Vi præsenterer her, en protokol til den samtidige brug af Förster resonans energi transfer-baseret spænding sensorer til at måle protein belastning og fluorescens opsving efter photobleaching til at måle protein dynamics muliggør måling af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler.
Celler fornemme og reagere på fysiske signaler i deres miljø ved at konvertere mekaniske stimuli til biokemisk påviselige signaler i en proces kaldet mechanotransduction. Et afgørende trin i mechanotransduction er overførslen af styrker mellem de eksterne og interne miljøer. Overføre kræfter, der skal være en vedvarende, ubrudt fysiske kobling lavet af en serie af protein-protein interaktioner. For en given protein-protein interaktion, mekanisk belastning kan enten har ingen indvirkning på samspillet, føre til hurtigere afstandtagen af interaktionen, eller endda stabilisere interaktionen. Forstå hvordan molekylære belastning dikterer protein omsætning i levende celler kan give værdifulde oplysninger om den mekaniske stat af et protein, igen belyse dens rolle i mechanotransduction. Eksisterende teknikker til måling af kraft-følsom protein dynamics enten mangler direkte målinger af protein belastning eller stole på målinger foretaget uden for den trådløse forbindelse. Her, beskriver vi en protokol for Förster resonans overførsel-fluorescens energiudnyttelse efter photobleaching (FRET-FRAP) teknik, som giver mulighed for måling af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler. Denne teknik er potentielt relevant for enhver FRET-baserede spænding sensor, lette undersøgelsen af kraft-følsom protein dynamics i række subcellulært strukturer og i forskellige celletyper.
Det ekstracellulære miljø er en rig kilde af biokemiske og fysiske signaler, der dikterer celle adfærd. Navnlig kan den fysiske natur af mikromiljø mægle cellulære funktioner, herunder cellevækst, migrering og differentiering1,2,3,4. Dysregulering af mekanikken i mikromiljø er et afgørende element til mange sygdomme, der endnu ikke har tilstrækkelig behandlinger, såsom kræft5, åreforkalkning6og fibrose7. Fuld forståelse for, hvordan celler konvertere fysiske stimuli til biokemisk påviselige signaler, en proces, der kaldes mechanotransduction, kræver udredning af de molekylære mekanismer mægle kraft transmission, både ind og ud af cellerne og inden for flere subcellulært strukturer.
Inde subcellulært strukturer, proteiner konstant drejning over; bindende og adskillelsen baseret på styrken af deres interaktioner med bindende partnere8. For styrker indberettes med succes på tværs af en fysisk afstand, skal der være en ubrudt kæde af protein-protein interaktioner, hvilket betyder, at et protein omsætning skal være langsomt nok til at opretholde og overføre kraft til dets bindende partner9. Mens protein-protein interaktioner består som regel af flere ikke-kovalente bindinger mellem protein domæner, er samspillet ofte udtænkt som en bundne stat, der kan overgang til en ubundet stat under forskellige betingelser10, 11. for et givet protein-protein interaktion, er det muligt at styrke kan har ingen effekt på levetiden for interaktion, kendt som en “ideel bond”, reducere levetiden for interaktion, kendt som en “slip bond”, eller øge levetiden for interaktionen , kendt som en “catch bond”10. Der er således en indviklede forhold mellem protein belastning og protein dynamik, som vi refererer til som kraft-følsom dynamics.
Mod forståelse effekten af belastningen på bond dynamics, har en række yderst informativ eksperimenter udført på enkelt-molekyle niveau. Ved hjælp af isolerede proteiner eller fragmenter af proteiner og manipulation teknikker såsom magnetiske pincet, Optisk pincet og atomic force mikroskopi, viste disse undersøgelser kraft-følsom protein-protein interaktioner for flere relevante proteiner11,12. Begge integriner13 og cadherins14, som er transmembrane proteiner, der er vigtige for at danne celle-matrix og celle-celle interaktioner, henholdsvis, har vist ændringer i dynamics grund til at indlæse. Inden for cellen, vinculin er rekrutteret til både Kamilla15 og α-catenin16 i en kraft-afhængige måde og kan danne en fangst obligation med aktin17, der angiver en afgørende rolle for vinculin på både fokal sammenvoksninger (FAs) og adherens vejkryds (AJs ) under belastning. Enkelt-molekyle studier tillader dyrkning af specifikke protein-protein interaktioner og give entydige resultater, men de højde ikke for kompleksiteten af den cellulære miljø.
Landmark eksperimenter viste, at flere subcellulært strukturer, herunder FAs og AJs, er mechanosensitive, og udviser forøget forsamling i svar til internt genereret eller eksternt anvendt belastninger18,19, 20,21,22. Flere teoretiske modeller har derudover foreslået, at mechanosensitive forsamling kunne være drevet af kraft-følsom protein dynamics23,24,25. For at undersøge disse kraft-følsom dynamikken i levende celler, har et par indirekte strategier truffet. FRAP og relaterede teknikker giver en relativt enkel metode til måling af protein dynamics i celler26,27,28,29. Måling af protein belastning har imidlertid været mere begrænset. En typisk metode er at sammenligne protein dynamics i celler med og uden udsættelse for en cytoskeletal inhibitor anvendes til at reducere overordnede celle kontraktilitet8,30,31. Begrebsmæssigt, er dette en sammenligning mellem en høj last og lav belastning tilstand. Men der er ingen kvantificering af belastningen på tværs af proteinet i enten tilstand, og der kan være utilsigtede biokemiske effekter af inhibitor, sådanne tab af vigtige bindingssteder langs en F-actin glødetråd. En anden tilgang, specifikke for FAs, har været at måle samlede kraft anstrengelse på underlag af FA benytter trækkraft force mikroskopi til at tilnærme molekylære belastning og undersøge forholdet med dynamikken i en enkelt protein inden for FA32. Mens denne tilgang giver mulighed for kvantificering af samlede kraft, giver det ikke molekylemæssigt specifikke oplysninger. FAs består af over 200 forskellige proteiner, hvoraf mange kan bære belastning33. Således måler den samlede kraft output af en FA potentielt tilslører muligheden for flere kraft transmission veje og pålideligt giver ikke en foranstaltning af belastningen på et specifikt protein.
I modsætning til tidligere tilgange i mechanobiology, fremkomsten af FRET-baserede spænding sensorer giver mulighed for direkte måling af belastninger opleves af specifikke proteiner i levende celler34,35,36. Vi præsenterer her, en protokol, der kombinerer FRET-baserede spænding sensorer med FRAP-baserede mål for protein dynamics. Vi henviser til denne teknik som FRET-FRAP. Denne tilgang gør det muligt samtidig måling af protein belastning og protein dynamik, således at vurderingen af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler (figur 1). Allerede, er FRET-FRAP teknik blevet anvendt til undersøgelse af kraft-følsom dynamikken i mekanisk linker protein vinculin37. Spænding sensorer er blevet udviklet for mange proteiner, der er relevante i en lang række subcellulært strukturer. For eksempel er sensorer udviklet til vinculin34 og Kamilla38,39 i FAs, cadherins og catenins i AJs40,41,42, nesprin i den nukleare Anna komplekse 43, α-actinin44 og filamin36 i cytoskeleton, og MUC-1 i glycocalyx45, blandt andre46. FRAP er ligeledes et almindeligt anvendte teknik er blevet brugt på mechanosensitive proteiner i fokale sammenvoksninger8,31, adherens vejkryds47, actin cortex26og nucleus48. Bevæger sig fremad, FRET-FRAP teknik bør generelt gælder for nogen af disse eksisterende sensorer eller nyligt udviklet sensorer, giver mulighed for målinger af force-følsomme dynamik i en bred vifte af subcellulært strukturer og sammenhænge. I denne retning leverer vi en detaljeret, generaliseret protokol for at gennemføre de FRET-FRAP teknik gælder i disse forskellige systemer. Forhåbentlig, dette vil give en lang række eksperimenter belyse roller i forskellige mechanosensitive proteiner i regulere kraft transmission og mægle celle adfærd.
Metoden FRET-FRAP giver mulighed for direkte måling af kraft-følsom protein dynamics, en egenskab, der har været vanskelige at direkte sonde indeni levende celler. Følsomheden af protein dynamics til molekylære belastning er afgørende for proteinets funktion som en kraft senderen eller transducer. Læsning er nødvendige til transmission af både internt genereret og eksternt anvendt styrker, kaldet mechanotransmission, og en konvertering af disse styrker til biokemisk påviselige signaler, kaldet mechanotransducti…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en National Science Foundation karriere Award (NSF-CMMI-14-54257) samt tilskud fra American Heart Association (16GRNT30930019) og National Institutes of Health (R01GM121739-01) tildeles Dr. Brenton Hoffman og en National Science Foundation Graduate Research Fellowship tildeles Katheryn Rothenberg. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NSF eller NIH.
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | 25300062 | |
16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
60x Objective NA1.35 | Olympus | UPLSAPO 60XO | |
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Gibco | 15240-062 | |
Automated Stage | Prior Scientific | H117EIX3 | |
Custom Dichroic Mirror | Chroma Technology Corp | T450/514rpc | |
Custom mTFP1 Emission Filter | Chroma Technology Corp | ET485/20m | |
Custom mTFP1 Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET450/30x | |
Custom Venus Excitation Filter | Chroma Technology Corp | ET514/10x | |
DMEM-gfp Live Cell Visualization Medium | Sapphire | MC102 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D5796 | with L-glutamine and sodium bicarbonate |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30396.03 | |
Fibronectin, Human | Corning | 47743-654 | |
FRAPPA Calibration Slide | Andor | provided along with FRAPPA unit | |
FRAPPA System with 515 nm Laser | Andor | ||
Glass-bottomed Fluoro Dishes | World Precision Instruments | FD35 | |
HEK293-T Cells | ATCC | CRL-3216 | |
Hexadimethrine Bromide, Polybrene | Sigma Aldrich | H9268-5G | |
High-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma Aldrich | D6429 | |
Inverted Fluorescent Microscope | Olympus | IX83 | |
JMP Pro Software | SAS | ||
Lambda 10-3 Motorized Filter Wheels | Sutter Instruments | LB10-NW | |
LambdaLS Arc Lamp with 300W Ozone-Free Xenon Bulb | Sutter Instruments | LS/OF30 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
MATLAB Software | Mathworks | ||
MEM Non-Essential Amino Acids | Thermo Fisher | 11140050 | |
MetaMorph for Olympus | Olympus | ||
Micro-Humidification System | Bioptechs | 130708 | |
MoFlo Astrios EQ Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
Objective Heater Medium | Bioptechs | 150819-13 | |
OptiMEM | Thermo Fisher | 31985070 | |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
pMD2.G Envelope Plasmid | Addgene | 12259 | |
pRRL Vector | gift from Dr. Kam Leong (Columbia University) | ||
psPax2 Packaging Plasmid | Addgene | 12260 | |
sCMOS ORCA-Flash4.0 V2 Camera | Hamamatsu Photonics | C11440-22CU | |
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge | Thermo Fisher | 75004505 | |
Stable Z Stage Warmer | Bioptechs | 403-1926 | |
Venus Emission Filter | Semrock | FF01-571/72 |