Articolo metodologico

qKAT: Quantitative sulla tipizzazione di assassino-cellula immunoglobulina-come geni del ricevitore

DOI:

10.3791/58646

⸱

6 marzo 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantitativa delle cellule di assassino immunoglobulina-come recettore (KIR) semi-automatica digitando (qKAT) sono un metodo semplice, ad alta velocità e costi contenuto per copiare il numeri geni KIR di tipo per la loro applicazione negli studi di associazione di popolazione e la malattia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recettori di immunoglobulina-come delle cellule killer (KIRs) sono un insieme di ricevitori immuni inibitori e d'attivazione, il natural killer (NK) e le cellule di T, codificate da un cluster polimorfico di geni sul cromosoma 19. Loro ligandi meglio caratterizzate sono le molecole (HLA) l'antigene umano del leucocita che sono codificate all'interno il locus di istocompatibilità complex (MHC) sul cromosoma 6. Vi sono prove concrete che giocano un ruolo significativo nell'immunità, riproduzione e trapianto, rendendo fondamentale avere tecniche che possono misurare con precisione il genotipo li. Tuttavia, alta omologia, anche come allelica e variazione numero di copia, rendono difficile al genotipo ed efficientemente i metodi di progettazione che possono misurare con precisione tutti i geni KIR . Metodi tradizionali sono solitamente limitati nella risoluzione dei dati ottenuti, velocità effettiva, rapporto costo-efficacia e il tempo impiegato per l'impostazione e l'esecuzione degli esperimenti. Descriviamo un metodo chiamato quantitativa KIR semi-automatico digitando (qKAT), che è un metodo di reazione a catena multipla della polimerasi in tempo reale di alto-rendimento che può determinare i numeri di copia del gene per tutti i geni del locus di KIR . qKAT è un semplice metodo di alto-rendimento che può fornire dati ad alta risoluzione KIR copia numeri, che possono essere ulteriormente utilizzati per dedurre le variazioni negli aplotipi strutturalmente polimorfici che li comprendono. Questi dati di numero e aplotipo di copia possono essere utili per gli studi su associazioni di malattia su larga scala, genetica delle popolazioni, nonché indagini sull'espressione e interazioni funzionali tra KIR e HLA.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In esseri umani, il recettore immunoglobulina-come assassino(KIR) locus è mappato sul braccio lungo del cromosoma 19 all'interno del complesso recettoriale del leucocita (LRC). Questo locus è circa 150 kb di lunghezza e comprende 15 KIR geni disposti testa-coda. I loci KIR che sono attualmente noti sono KIR2DL1, KIR2DL2/ KIR2DL4,KIR2DL3, KIR3DL1, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5/KIR3DS1, KIR3DL2-3, e due pseudogeni, KIR2DP1 e KIR3DP1. I geni KIR codificano per bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) immunoglobulina-come dominio recettori con breve (S; attivazione) o lungo (L; inibitorio) Code citoplasmatiche che sono espresse da cellule natural killer (NK) e sottoinsiemi di T cellule. Copia numero variazione esposte all'interno delle forme di locus KIR diversi aplotipi con gene variabile contenuto1. La ricombinazione omologa non allelica (NAHR), facilitata da una composizione di gene di testa-coda stretta e alta-omologia, è il meccanismo proposto per essere responsabili della variabilità hanno. Oltre 100 diversi aplotipi sono stati segnalati in popolazioni in tutto il mondo1,2,3,4. Tutti questi aplotipi potrebbero essere diviso in due gruppi principali: gli aplotipi di A e B. L'aplotipo A contiene 7 geni KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1e KIR3DL2, che sono inibitori KIR geni e l'attivazione KIR gene KIR2DS4. Tuttavia, fino al 70% degli individui di origine europea che sono omozigotici per KIR aplotipo A esclusivamente trasportare una forma non funzionale "eliminazione" di KIR2DS45,6. Tutte le altre combinazioni di geni KIR formano aplotipi di gruppo B, tra cui almeno uno dei geni KIR specifici KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, e KIR2DL5e in genere includono due o più geni KIR d'attivazione.

Molecole HLA di classe I sono stati identificati come i ligandi per determinati recettori inibitori (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3e KIR3DL1), attivando i recettori (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5e KIR3DS1), e per KIR2DL4, che è un unico KIR che contiene un citoplasmico lunghe code come altri recettori inibitori KIR, ma ha anche un residuo di caricato positiva vicino il dominio extracellulare che è un comune caratteristica di altri recettori KIR d'attivazione. La combinazione di varianti all'interno dei geni KIR e i geni HLA influenza interazione ligando del recettore che reattività potenziali forme NK cella al livello individuale7,8. La prova dagli studi di associazione genetica ha indicato che KIR svolge un ruolo nella resistenza virale (ad es.., virus dell'immunodeficienza umana [HIV]9 ed epatite C [HCV] virus10), il successo del trapianto 11, il rischio di gravidanza disturbi e successo riproduttivo12,13, la protezione contro la ricaduta dopo trapianto ematopoietico allogeneic della cellula formativa (HSCT) trapianto14,15, 16e il rischio di cancri17.

La combinazione di alta-omologia e allelica e hanno diversità presenta sfide nel compito di accuratamente geni KIR di genotipizzazione. I metodi convenzionali di geni KIR tipo comprendono primer sequenza-specifici (SSP) polimerasi reazione a catena (PCR)18,19,20, oligonucleotide sequenza-specific sonda (SSOP) PCR21, e aghi laser assistita desorbimento ionizzazione-tempo di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS)22. Gli svantaggi di queste tecniche sono che essi forniscono solo parziale spaccato il genotipo di un individuo pur essendo anche laborioso da eseguire. Recentemente il sequenziamento di nuova generazione (NGS) è stata applicata per digitare il locus KIR specificamente. Mentre questo metodo è molto potente, può essere costoso per l'esecuzione, ed è tempo di effettuazione di verifiche approfondite analisi e dati.

qKAT è un metodo PCR quantitativo ad alta produttività. Mentre i metodi convenzionali sono laboriosa e che richiede tempo, questo metodo rende possibile eseguire quasi 1.000 campioni di DNA (gDNA) genomici in cinque giorni e dà il genotipo KIR , così come il numero di copie del gene. qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex, ciascuno dei quali destinato a due KIR loci e copia di un gene di riferimento di un numero fisso copia nel genoma (STAT6) utilizzato per la relativa quantificazione del gene di KIR numero23. Questo test è stato utilizzato con successo negli studi che coinvolgono la popolazione grandi pannelli e coorti di malattia malattie infettive come HCV, patologie autoimmuni come il diabete di tipo 1, e disturbi della gravidanza come la preeclampsia, così come fornire una genetica alla base di studi volti a comprendere le NK cell funzione1,4,24,25,26.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparazione e placcatura fuori dal DNA

  1. Quantificare con precisione la concentrazione gDNA utilizzando uno strumento spettrofotometrico o fluorometrica.
  2. Diluire il DNA a 4 ng / µ l su una piastra a 96 pozzetti profondi pozzetti. Includere almeno un controllo gDNA campione con un numero di copia nota e un modello di non controllo.
  3. Centrifugare le piastre da 96 pozzetti a 450 x g per 2 min.
  4. Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare ogni campione in quadruplice copia sulle piastre 384 pozzetti qPCR affinché ogni pozzo ha 10 ng di DNA (2,5 µ l/pozzetto). Preparare almeno dieci piastre da 384 pozzetti, uno per ciascuna reazione di qKAT.
  5. Se gDNA è erogato da più di una piastra a 96 pozzetti, eseguire un lavaggio di intero volume con 2% candeggina e acqua ultrapura per pulire gli aghi del liquido sistema tra ogni piastra a 96 pozzetti dei campioni gDNA manipolazione.
  6. Asciugare il DNA incubando le piastre da 384 pozzetti in un'area pulita a temperatura ambiente per almeno 24 h.

2. preparazione del primer e sonde

Nota: qKAT è costituito da dieci reazioni multiplex. Ogni reazione comprende tre coppie di primer e tre sonde fluorescenza-etichetta che amplificano in particolare due geni KIR e gene di un riferimento. Le sonde che sono state pubblicate in Jiang et al.27 sono state modificate affinché i oligonucleotides ora sono contrassegnati con le tinture ATTO poiché offrono una migliorata fotostabilità e segnale deve percorrere lunghe durate. Primer pre-aliquotato combinazioni sono disponibili in commercio (Vedi Tabella materiali).

  1. Preparare le combinazioni di primer per ogni reazione secondo le diluizioni riportati nella tabella 1.
  2. Preparare la sonda combinazioni per ogni reazione secondo la tabella 1. Ogni sonda individuo prima di effettuare la combinazione di prova.

3. preparazione della Master Mix

Nota I volumi di seguito indicati sono per l'esecuzione di uno qKAT reazione su un set di piastre da 10 x 384 pozzetti.

  1. Assicurarsi che i campioni di gDNA placcati sulle piastre da 384 pozzetti siano completamente asciutti. Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio e mantenere i reagenti coperti dall'esposizione alla luce per quanto possibile, dal momento che le sonde fluorescenza-labeled sono foto - e termo-sensibili.
  2. Sbrinare il buffer di qPCR, primer e aliquote di sonda a 4 ° C.
  3. Su ghiaccio, preparare un mix master per 10 x 384 pozzetti aggiungendo 18,86 mL di acqua ultrapura, 20 mL di buffer di qPCR, 1.000 µ l di combinazione preprepared primer e 180 µ l di combinazione preprepared sonda (tabella 2).
  4. Distribuire uniformemente il mix master su un piatto ben 96-profondo utilizzando una pipetta multicanale, pipettaggio 415 µ l in ogni pozzetto. Mantenere questo piatto in una scatola di ghiaccio coperta dalla luce.
  5. Utilizzando uno strumento di gestione dei liquidi, dispensare 9,5 µ l di mix master in ciascun pozzetto della piastra 384 pozzetti con gDNA secco. Sigillare la piastra con un foglio e mettere immediatamente a 4 ° C. Ripetere questo processo per le piastre rimanenti, assicurando che gli aghi del liquido sistema di movimentazione vengono lavati con acqua tra ogni piatto.
  6. Centrifugare le piastre da 384 pozzetti a 450 x g per 3 min e li Incubare a 4 ° C durante la notte o tra 6-12 h per risospendere il DNA e dissipare eventuali bolle d'aria.

4. qPCR Assay

  1. Dopo l'incubazione overnight, centrifugare a 450 x g per 3 min dissipare eventuali bolle d'aria rimanente.
  2. Ai fini dell'automazione, connettere la macchina qPCR (ad es., LightCycler 480) a un gestore di micropiastre (Vedi Tabella materiali). Programma per il gestore di micropiastre per inserire le piastre della macchina di qPCR da un bacino di stoccaggio refrigerato che è protetto dalla luce.
    Nota i saggi dovrebbero, in teoria, funzionare su altre macchine di qPCR con impostazioni ottiche compatibili.
  3. Utilizzare le seguenti condizioni in bicicletta: 95 ° C per 5 min, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 s e 66 ° C per 50 s, con raccolta di dati a 66 ° C.
  4. Una volta che viene completata l'esecuzione, è necessario avere il robot raccogliere la piastra dalla macchina qPCR e inserirlo nel dock scartare.

5. post-esecuzione analisi

  1. Dopo l'amplificazione, calcolare i valori di ciclo (Cq) quantificazione utilizzando il secondo metodo di massimo derivato o il metodo di punti di adattamento con il software della macchina qPCR (Vedi Tabella materiali), procedi nel seguente modo.
  2. Aprire il software di qPCR e, nella scheda Navigator , aprire il file di esperimento di reazione salvato per una piastra.
  3. Per l'analisi utilizzando il secondo metodo di massimo derivato, selezionare la scheda di analisi e create una nuova analisi utilizzando il metodo Abs Quant/Second derivato Max.
    1. Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Second derivato Max, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: Rx-DFO (dove x è il numero di reazione).
    2. Selezionare Filtro pettine e scegliere VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Ciò assicura che i dati raccolti per STAT6 sono selezionati.
    3. Selezionare compensazione del colore per VIC/HEX/Yellow555(533-580). Fare clic su Calcola. Ripetere questa operazione per Fam (465-510) e Cy5/Cy5.5(618-660). Fare clic su Salva file.
  4. Per l'analisi mediante il metodo di punti di adattamento, selezionare Abs Quant/Fit punti nella scheda analisi.
    1. Nella finestra Crea nuova analisi , selezionare il tipo di analisi: metodo Abs Quant/Fit punti, sottoinsieme: tutti i campioni, programma: amplificazione, nome: RxF-DFO (dove x è il numero di reazione).
    2. Selezionare i filtri corretti e compensazioni di colore per STAT6 e ciascuno dei geni KIR (Fam/Cy5). Nella scheda Noiseband , impostare la banda di rumore per escludere il rumore di fondo.
    3. Nella scheda analisi , impostare i punti di adattamento a 3 e selezionare che Visualizza i punti di adattamento. Fare clic su Calcola. Fare clic su Salva file.

6. esportazione dei risultati

  1. Nel software qPCR, aprire il navigatore scheda selezionare Risultati Batch Export.
  2. Aprire la cartella in cui i file di esperimento sono salvati e trasferire i file nella sezione destra della finestra. Fare clic su Avanti. Selezionare il nome e il percorso del file di esportazione.
  3. Selezionare il tipo di analisi Metodo Max di derivato Quant/Second Abs o Abs Quant/Fit punti. Fare clic su Avanti. Verifica che il nome del file, la cartella di esportazione e il tipo di analisi siano corretto e fare clic su Next per avviare il processo di esportazione.
  4. Attendere che lo Stato di esportazione è Ok. Lo schermo passa automaticamente alla fase successiva. Verifica che tutti i file selezionati sono stati esportati con successo affinché il numero di file non riusciti = 0. Fare clic su fatto.
  5. Utilizzare gli script split_file.pl e roche2sds.pl per dividere le piastre esportate in reazioni individuali per ogni piatto.
    Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub.

7. copiare il numero di calcoli

  1. Aprire il software di analisi numero copie (ad esempio, CopyCaller). Selezionare Importa file di risultati PCR in tempo reale e caricare file di testo creati da roche2sds.pl.
  2. Seleziona analizza e condurre l'analisi sia selezionando campione calibratore con numero di copia nota oppure selezionando numero di copia più frequente. Vedere tabella 5 per il numero più frequente di copia dei geni KIR in genere osservata in popolazioni di origine europea.

8. qualità dei dati controlla

  1. Utilizzare script di R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R per combinare dati di numero di copia da tutti i piatti in un foglio di calcolo.
    Nota gli script sono disponibili su richiesta/GitHub.
  2. Ricontrollare i dati grezzi sul software di analisi numero di copia per i campioni non conformi per il noto squilibrio (LD) per geni KIR (tabella 6).

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Copia numero analisi possono essere effettuata esportando i file per il software di analisi numero copie, che fornisce il numero di copie previsto e stimato sulla base del metodo ΔΔCq.

Il numero di copia può essere previsto in base al numero di copia nota di campioni di DNA di controllo sulla piastra o inserendo il numero di copia del gene più frequente (tabella 5). La figura 1 Mostra i risultati di una piastra per una reazione che gli obiettivi di KIR2DL4 e KIR3DS1, come pure il gene di riferimento STAT6. Il numero di copia più frequente per KIR2DL4, un gene di quadro in luogo del KIR , è due copie, mentre il numero più frequente di copia per KIR3DS1, un gene d'attivazione, è una copia. I risultati in figura mostrano le trame di amplificazione di PCR osservate sul software qPCR e i dati di numero di copia generati dai dati qPCR. Come illustrato, il dosaggio è in grado di distinguere tra 0, 1, 2, 3 e 4 numeri di copia del gene KIR . Il software di analisi numero di copia consente inoltre una visualizzazione della distribuzione del numero di copia tutta la piastra come un grafico a torta o un grafico a barre. L'efficacia della previsione del numero di copia è inferiore per i campioni con un numero superiore di copia.

La qualità di tutti i materiali utilizzati nelle reazioni, gDNA, buffer, primer le sonde, può influenzare la precisione dei risultati ottenuti. Tuttavia, la discordanza nei risultati è più probabile essere causato a causa di variazione della concentrazione di DNA attraverso un piatto. La purezza del gDNA Estratto, che può essere misurata usando il 260/280 e 260/230 rapporti, può anche avere un effetto sulla qualità. Un rapporto di 260/280 di 1.8-2 e un 260/230 rapporto di 2-2.2 sono desiderabili. Una concentrazioni di gamma irregolare di DNA attraverso un piatto possono portare a un'alta variabilità del ciclo di soglia (Ct) tra campioni e discordanza nella gamma del numero stimato di copia. I risultati in Figura 2 mostrano l'effetto che la disparità tra i valori dit C attraverso un piatto può avere sulla precisione nella previsione del numero di copia. La linea rossa indica l'intervallo del numero stimato di copia per un campione e, idealmente, dovrebbe essere più vicino al valore integer come possibile.

I dati di numero di copia, una volta analizzati, possono essere esportati come un file di foglio di calcolo in un formato a 96 pozzetti. Abbiamo utilizzato uno script di R (disponibile su richiesta) per combinare i dati di numero di copia di tutti i 10 piatti che vengono eseguiti come un set in un foglio di calcolo. Dati pubblicati circa KIRs da popolazioni di origine europea principalmente consentono la previsione di regole di LD che esiste tra vari geni nel complesso KIR 1. Queste previsioni sono utilizzate per condurre controlli a valle sui copia numeri risultati ottenuti (tabella 6). Campioni non conformi per il LD previsto fra i geni potrebbero contenere polimorfismo insolito o hanno variazioni strutturali. Un diagramma di flusso che descrive il protocollo è illustrato nella Figura 3.

Uno strumento chiamato KIR aplotipo identificatore (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) è stato sviluppato per facilitare l'imputazione di aplotipi dal set di dati. L'imputazione lavora sulla base di un elenco di riferimento aplotipi osservati in una popolazione di origine europea1. Tuttavia, lo strumento permette anche per un set personalizzato di aplotipi di riferimento deve essere utilizzato invece. Vengono generati tre file distinti; il primo file elenca tutte le combinazioni di aplotipo per un campione, il secondo file viene fornito un elenco rifilato le combinazioni di aplotipi che hanno le più alte frequenze combinate e il terzo file elenca i campioni che non possono essere assegnati gli aplotipi. Non-assegnazione degli aplotipi potrebbe essere utilizzato come un indicatore del romanzo aplotipi.

figure-results-1
Figura 1: numero di risultati rappresentativi di una piastra per reazione 5. (A) Questa amplificazione spettacoli pannello trame. (B), questo pannello spettacoli copiare Numero trame. (C), questo pannello mostra la distribuzione del numero di copia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: risultati rappresentativi di una piastra con una concentrazione variabile di DNA per reazione numero 5. (A) Questa amplificazione spettacoli pannello trame. (B), questo pannello spettacoli copiare Numero trame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: diagramma di flusso del protocollo qKAT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

AnalisiGeniForward primerConcentrazione (nM)Iniettori d'inversioneConcentrazione (nM)SondeConcentrazione (nM)
N. 13DP1A4F250A5R250P4a150
2DL 22DL2F4400C3R2600P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 22DS2A4F400A6R400P4a200
2DL 3D1F400D1R400P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 33DL 3A8F500A8R500P4a150
2DS4Del2DS4Del2502DS4R2250P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 43DL1e4B1F250B1R125P4b150
3DL1e9D4F250D4R2500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 53DS1B2F250B1R250P4b150
2DL 4C1F200C1R200P5B - 2DL 4150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 62DL 1B3F500B3R125P4b150
2DP1D3F250D3R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 72DS1B4F500B4R250P4b150
2DL 5D2F500D2R500P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 82DS3B5F250B5R250P4b150
3DL2e9D4F250D5R125P9150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 93DL2e4A1F200A1R200P4a150
2DS4FL2DS4FL2502DS4R2500P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150
N. 102DS5B6F2200B6R3200P4b150
2DS4C5F250C5R250P5B150
STAT6STAT6F200STAT6R200PSTAT6150

Tabella 1: combinazione e concentrazione di primer e sonde utilizzate in ogni reazione di qKAT 27 .

ReazioneAliquote di primer (µ l)Sonda di aliquote (µ l)
R13DP1A4FA5R2DL2F4C3R2ACQUASTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DL 21001001602402008080606060
R22DS2A2FA6RD1FD1RACQUASTAT6FSTAT6RP4AP9PSTAT6
2DL 31601601601601608080806060
Nota: è necessario 20 µ l meno acqua nel MasterMix
R33DL 3A8F A8FBA8R2DS4DELF2DS4R2ACQUASTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4DEL100 1002001001002008080606060
R43DL1E4B1FB1RD4FD4R2ACQUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL1E9100501002003508080606060
R53DS1B2FB1RC1FC1RACQUASTAT6FSTAT6RP4BP5B - 2L 4PSTAT6
2DL 410010080804408080606060
R62DL 1B3FB3RD3FD3RACQUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DP1200501002002508080606060
R72DS1B4FB4RD2FD2RACQUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
2DL 52001002002001008080606060
R82DS3B5FB5RD4FD5RACQUASTAT6FSTAT6RP4BP9PSTAT6
3DL2E9100100100504508080606060
R93DL2E4A1FA1R2DS4WTF2DS4R2ACQUASTAT6FSTAT6RP4AP5BPSTAT6
2DS4WT80801002003408080606060
R102DS5B6F2B6R3C5FC5RACQUASTAT6FSTAT6RP4BP5BPSTAT6
2DS4TOTAL80801001004408080606060

Tabella 2: Soluzioni per rendere primer e sonde aliquote di combinazione di riserva di volume (µ l) di 100 µM primer/sonda.

NomeDirezionemodifica a 5 minuti3 ´ modificaSequenza (5' →3')LunghezzaTMGC %EsonePosizione
P4aSensoFAMBHQ-1TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		276044,44425-451
P4bAntisensoFAMBHQ-1AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		2862504576-603
P5BSensoATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		2560525828-852
P5B - 2DL 4SensoATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		2561565828-852
P9SensoATTO647NBHQ-2CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		246062,591246-1269
PSTAT6ATTO550BHQ-2CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		266250

Tabella 3: elenco delle sonde utilizzate in qKAT 1, 27. i coloranti fluorescenti utilizzati all'estremità 5' delle sonde oligo P5b, P5b - 2 DL 4, P9 e PSTAT6 sono stati modificati per ATTO coloranti.

GenePrimerDirezioneSequenza (a 5 minuti-3 ´)LunghezzaTMGC %EsonePosizioneAmplicon (bp)Alleli potrebbero essere perso
3DL2e4A1FAvantiGCCCCTGCTGAA
ATCAGG		185261,14399-4161793DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1RInvertireCTGCAAGGACAG
GCATCAA		195352,6559-5773DL 2 * 048
3DP1A4FAvantiGTCCCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416112Nessuno
A5RInvertireGTGAGGCGCAAA
GTGTCA		185255,6492-509Nessuno
2DS2A2FAvantiGTCGCCTGGTGA
AATCAGA		194952,64398-416111Nessuno
A6RInvertireTGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		215142,9488-508Nessuno
3DL 3A8FaAvantiGTGAAATCGGGA
GAGACG		185055,64406-423139Nessuno
A8FbAvantiGGTGAAATCAGG
AGAGACG		195052,6405-4233DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8RInvertireAGTTGACCTGGG
AACCCG		185161,1526-543Nessuno
3DL1e4B1FAvantiCATCGGTCCCAT
GATGCT		185155,64549-566853DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
B1RInvertireGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-6333DL 1 * 00502
3DS1B2FAvantiCATCGGTTCCAT
GATGCG		185155,64549-566853DS1 * 047; può prendere 3DL 1 * 054.
B1RInvertireGGGAGCTGACAA
CTGATAGG		205255614-633Nessuno
2DL 1B3FAvantiTTCTCCATCAGT
CGCATGAC		2052504544-563962DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3RInvertireGTCACTGGGAGC
TGACAC		185061,1622-6392DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1B4FAvantiTCTCCATCAGTC
GCATGAA		195147,44545-563962DS1 * 001
B4RInvertireGGTCACTGGGAG
CTGAC		174964,7624-640Nessuno
2DS3B5FAvantiCTCCATCGGTCG
CATGAG		185361,14546-56396Nessuno
B5RInvertireGGGTCACTGGGA
GCTGAA		185161,1624-641Nessuno
2DS5B6F2AvantiAGAGAGGGGACG
TTTAACC		195052,64475-493173Nessuno
B6R3InvertireTCCAGAGGGTCA
CTGGGC		185366,7630-6472DS5 * 003
2DL 4C1FAvantiGCAGTGCCCAGC
ATCAAT		185255,65808-82583Nessuno
C1RInvertireCCGAAGCATCTG
TAGGTCT		195252,6872-8902DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 22DL2F4AvantiGAGGTGGAGGCC
CATGAAT		195257,95778-7961512DL 2 * 009; 782G cambiato A.
C3R2InvertireTCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		205145909-928Nessuno
2DS4C5FAvantiTCCCTGCAGTGC
GCAGC		175770,65803-819120Nessuno
C5RInvertireTTGACCACTCGT
AGGGAGC		195257,9904-9222DS4 * 013
2DS4Del2DS4DelAvantiCCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		195457,95750-768203Nessuno
2DS4R2InvertireTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Nessuno
2DS4FL2DS4FLAvantiCCGGAGCTCCTA
TGACATG		195357,95744-762209Nessuno
2DS4R2InvertireTGACGGAAACAA
GCAGTGGA		205350933-952Nessuno
2DL 3D1FAvantiAGACCCTCAGGA
GGTGA		174858,891180-1196156Nessuno
D1RInvertireCAGGAGACAACT
TTGGATCA		2050451316-13352DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 e 2DL 3 * 01802
2DL 5D2FAvantiCACTGCGTTTTC
ACACAGAC		20525091214-12331202DL5B * 011 e 2DL5B * 020
D2RInvertireGGCAGGAGACAA
TGATCTT		194947,41315-1333Nessuno
2DP1D3FAvantiCCTCAGGAGGTG
ACATACGT		20535591184-1203121Nessuno
D3RInvertireTTGGAAGTTCCG
TGTACACT		2050451285-1304Nessuno
3DL1e9D4FAvantiCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221933DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2InvertireCCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		235343,51273-12953DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9D4FAvantiCACAGTTGGATC
ACTGCGT		195252,691203-1221156Nessuno
D5RInvertireGACCTGACTGTG
GTGCTCG		195463,21340-1358Nessuno
STAT6STAT6FAvantiCCAGATGCCTAC
CATGGTGC		205460129
STAT6RInvertireCCATCTGCACAG
ACCACTCC		205460

Tabella 4: sequenze dei primer utilizzati in qKAT 1, 27.

KIR gene 3DL 32DS22DL 22DL 32DP12DL 13DP12DL 43DL 1
EX9		3DL 1
EX9		3DS12DL 52DS32DS52DS12DS4
Totale		2DS4
FL		2DS4
DEL		3DL 2
EX4		3DL 2
EX9
Più frequente numero di copia21122222221111121122

Tabella 5: Più frequente numero di copie per KIR geni comunemente osservati in campioni di origine europea.

Linkage disequilibrium regole per qKAT basato su popolazioni europeeControllo del numero di copia
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 sono quadro geni presenti su entrambi gli aplotipi. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 e KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 e KIR2DL2 sono in LD con a vicenda 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 e KIR2DL3 sono alleli dello stesso gene 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 e KIR2DL1 sono in LD con a vicenda 2DP1=2 DL 1
5Esone 4 di KIR3DL1 e KIR3DL2 è uguale a essone 9 di KIR3DL1 e KIR3DL2 rispettivamente. 3DL1ex4=3DL1ex9 e 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 e KIR3DS1 sono alleli 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 e KIR2DS5 sono in LD con KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 e KIR2DS1 sono in LD 3DS1=2DS1
9Presenza di KIR2DS1 e KIR2DS4Total è mutualmente esclusivo su un aplotipo 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL e KIR2DS4del sono varianti del KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabella 6: Linkage disequilibrium tra KIR geni comunemente osservati nelle popolazioni di origine europea possono essere utilizzati per controllare i dati di numero di copia 1,27.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo descritto un nuovo metodo semi-automatico ad alta velocità, chiamato qKAT, che facilita la copia numero digitando dei geni KIR . Il metodo rappresenta un miglioramento rispetto ai metodi convenzionali come SSP-PCR, che sono basso-throughput e possono solo indicare la presenza o l'assenza di questi geni altamente polimorfici.

La precisione dei dati numeri copia ottenuti dipende da molteplici fattori, tra cui la qualità e la concentrazione-uniformità dei campioni gDNA e la qualità dei reagenti. La qualità e la precisione dei campioni gDNA attraverso un piatto sono estremamente importanti poiché variazioni nella concentrazione su tutta la piastra possono causare errori nel calcolo del numero della copia. Poiché i dosaggi sono stati convalidati utilizzando set di campioni di origine europea, dati dalle coorti da altre parti del mondo richiedono controlli più approfonditi. Questo è per garantire che le istanze di allele dropout o associazione non specifici primer/sonda non sono interpretati erroneamente come variazione numero di copia.

Mentre i dosaggi sono stati progettati e ottimizzati per l'esecuzione come ad alta velocità, possono essere modificati per eseguire meno campioni. La metrica di fiducia nel software di analisi numero di copia è interessata quando si analizzano campioni di meno, ma questo può essere migliorato se campioni di DNA genomici di controllo con un numero di copia del gene KIR noto sono inclusi sulla piastra e repliche di esempio aggiuntivi sono incluso.

Per i laboratori senza liquido/piastra-manipolazione robot, mix master può essere distribuito utilizzando pipette multicanale e piastre possono essere caricati manualmente nello strumento qPCR.

Lo scopo principale dietro lo sviluppo di qKAT era di creare un semplice, ad alta velocità, alta risoluzione e conveniente metodo per genotipo KIRs per malattia gli studi di associazione. Questo è stato raggiunto con successo poiché qKAT è stato impiegato nell'investigare il ruolo di KIR in parecchi studi di associazione di grande malattia, compreso una gamma di malattie infettive, malattie autoimmuni e gravidanza disturbi4, 24 , 25 , 26.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio di ricerca medica (MRC), del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea (grant contratto n. 695551) e il Cambridge National Institute of Health (NIH) Biomedical Research Centre e NIH ricerca sangue e trapianto di unità di ricerca (NIHR BTRU) in donazione e trapianto presso l'Università di Cambridge e in collaborazione con NHS Blood and Transplant (NHSBT). Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non necessariamente quelle di NHS, la NIHR, il Ministero della sanità o il NHSBT.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
REAGENTS
OligonucleotidiSigmaCustomorder SEQUENZE: Elencate nella Tabella 4
Sonde marcate con coloranti ATTOSigmaCustomorder SEQUENZE: Elencate nella Tabella 3
SensiFAST Probe No-ROX KitBiolineBIO-86020−
MilliQ acqua&meno;&meno;&meno;
NameAziendaNumero di catalogoComments
EQUIPMENT
Centrifuga con rotore a secchiello oscillanteEppendorf(o equivalente)Eppendorf 5810R o sistema
NanoDropThermo ScientificND-2000<
strong>OR
QuBit FluorimeterLife TechnologiesQ33216
Matrix HydraThermo Scientific109611
LightCycler 480 II Instrument 384-wellRoche05015243001
Twister II Microplate Handler con Mé Impilatore termico per piastre Cour (Mé Cour)Caliper Life Sciences204135
Miscelatore a vorticeBiosanBS-010201-AAA
Pipette monocanale (intervallo di volume: 0,5– 10 µ L, 2– 20 µ L, 20– 200 µ L, 200– 1.000 µ L; 1-10 mL)Gilson(o equivalente)F144801, F123600, F123615, F123602 F161201
puntali per pipette privi di RNasi e DNasi filtrati (10 &; micro; L, 20 & micro; L, 200 & micro; L, 1.000 µ L, 10 mL)Starlab (o equivalente)S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
Serbatoio reagente StarTub PS, 55 mLSTARLABE2310-1010
Provetta da centrifuga da 50 mLSTARLABE1450-0200
Piastra a pozzetti profondi a 96 pozzettiFisher Scientific12194162
LC480 384 Piastre multipozzettoRoche04729749001
LightCycler 480 Foglio sigillanteRoche04729757001
NomeAziendaNumero di catalogoComments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/aplotipo KIR
equivalente identificatore di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Tipizzazione dei geni KIRMetodo qKATPCR in tempo realeAnalisi del numero di copieReazioni multiplexInterazione HLARecettori delle cellule NKGenetica di popolazioneAssociazione con malattie

Articoli correlati