av reaktionsblandningen.
- Förbered två typer av kontroll blandningar för den statistiska analysen: sätta Homogenatet men inte WH-15 i blandning (kontroll blandning 1), och vice versa (kontroll blandning 2).
Obs: Förbered reaktion blandningar och kontroll blandningar på is att förhindra proteinnedbrytning och reaktion av PLC. Kontroll blandningar 1 och 2 används för att upptäcka fluorescens från Homogenatet och gratis substrat, respektive.
- Förbered två typer av kontroll blandningar för den statistiska analysen: sätta Homogenatet men inte WH-15 i blandning (kontroll blandning 1), och vice versa (kontroll blandning 2).
- Skölj röret och inkubera det i en termocykel för 30 min vid 25 ° C.
- Stoppa reaktionen genom att lägga till 2 µL 25 mmol/L etylenglykol bis (β-aminoethylether)-N, N, N', N'-tetraacetic acid.
Obs: Lämpliga protein belopp och reaktionstider variera bland experiment. Således, för att optimera villkoret reaktion, det kan vara nödvändigt att upprepa procedurerna som beskrivs i steg 4.1-5.3 i de preliminära experiment genom att ändra protein belopp och inkubation tiden tills fluorescensen ökar linjärt. För referens, när Homogenatet härrör från de andra hjärnan används, reaktionen fungerar oftast linjärt med 1,3 µg eller mindre av proteiner inom 30 min, men linearitet minskar med minst 2,7 µg av proteiner eller med en inkubationstid av 90 min eller lo nger.
5. detektion av fluorescens följd PLC aktivitet
- Centrifugera de reaktionsblandningen och kontroll blandningar för 5 min på ca 310 x g28 och överföra 10 µL av supernatanten till olika brunnar på en 384-väl mikroplattan tillämpliga för fluorescens upptäckt.
Obs: För att förhindra blekning och en förorening med damm, täck plåten med folie. - Spola mikroplattan med en centrifug för mikroplattan.
- Ställa in plattan i en microplate reader och upptäcka fluorescens med en teknisk tre exemplar.
Obs: Excitation och utsläpp våglängder är 344 nm och 530 nm, respektive. Om tillämpligt (beroende på mikroplattan läsaren), blanda provet blandningar för 5 s före varje upptäckt. Protokollet kan stoppas här.
6. test av den hämmande effekten av farmakologiska agenter
- Förbereda stamlösningar av edelfosine och neomycin på de lämpliga koncentrationerna och lagrar dem tills användning: edelfosine på 5,0 mmol/L och -20 ° C; neomycin på 550 mmol/L och 4 ° C.
- När du förbereder reaktion förblandningen som beskrivs i steg 4.2., lägga till hämmare i förblandningen att uppnå de lämpliga slutliga koncentrationerna: edelfosine, 1,0 mmol/L; neomycin, 0,55 mmol/L.
- Lägga till Homogenatet reaktion förblandning och lämplig kontroll blandningar som i steg 4,4.
- Förbered tre typer av kontroll blandningar: sätta Homogenatet och hämmare, men inte substratet i kontroll blandning 1; Tillsätt substrat och hämmare men inte Homogenatet i kontroll blandning 2; och sätta den-hämmaren, men inte Homogenatet eller substrat i kontroll blandning 3.
- Utför PLC reaktion och detektion av fluorescens som beskrivs i steg 4,5-5.3.
7. statistisk analys
- För detektion av PLC aktivitet med hjälp av de blandningar som beskrivs i avsnitt 4, beräkna fluorescensen härrör från reaktionen mellan PLC och substratet genom att subtrahera den fluorescens som avges från Homogenatet eller gratis substrat som följer.
Fl (PLC aktivitet) = Fl (reaktionsblandning) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)}
Obs: Fl (PLC aktivitet), Fl (reaktionsblandning), Fl (ctrl 1) och Fl (ctrl 2) betecknar bona fide fluorescens härrör från PLC verksamhet, fluorescens upptäckts i reaktionsblandningen och kontroll blandningar 1 och 2, respektive.- Efter mätning av fluorescens i blandningar enligt beskrivningen i steg 4.1-5.3, beräkna Fl (PLC aktivitet) enligt ekvationen i steg 7,1 och sedan medelvärdet Fl (PLC aktivitet) av de tekniska tre exemplar för varje Homogenatet.
- Använder den genomsnittliga Fl (PLC aktivitet) av de tekniska tre exemplar erhållits i steg 7.1.1, beräkna igen menar Fl (PLC aktivitet) av biologiska replikat av MBSNA och andra regioner i hjärnan och jämföra värden mellan hjärnans vävnader.
- För granskning av PLC aktivitet i närvaro av inhibitorer med hjälp av de blandningar som beskrivs i avsnitt 6, beräkna fluorescensen härrör från reaktionen bland Homogenatet, substrat och hämmare enligt följande.
Fl (PLC aktivitet med hämmare) = Fl (reaktionsblandning) - {Fl (ctrl 1) + Fl (ctrl 2)} + Fl (ctrl 3)
Obs: Här Fl (PLC aktivitet med hämmare) är bona fide fluorescens följd PLC aktivitet i närvaro av hämmaren. Fl (reaktionsblandning), Fl (ctrl 1), Fl (ctrl 2) och Fl (ctrl 3) är fluorescens signaler detekteras i reaktionsblandningen, kontroll blandning 1, styra blandning 2 och kontroll blandning 3, respektive.- Efter mätning av fluorescens i blandningar enligt beskrivningen i steg 6.1-6.4, beräkna Fl (PLC aktivitet med hämmare) enligt ekvation i steg 7,2. Sedan få den genomsnittliga Fl (PLC aktivitet med hämmare) av de tekniska tre exemplar för varje Homogenatet.
- Med hjälp av medelvärdet beräknades i steg 7.2.1, beräkna medelvärdet Fl (PLC aktivitet med hämmare) av biologiska replikat härrör från varje hjärnvävnad. Jämföra Fl (PLC aktivitet med hämmare) och Fl (PLC aktivitet) erhölls i steg 7.1.2 i varje hjärnvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein koncentrationer i hjärnan Homogenates:
Vi förberett homogenates använder forager bin. De beräkna protein koncentrationerna i den ursprungliga homogenates visas i figur 3. Ungefärliga protein koncentrationerna i ursprungliga Homogenatet var följande: 1,5 mg/mL i MBs och 2,3 mg/mL i andra regioner av hjärnan. Vi använde två bin per parti och sex massor analyserades.
Påvisande av PLC aktivitet i den hjärnan Homogenates:
I pilot experimentet upptäckt vi högre fluorescens i andra regioner av hjärnan än i MBs. Därför vi upprepade de preliminära experiment med hjälp av Homogenatet andra hjärnan regioner och bestämt reaktionstid (dvs, 30 min) och protein belopp (dvs., 1,3 µg). Resultatet av reaktionen under dessa villkor visas i figur 4A. De reaktion blandningar som innehåller både vävnad Homogenatet och fluorogenic substrat uppvisade > 4.2-fold högre fluorescens än de kontroll blandningar innehållande antingen vävnad Homogenatet eller fluorogenic substratet, vilket tyder på att PLC aktivitet var upptäckts i reaktion blandningar. Relativa fluorescens var ca 3.4-fold högre i andra regioner av hjärnan än i MBSNA (figur 4B).
Analys av de hämmande effekterna av farmakologiska agenter på PLC aktivitet:
För att undersöka effekterna av den pan-PLC-hämmare edelfosine och neomycin på PLC aktivitet, utfört vi reaktionen i närvaro av 1,0 mmol/L edelfosine eller 0,55 mmol/L neomycin, med samma Homogenatet som analyseras ovan. I närvaro av edelfosine, fluorescens sjönk ca 6,0% och 5,4% i MBs och andra regioner i hjärnan, respektive, jämfört med kontroller utan edelfosine (figur 4C). Neomycin behandling minskade nivån fluorescens till 44% och 20% som av obehandlade kontroller i MBs och andra regioner i hjärnan, respektive (figur 4D).
Figur 1 : Att fånga ett forager honungsbi. En forager återvänder till hennes hive fångades i en insekt netto, och hon var begränsad till en 50 mL konisk plaströr. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematisk representation av förfarandet dissektion. (A) axlar av honungsbinas hjärnan nämns i protokollet visas. Biet från huvudet till främre bröstkorgen ses från den laterala sidan. (B - K) Foton och illustrationer av dissektion procedurer visas. Se huvudtexten för detaljer. Endast huvudet av honungsbiet presenteras. En illustration av luftstrupar utelämnas. MBs = svamp organ. Skala staplarna motsvarar till 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Protein koncentrationer i hjärnan vävnad homogenates. Protein koncentrationer i den ursprungliga homogenates mättes med BCA assay och beräknas. De genomsnittliga koncentrationerna med standardavvikelser visas. Två forager bin användes för varje parti, och sex massor analyserades. MBs = svamp organ. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Fluorescens upptäcks i reaktioner. (A) denna panel visar fluorescens i varje vävnad med eller utan fluorogenic substrat. Reaktionen utfördes i 30 min med 1,3 µg av protein. Fluorescens mättes av mikroplattan läsaren. Värdena för prov brunnarna var rättad genom tomma brunnar och visas i godtyckliga enheter (AUs). (B) denna panel visar en jämförelse av fluorescens mellan hjärnans vävnader. Data i sidopanelen A var korrigerat för kontroll blandningar av subtraktion och normaliserade av den beräkna fluorescensen i den MBs. * P < 0,005, Mann-Whitneys U-test. Paneler C och D visar relativa fluorescens i närvaro av (C) 1,0 mmol/L edelfosine och (D) 0,55 mmol/L neomycin. De samma homogenates som används i paneler A och B analyserades. Fluorescens värdena var normaliserade resultaten av kontrollen experimentet utan läkemedelsbehandling för varje vävnad. Datan av kontroll reaktionerna i panel C är samma som panel B. I panelen Danalyserades alla homogenates igen i ett annat experiment. Genomsnittliga fluorescens värden med standardavvikelser visas. Två bin användes för varje parti, och sex massor analyserades. P < 0,05, Wilcoxon undertecknat-leden test. Ingen Hg = kontroll blandning som inte innehåller Homogenatet; MBs = svamp organ. Paneler B - D ändrades från Suenami et al. 24 med utgivarens tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biokemisk undersökning av proteinaktiviteten är djupt viktigt för att förstå molekylär signalering i hjärnan, eftersom aktiviteten hos ett enzym påverkas av olika molekyler, som substrat och hämmare, och kan således ändra längs med djurs beteende (t.ex., inlärning och minne)5. I honungsbinas studier redovisas enzymer såsom cykliskt AMP-beroende proteinkinas A, cykliskt GMP-beroende proteinkinas, PKC, fosforylerade Chytridiomycota och adenylatcyklas differentially uttrycks i olika hjärnregioner baserat på immunohistokemi5,10,29,30,31. Skillnader i enzymatisk aktivitet bland hjärnregioner, är dock bara delvis rapporterade6. Här, beskrivit vi ett detaljerat protokoll för att upptäcka PLC aktivitet och bedömer de hämmande effekterna av farmakologiska agenter i MBs och andra regioner i hjärnan.
Det finns några möjliga faktorer som stör fluorescens upptäckt. Först, är det viktigt att skydda proteinet från nedbrytning när du utför biokemiska analyser. I protokollet som beskrivs här, krävs en snabb dissektion och frysning av hjärnan. Det rekommenderas att vävnadsprover är fryst och lagrad snart efter varje cykel av dissektion. En minimering av blidvädret/frysa cykeln av Homogenatet är också avgörande att förebygga en försämring av protein.
Förutom proteinnedbrytning, kan bakgrunden fluorescens och absorbansen i reaktionsblandningen påverka resultaten i detta test system, eftersom PLC aktivitet upptäcks av en fluorescens-signal. Neomycin upplöst i vatten har exempelvis en gul färg som påverkar fluorescensen upptäckt. Även om vi använde 0,55 mmol/L neomycin, en 1000-fold utspädning av stamlösning, krävas en ytterligare optimering av koncentrationen. Dessutom kan förorenas av andra vävnader också påverka resultatet. Näthinnan, som upptäcker visuella stimuli och innehåller pigment, består av en vävnadstyp som potentiellt stör analysen.
Med detta protokoll upptäckte vi högre PLC aktivitet i andra regioner av hjärnan än i MBs24. Detta var inte överensstämmer med resultatet av kvantitativa omvänd-Transkription PCR-analys, som avslöjade att MBSNA express högre nivåer av PLC gener än andra hjärnans vävnader24. Denna motsägelse kan bero på WH-15, som är en fritt flytande substrat26, och det faktum att vi inte skillnad membranet och cytosoliska fraktioner av den hjärnan homogenates. Med tanke på att PLCβ och PLCε är membran-associerade enzymer32 och kan interagera med den endogena PIP2 substraten, påverkar mängden den membran-fraktionen i Homogenatet sannolikt reaktionen mellan PLC och WH-15. En annan möjlig förklaring är att PLC koncentrationen kan vara högre i de andra hjärnan än i MBSNA på grund av skillnaderna i protein produktion och/eller nedbrytningsprodukter. Därav, bona fide PLC aktivitet i hjärnan måste klargöras ytterligare av ytterligare experiment, såsom med hjälp av ett nyligen rapporterat nya substrat införlivas de membran33, analysera aktiviteten av membran-associerade och cytosoliska Aktiebolagen separat, eller kvantifiera innehållet PLC eller PIP2 i varje hjärnvävnad.
Hänsyn till ovanstående punkter, kan PLC assay systemet beskrivs här utökas för att mäta PLC aktivitet i olika vävnader inte bedömts här, såsom mag-tarmkanalen, muskel och reproduktiva organ. Det är också möjligt att jämföra PLC aktivitet mellan forager hjärnor och sjuksköterska bin att utvärdera medverkan av PLC aktivitet i olika sociala roller.
Sammantaget är assay systemet presenteras här ett genomförbart alternativ för att upptäcka PLC aktivitet i vävnad homogenates, eftersom den kan utföras med vanlig laboratorieutrustning, medan en traditionell metod som använder radiomärkt PIP2 kräver specialiserade Faciliteter, utbildning och utrustning för radioisotoper. Dra nytta av systemet med ytterligare ändringar kommer att fördjupa vår förståelse av de molekylära mekanismerna bakom honungsbinas komplex beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Figur 4B - 4 D ändrades från Suenami et al. 24 med tillstånd av biologi öppen. Författarna är tacksam till förlaget för behörigheten. Detta arbete stöds av Human Frontier Science programmet (RGY0077/2016) att Shota Suenami och Ryo Miyazaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
References
- Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3 (2008).
- Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
- Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
- Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
- Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
- Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408 (2009).
- Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213 (2010).
- Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732 (2013).
- Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
- Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841 (2016).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
- Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
- Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
- Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
- Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986 (2015).
- Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
- Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
- Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
- Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
- Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
- Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
- Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
- Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
- Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
- Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
- Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
- Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
- Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
- Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
- Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).
