Articolo metodologico

Fissazione polmonare sotto pressione costante per la valutazione dell'enfisema nei topi

DOI:

10.3791/58197

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26 settembre 2019

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1Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Pharmaceutical Planning Group, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

In questo articolo

Sommario

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Presentato qui è un protocollo utile per la fissazione polmonare che crea una condizione stabile per la valutazione istologica di campioni polmonari da un modello murino di enfisema. Il vantaggio principale di questo modello è che può fissare molti polmoni con la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione.

Abstract

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L'enfisema è una caratteristica significativa della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Gli studi che coinvolgono un modello murino enfisematoso richiedono una fissazione polmonare ottimale per produrre campioni istologici affidabili del polmone. A causa della natura della composizione strutturale del polmone, che consiste in gran parte di aria e tessuto, c'è il rischio che collassi o si sgonfi durante il processo di fissazione. Esistono vari metodi di fissaggio polmonare, ognuno dei quali ha i propri vantaggi e svantaggi. Il metodo di fissazione polmonare qui presentato utilizza una pressione costante per consentire una valutazione ottimale dei tessuti per gli studi che utilizzano un modello polmonare di topo infisematoso. Il vantaggio principale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta. Gli esemplari polmonari sono ottenuti da topi cronici esposti al fumo di sigaretta. La fissazione polmonare viene eseguita utilizzando apparecchiature specializzate che consentono la produzione di pressione costante. Questa pressione costante mantiene il polmone in uno stato ragionevolmente gonfiato. Così, questo metodo genera un esemplare istologico del polmone che è adatto per valutare il fumo di sigaretta indotta enfisema lieve.

Introduzione

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La BPCO è una delle principali cause di morte a livello mondiale1. Il fumo di sigaretta è la causa più importante della BPCO, ma i meccanismi di patogenesi rimangono incompleti. La BPCO dimostra due caratteristiche principali, tra cui la progressiva limitazione del flusso d'aria e una risposta infiammatoria anormale del polmone. Il disturbo dell'insensato si verifica frequentemente nei polmoni dei pazienti affetti da BPCO2. I risultati patologici dell'enfisema sono caratterizzati dalla distruzione della parete alveolare3. Diverse specie animali sono state utilizzate per generare modelli di BPCO in vivo (ad esempio cani, porcellini d'India, scimmie e roditori)4. Tuttavia, il mouse è diventato il più comunemente utilizzato nella costruzione di modelli di BPCO. Questo ha molti vantaggi, tra cui il suo basso costo, la capacità di essere geneticamente modificato, ampia disponibilità di informazioni genomiche, disponibilità di anticorpi, e la capacità di utilizzare una varietà di ceppi di topo5. Attualmente, non esiste un modello di mouse in grado di imitare tutte le caratteristiche della BPCO umana; pertanto, i singoli ricercatori devono scegliere quale modello è più adatto per la ricerca specifica sulla BPCO6. Il modello murino enfisematoso è uno dei molti modelli di topo BPCO attualmente disponibili. Altri modelli includono il modello del mouse di esacerbazione, il modello di co-morbidità sistemiche e il modello di suscettibilità della BPCO7.

Il modello murino enfisematoso può essere generato da diversi tipi di agenti esogeni, tra cui agenti chimici e esposizione al fumo di sigaretta4. L'esposizione chimica (ad esempio, per elastasi) produce un grave tipo di enfisema, mentre il fumo di sigaretta provoca un lieve enfisema8,9. Si ritiene che il fumo di sigaretta sia la causa principale della patogenesi della BPCO; pertanto, la scelta del fumo di sigaretta come mezzo per creare un modello di topo BPCO è ragionevole10. Molti studi hanno usato il fumo di sigaretta per creare enfisema nel mouse. Ad esempio, Nikula ealtri hanno creato con successo un modello di topo enfisematoso da topi femminili B6C3F1 esponendoli al fumo di sigaretta per 7 o 13 mesi11. Abbiamo anche stabilito un modello di topo enfisematoso tramite proteina marcatore di senescenza/topi SMP-30 KO12. È fondamentale eseguire un metodo di fissazione polmonare in grado di visualizzare correttamente questo modello di enfisema lieve dall'esposizione al fumo di sigaretta.

Sono stati stabiliti vari metodi per la fissazionepolmonare 13. Tuttavia, non esiste un metodo gold standard di fissazione del tessuto polmonare per la valutazione dell'enfisema14. Diversi studi di questo laboratorio hanno dimostrato che il sistema di fissazione qui presentato è utile creando una condizione stabile per la valutazione dell'enfisema12,15,16,17,18. Il vantaggio principale del sistema attuale è che può fissare molti polmoni con la stessa condizione in una sola volta senza collasso polmonare o deflazione. L'attuale sistema di fissazione polmonare utilizza alcune attrezzature speciali che consentono ai campioni polmonari di essere gonfiati ad una pressione costante appropriata per un determinato periodo. Questa attrezzatura speciale è composta da tre parti, tra cui un contenitore inferiore, contenitore superiore e pompa. I campioni polmonari vengono collocati nel contenitore inferiore collegato agli agenti di fissaggio pressurizzati, determinando una differenza di pressione di 25 cmH2O nel livello degli agenti tra i contenitori superiore e inferiore19.

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Protocollo

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I seguenti metodi sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali della Juntendo University School of Medicine. Sono state seguite le Linee guida per la corretta condotta degli esperimenti sugli animali, Science Council of Japan, 1 giugno 2006. Ci sono tre passaggi principali in questo metodo: 1) dissezione del topo, 2) essanguinazione polmonare, e 3) fissazione dei tessuti polmonari assistiti da attrezzature specializzate. Tipicamente, i campioni polmonari vengono elaborati all'incorporamento dopo 48 h di fissazione12,15,16,17,18.

1. Dissezione del mouse

  1. Misurare il peso corporeo del mouse, quindi determinare la quantità di pentobarbital da amministrare.
  2. Iniettare pentobarbital intraperitonealmente ad un dosaggio di 70 mg/kg di peso corporeo e confermare l'anestesia per l'assenza di reazione al pizzico dei dei dei dei dei dei dei dei pipi'.
  3. Iniettare l'ago con un angolo di 45 gradi fino a penetrare nella pelle e nel muscolo. Disegnare lo stantuffo e confermare un vuoto d'aria, quindi iniettare il pentobarbital.
  4. Confermare l'anestesia per assenza di movimento riflesso.
    NOTA: L'uso di un topo anestetizzato al contrario di un topo eutanasia è raccomandato per una essanguinazione completamente polmonare.
  5. Tagliare la pelle del topo e il muscolo addominale alla linea mediale, puntando all'area cefalica.
  6. Tagliare lateralmente per fornire uno spazio di lavoro più ampio.

2. Essanguinazione polmonare

  1. Esporre lo strato diaframma e forarlo con pinze.
  2. Aprire lo spazio toracico e tagliare l'area sternale, permettendo ai polmoni e al cuore di essere visti chiaramente.
  3. Tagliare il cuore nell'atrio sinistro e nel ventricolo destro.
  4. Inserire una cannula (24 G) nell'area ventricale destra e dirigerla verso l'area cefalica fino a raggiungere l'arteria polmonare, come mostrato nella Figura 1.
  5. Accendere la pompa e lasciare che la salina 1x tampone fosfato (PBS) circoli (circa 200 mL/h) fino a quando tutto il tessuto polmonare cambia in un colore bianco.

3. Fissazione del tessuto polmonare

  1. Rimuovere la trachea, i polmoni e il cuore.
  2. Liberare tutti e tre gli organi tagliando i tessuti connettivi circostanti.
  3. Legare il giusto bronco principale con un filo di sutura e tagliare tutti i lobi del polmone destro.
  4. (Facoltativo): i lobi del polmone destro sono costituiti da quattro parti. Tagliare queste parti dal bronco principale destro e dividere le parti per la lavorazione come campioni di tessuto congelato.
  5. Inserire il cuore e i lobi del polmone sinistro negli agenti di fissaggio, situati all'interno di una siringa da 10 mL.
    AVVISO: gli agenti di fissaggio sono pericolosi. Indossare attrezzature protettive adeguate (ad esempio, guanti di gomma lunghi) e lavorare in una stanza ben ventilata.
  6. Creare una condizione di vuoto utilizzando una siringa da 10 mL per gonfiare il polmone, come illustrato nella Figura 2.
  7. Inserire una cannula (20 G) nella trachea e legare un nodo.
  8. Gonfiare il polmone con agenti di fissaggio per verificare con eventuali perdite, utilizzando una siringa da 1 mL.
  9. Trasferimento alle apparecchiature di pressione per la fissazione polmonare, come illustrato nella figura 3.
  10. Dopo i periodi di fissaggio, rimuovere il campione polmonare legando la trachea con un nodo.

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Risultati

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Come descritto in precedenza, l'apparecchiatura specializzata, che genera una pressione costante estesa, può essere suddivisa in tre parti (Figura 3A). La parte inferiore è il punto in cui inserire il campione polmonare (Figura 4A). Il polmone è collegato tramite una cannula (20 G) alla punta del flusso di formalina utilizzando un cazzo di arresto a tre vie (Figura 4B). La pressione...

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Discussione

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La procedura di fissazione per i polmoni dei roditori qui presentata non è una novità; tuttavia, questo sistema ha diversi vantaggi. In primo luogo, può fissare molti polmoni (massimo 20) con la stessa condizione in una sola volta. La Società di Patologia Tossicologica afferma che la pressione per l'instillazione gravitazionale varia da 22 a 25 cmH2O22. In particolare, diversi studi hanno eseguito fissazione polmonare ad una pressione di 25 cmH2O13

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi contradditori da dichiarare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato in parte da JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) e dall'Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Il fingeto non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dei metodi attuali e nella scrittura del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10% formalina (soluzione tampone neutra in formalina)Wako060-01667
Forcipe piegatoHammacherHSC187-11
Cannula, misura 20GCannula TerumoSR-FS2032
, misura 22GCannula TerumoSR-OT2225Cper dissanguare il polmone
HammacherHSC184-10
KimtowelNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
Contenitore inferiore (materiale in vetro acrilico)TokyoScience Su misuraComponente per apparecchiature a pressione
Pompa a rulliNissin Scientific CorpNRP-75Pompa per dissanguare il polmone
Pompa a rulli RP-2000Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd)160200Pompa per apparecchiature a pressione
Tubo in silicone e Oslash; 9 mmSansyo94-0479Componente per apparecchiature a pressione
Somnopentyl (64,8 mg/mL)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Pentobarbital Sodio
Forbice chirurgicaHammacherHSB014-11
Filettatura di sutura, misura 0NescosutureGA01SW
Siringa, 1 mLTerumoSS-01T
, 1 ml con agoSiringa TerumoSS-01T2613S
, 10 mLTerumoSS-10ESZ
Rubinetto a tre vieTerumoTS-TR1K01
Contenitore superiore (materiale in vetro acrilico)Tokyo ScienceComponente per apparecchiature a pressionesu misura
Siringa

Riferimenti

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