Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

qKAT: kwantitatieve Semi-automated te typen van Killer-cel immunoglobuline-achtig Receptor genen

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58646
Automatic Translation
1,2,3,4, 1, 1,5, 1,6, 1,7, 1
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

Kwantitatieve killer cel immunoglobuline-achtig receptor (KIR) semi-automatische te typen (qKAT) is een eenvoudige high-throughput en kosteneffectieve methode kopiëren nummer type KIR genen voor hun toepassing in de bevolking en ziekte vereniging studies.

Abstract

Killer cel immunoglobuline-achtige receptoren (KIRs) zijn een reeks van remmende en activerend immuun receptoren, natural killer (NK) en T-cellen, gecodeerd door een polymorfe cluster van genen op het chromosoom 19. Hun best gekarakteriseerd liganden zijn de menselijke leukocyten antigeen (HLA) moleculen die zijn gecodeerd in de grote histocompatibility complex (MHC) locus op chromosoom 6. Er is aanzienlijk bewijs dat ze een belangrijke rol in de immuniteit, de voortplanting, en de transplantatie spelen, waardoor het cruciale technieken die nauwkeurig genotype kunnen hebben hen. Echter hoge-sequence homologie, zo goed als allèlique en kopie nummer variatie, maken het moeilijk tot ontwerpmethoden die nauwkeurig kunnen en efficiënt genotype alle KIR genen. Traditionele methoden zijn meestal beperkt in de resolutie van gegevens die zijn verkregen, doorvoer, kosteneffectiviteit en de termijnen voor het instellen en uitvoeren van de experimenten. Beschrijven we een methode genaamd kwantitatieve KIR semi-geautomatiseerde te typen (qKAT), die is een high-throughput multiplex real-time polymerase kettingreactie methode die de gene kopie nummers van alle genen in de KIR locus kunt bepalen. qKAT is een eenvoudige high-throughput methode die hoge resolutie KIR nummer gegevens kopiëren, die verder kan worden gebruikt voor het afleiden van de variaties in het structureel polymorfe haplotypes die omvatten van hen kan bieden. Deze kopie nummer en haplotype gegevens kan goed zijn voor studies over grootschalige ziekte verenigingen, populatie genetica, evenals onderzoek naar expressie en functionele interacties tussen KIR en HLA.

Introduction

Bij de mens, de moordenaar immunoglobuline-achtig receptor(KIR) locus is toegewezen op de lange arm van chromosoom 19 binnen de leukocyten receptor complex (LRC). Deze locus is ongeveer 150 kb in lengte en omvat 15 KIR genen gerangschikt hoofd-tot-staart. De KIR loci die momenteel bekend zijn zijn KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, en twee pseudogenes, KIR2DP1 en KIR3DP1. De KIR genen coderen voor tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) domein van de immunoglobuline-achtige receptoren met korte (S; activeren) of lange (L; remmende) cytoplasmatische staarten, die zijn uitgedrukt door natural killer (NK) cellen en deelverzamelingen van T cellen. Kopie nummer variatie tentoongesteld in de KIR locus vormen diverse haplotypes met de inhoud van de variabele gen1. Non-allèlique homologe recombinatie (NAHR), vergemakkelijkt door een nauwe hoofd-tot-staart gene regeling en hoge-sequence homologie, is het mechanisme voorgesteld dat de variabiliteit van de haplotypic wordt belast. Meer dan 100 verschillende haplotypes zijn gemeld in populaties wereldwijd1,,2,,3,4. Alle deze haplotypes kunnen worden onderverdeeld in twee grote groepen: A en B haplotypes. De A-haplotype bevat 7 KIR genen: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1en KIR3DL2, die remmende KIR genen en de activerende KIR zijn gen KIR2DS4. Echter tot 70% van Europese oorsprong personen die homozygoot voor KIR haplotype A uitsluitend voeren een vorm van niet-functionele "verwijdering" van KIR2DS45,6. Alle andere KIR gene combinaties vormen groep B haplotypes, met inbegrip van ten minste één van de specifieke genen van KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, en KIR2DL5, en bevatten meestal twee of meer activerende KIR -genen.

HLA klasse I moleculen zijn geïdentificeerd als de liganden voor bepaalde receptoren van inhiberende (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3en KIR3DL1), activerende receptoren (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, en KIR3DS1), en voor KIR2DL4, die een unieke KIR die bevat een lange cytoplasmatische staarten als andere remmende KIR-receptoren maar heeft ook een positief geladen residu in de buurt van de extracellulaire domein, dat een gemeenschappelijk is functie van andere activerend KIR -receptoren. De combinatie van varianten binnen de KIR genen en de HLA-genen invloeden receptor-ligand interactie die vormen potentiële NK cel reactievermogen in het individuele niveau7,-8. Bewijs van genetische vereniging studies heeft aangegeven dat KIR speelt een rol in virale weerstand (bijvoorbeeld., humaan immunodeficiëntie virus [HIV]9 en hepatitis C virus [HCV]10), het succes van transplantatie 11, het risico op zwangerschap stoornissen en reproductieve succes12,13, de bescherming tegen terugval na Allogene hematopoietische stamcel transplantatie (HSCT)14,15, 16, en het risico van kanker17.

De combinatie van hoge-sequence homologie, allèlique en haplotypic verscheidenheid presenteert uitdagingen in de taak van nauwkeurig genotypering KIR genen. Conventionele methoden typt KIR genen omvatten sequentie-specifieke primer (SSP) polymerase kettingreactie (PCR)18,19,20, reeks-specifieke oligonucleotide probe (SSOP) PCR21, en matrix geassisteerde laser desorptie ionisatie-time van de vlucht de Spectrometrie van de massa (MALDI-TOF MS)22. De nadelen van deze technieken zijn dat ze alleen gedeeltelijke inzicht geven in het genotype van een individu terwijl ook moeizaam om uit te voeren. Volgende-generatie sequencing (NGS) is onlangs de KIR locus specifiek typt u toegepast. Terwijl deze methode zeer krachtig is, kan het duur om uit te voeren, en het is tijdrovend diepgaande analyse en data controles te verrichten.

qKAT is een high-throughput kwantitatieve PCR methode. Terwijl conventionele methoden moeizaam en tijdrovend zijn, deze methode maakt het mogelijk in te voeren bijna 1.000 genomic DNA (gDNA)-monsters vijf dagen en geeft het genotype KIR , evenals de gene exemplaaraantal. qKAT bestaat uit tien multiplex reacties, die elk twee KIR loci richt en één gen van de verwijzing van een vaste exemplaaraantal in het genoom (STAT6) gebruikt voor relatieve kwantificering van het gen KIR kopiëren nummer23. Deze bepaling is met succes gebruikt in studies waarbij grote populatie panelen en ziekte cohorten op infectieziekten zoals HCV, auto-immune aandoeningen zoals type 1 diabetes, en zwangerschap aandoeningen zoals pre-eclampsie, evenals het verstrekken van een genetische onderbouwing aan studies gericht op het begrijpen van de NK-cel functie1,4,24,25,26.

Protocol

1. voorbereiding en Plating uit DNA

  1. De concentratie van de gDNA met behulp van een spectrofotometrische of fluorimetrische instrument nauwkeurig te kwantificeren.
  2. Verdun DNA tot 4 ng/µL op een diep-well 96-wells-plaat. Omvatten ten minste één controlemonster gDNA met een bekende exemplaaraantal en één niet-sjabloon controle.
  3. Centrifugeer de 96-wells-platen bij 450 x g gedurende 2 min.
  4. Elk monster in viervoud op 384-well qPCR platen met behulp van een instrument van liquid handling, afzien, zodat elke goed heeft 10 ng van DNA (2,5 µL per putje). Ten minste tien 384-Wells-platen, één voor elke qKAT reactie voor te bereiden.
  5. Als gDNA is wordt afgezien van meer dan één 96-wells-plaat, voert u een volledige volumes wassen met 2% bleekwater en ultrazuiver water te reinigen van de naalden van de vloeistof handling systeem tussen elke 96-wells-plaat van gDNA monsters.
  6. Het DNA door het broeden van de 384-Wells-platen in een schone omgeving bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur drogen.

2. voorbereiding van de Primers en sondes

Opmerking: qKAT bestaat uit tien multiplex reacties. Elke reactie omvat drie primerparen en drie fluorescentie-geëtiketteerden sondes die twee KIR genen en één verwijzing gene specifiek te versterken. De sondes die werden gepubliceerd in Jiang et al.27 werden gewijzigd zodat de oligonucleotides worden nu aangeduid met ATTO kleurstoffen aangezien zij verbeterde fotostabiliteit en lange signaal levensduur bieden. Pre-aliquoted primer combinaties zijn commercieel verkrijgbaar (Zie Tabel van materialen).

  1. Bereiden primer combinaties voor elke reactie volgens de verdunningen gegeven in tabel 1.
  2. Bereiden sonde combinaties voor elke reactie volgens tabel 1. Elke afzonderlijke sonde alvorens de combinatie test.

3. voorbereiding van de Master-Mix

Opmerking De volumes die hieronder vermeld zijn voor het uitvoeren van een qKAT reactie op een set van 10 x 384-Wells-platen.

  1. Ervoor zorgen dat de gDNA monsters op de 384-Wells-platen verzinkt volledig droog. Uitvoeren van alle stappen op het ijs en houden de reagentia gedekt door blootstelling aan licht zoveel mogelijk aangezien de fluorescentie-geëtiketteerden sondes en thermo-lichtgevoelig.
  2. Ontdooi de qPCR buffer, primer en sonde aliquots bij 4 ° C.
  3. Op het ijs, voorbereiden op een master mix 10 x 384-Wells-platen door toevoeging van 18.86 mL ultrazuiver water, 20 mL qPCR buffer en 1.000 µL van vraag primer combinatie 180 µL van vraag sonde combinatie (tabel 2).
  4. De master mix gelijkmatig verdelen over een goed 96-diep bord met behulp van een precisiepipet meerkanaals, pipetting 415 µL in elk putje. Houd deze plaat in een koelbox gedekt door licht.
  5. Met behulp van een instrument van liquid handling, afzien 9,5 µL van de master mix in elk putje van de plaat 384-well met gedroogde gDNA. Afdichting van de plaat met een folie en plaatst u deze onmiddellijk bij 4 ° C. Herhaal dit proces voor de resterende platen, ervoor te zorgen dat de naalden van de vloeistof handling systeem worden gewassen met water tussen elke plaat.
  6. Centrifugeer de 384-Wells-platen bij 450 x g gedurende 3 min en incubeer hen bij 4 ° C's nachts of tussen 6-12 h resuspendeer de DNA en eventuele luchtbellen te verdrijven.

4. qPCR Assay

  1. Na de overnachting incubatie, centrifugeer bij 450 x g gedurende 3 minuten te verdrijven van eventuele resterende luchtbellen.
  2. Voor de toepassing van de automatisering, verbinden de qPCR machine (b.v., LightCycler 480) een microplate-handler (Zie Tabel van materialen). Programma de microplate-handler de platen in de machine van de qPCR van een gekoelde opslag dok dat is beschermd tegen licht plaatsen.
    Opmerking de testen moeten, in theorie, werken op andere qPCR machines met compatibele optische instellingen.
  3. De volgende fietsen gebruiksvoorwaarden: 95 ° C gedurende 5 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C voor 15 s en 66 ° C gedurende 50 s, met het verzamelen van de gegevens bij 66 ° C.
  4. Zodra de run voltooid is, hebben de robot verzamelen de plaat van de qPCR machine en plaats deze in het Gooi-dock.

5. na uitvoering analyse

  1. Na versterking, het berekenen van de kwantificering cyclus (Cq) waarden met behulp van de tweede afgeleide maximale methode of de methode van Fit-punten met de software van de qPCR machine (Zie Tabel of Materials), de onderstaande stappen.
  2. Open de software van de qPCR en open het bestand experiment opgeslagen reactie voor één plaat in het tabblad Navigator .
  3. Voor de analyse met behulp van de tweede afgeleide maximale methode, selecteer het tabblad analyse en maken een nieuwe analyse methode Abs Quant/Second derivaat Max.
    1. Selecteer in het venster maken nieuwe analyse analyse type: Abs Quant/Second derivaat Max methode, deelverzameling: alle Samples, programma: amplificatie, naam: Rx-DFO (waarbij x het nummer van de reactie is).
    2. Selecteer Filter kam en kies van VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dit zorgt ervoor dat de verzamelde gegevens voor STAT6 is geselecteerd.
    3. Selecteer kleur compensatie voor VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klik op berekenen. Herhaal dit voor Fam (465-510) en Cy5/Cy5.5(618-660). Klik op bestand opslaan.
  4. Voor de analyse met behulp van de methode van Fit-punten, door Abs Quant/Fit punten te selecteren op het tabblad analyse.
    1. Selecteer in het venster maken nieuwe analyse analyse type: Abs Quant/Fit punten methode, deelverzameling: alle Samples, programma: amplificatie, naam: RxF-DFO (waarbij x het nummer van de reactie is).
    2. Selecteer de juiste filters en kleur compensaties voor de STAT6 en elk van de KIR genen (Fam/Cy5). Stel in het tabblad Noiseband de lawaai-band uit te sluiten van de achtergrondgeluiden.
    3. In het tabblad analyse de fit punten ingesteld op 3 en selecteer dat Toon past punten. Klik op berekenen. Klik op bestand opslaan.

6. de uitvoer van de resultaten

  1. In de qPCR-software, open de Navigator tab. Selecteer Resultaten Batch exporteren.
  2. Open de map waarin de bestanden van het experiment worden opgeslagen en de bestanden overbrengen naar de sectie van de rechterkant van het venster. Klik op volgende. Selecteer de naam en de locatie voor het exportbestand.
  3. Selecteer het soort analyse Abs Quant/Second derivaat Max methode of Abs Quant/Fit punten. Klik op volgende. Controleer of de naam van het bestand, de map exporteren en het soort analyse correct zijn en klik op volgende om te beginnen het exportproces.
  4. Wacht totdat het Exporteren Status Ok is. Het scherm gaat automatisch naar de volgende stap. Controleer dat alle geselecteerde bestanden met succes zijn uitgevoerd zodat het aantal bestanden mislukt = 0. Klik op gereed.
  5. Gebruik scripts split_file.pl en roche2sds.pl de geëxporteerde platen gesplitst individuele reacties voor elke plaat.
    Opmerking de scripts worden geleverd op aanvraag/GitHub.

7. Kopieer numerieke berekeningen

  1. Open de kopie nummer analysesoftware (bijvoorbeeld CopyCaller). Selecteer real-time PCR importeren bestand met resultaten en laden van tekstbestanden die zijn gemaakt door roche2sds.pl.
  2. Selecteer analyseren en uitvoeren van de analyse door beide selecteren kalibrator monster met bekende exemplaaraantal of door het selecteren van de meest voorkomende exemplaaraantal. Zie tabel 5 voor de meest voorkomende exemplaaraantal van KIR genen meestal waargenomen in Europese oorsprong populaties.

8.-kwaliteit van de gegevens controleert

  1. R script KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215 gebruiken. R gegevens wilt combineren kopie nummer uit alle platen in een spreadsheet.
    Opmerking de scripts worden geleverd op aanvraag/GitHub.
  2. Controleer opnieuw de onbewerkte gegevens op de kopie nummer-analysesoftware voor monsters die niet aan de bekende koppeling onevenwicht (LD) voor KIR genen (tabel 6 voldoen).

Representative Results

Kopie nummer analyse kan worden uitgevoerd door de bestanden te exporteren naar de kopie nummer analysesoftware, waarmee de voorspelde en geschatte exemplaaraantal op basis van de ΔΔCq-methode.

Het exemplaaraantal kan worden voorspeld dat op basis van de bekende exemplaaraantal van controlemonsters DNA op het bord of door het invoeren van de meest voorkomende gene exemplaaraantal (tabel 5). Figuur 1 toont de resultaten van een plaat voor een reactie die zich richt op KIR2DL4 en KIR3DS1, alsmede het referentie-gen STAT6. De meest voorkomende exemplaaraantal voor KIR2DL4, een kader-gen in de KIR locus, is twee exemplaren, terwijl de meest voorkomende exemplaaraantal voor KIR3DS1, een activerende gen, is één exemplaar. De resultaten in de figuur blijkt de PCR versterking percelen waargenomen op de qPCR-software en de kopie numerieke gegevens gegenereerd uit de qPCR-gegevens. Zoals aangetoond, is de bepaling onderscheid kunnen maken tussen 0, 1, 2, 3 en 4 KIR gene moleculen. De kopie nummer analysesoftware maakt ook een bezichtiging van de verdeling van het exemplaaraantal over de plaat als een cirkeldiagram of een staafdiagram. De werkzaamheid van de kopie nummer voorspelling is lager voor monsters met een hoger exemplaaraantal.

De kwaliteit van alle materialen gebruikt in de reacties, gDNA, buffer, inleidingen en sondes, kan invloed hebben op de juistheid van de verkregen resultaten. Verschil in resultaten is echter waarschijnlijk worden veroorzaakt als gevolg van de variatie in de concentratie van DNA in een plaat. De zuiverheid van de geëxtraheerde gDNA, die kan worden gemeten met behulp van de 260/280 en 260/230 ratio's, kunnen ook een effect hebben op de kwaliteit. Een 260/280 ratio van 1,8-2 en een 260/230 verhouding van 2-2.2 zijn wenselijk. De concentraties van een ongelijke bereik van DNA in een plaat kunnen leiden tot een hoge variabiliteit in de drempel-cyclus (Ct) tussen monsters en blijven in het bereik van de geschatte exemplaaraantal. De resultaten in Figuur 2 blijkt het effect dat de verschillen tussen de Ct -waarden over een plaat kan hebben op de nauwkeurigheid in de voorspelling van het exemplaaraantal. De rode lijn geeft het bereik van de geschatte exemplaaraantal voor een monster en, idealiter, moet zo dicht mogelijk bij integer als mogelijk.

Het aantal gegevens kopiëren, eenmaal geanalyseerd, kunnen worden geëxporteerd als een spreadsheet-bestand in een 96-Wells-indeling. Hebben we een R-script (beschikbaar op aanvraag) gebruikt om de kopie nummer gegevens van alle 10 platen die worden uitgevoerd als een set in een spreadsheet te combineren. Gepubliceerde gegevens over KIRs van voornamelijk Europese oorsprong populaties kan de voorspelling van LD-regels die bestaan tussen verschillende genen in de KIR complexe1. Deze voorspellingen worden gebruikt voor downstream controles kunnen verrichten op de kopie nummer resultaten (tabel 6). Monsters die niet aan de voorspelde LD tussen de genen voldoen kunnen ongewone polymorfisme of haplotypic structurele variaties bevatten. Een stroomdiagram met een beschrijving van het protocol is afgebeeld in Figuur 3.

Een tool genaamd KIR Haplotype id (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) werd ontwikkeld om de toerekening van de haplotypes van de gegevensset. De beschuldiging werkt op basis van een lijst van referentie haplotypes waargenomen in een bevolking van Europese oorsprong1. Echter voorziet het hulpprogramma ook in een aangepaste set referentie haplotypes moet worden gebruikt. Drie afzonderlijke bestanden worden gegenereerd; het eerste bestand bevat alle haplotype combinaties voor een steekproef, het tweede bestand bevat een bijgesneden lijst van de haplotypes-combinaties die de hoogste gecombineerde frequenties hebben en het derde bestand bevat de monsters die haplotypes kunnen niet worden toegewezen. Niet-toewijzing van haplotypes kan worden gebruikt als een indicator van roman haplotypes.

Figure 1
Figuur 1: representatieve resultaten van een plaat voor reactie nummer 5. (A) dit paneel toont amplificatie Staanplaatsen. (B) dit paneel toont kopiëren aantal percelen. (C) dit paneel geeft de kopie nummer verdeling. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: representatieve resultaten van een plaat met een variabele DNA-concentratie voor reactie nummer 5. (A) dit paneel toont amplificatie Staanplaatsen. (B) dit paneel toont kopiëren aantal percelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: stroomdiagram van het protocol qKAT. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Assay Genen Voorwaartse Primers Concentratie (nM) Omgekeerde inleidingen Concentratie (nM) Sondes Concentratie (nM)
No 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150
2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200
2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150
2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150
3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150
2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5b - 2DL 4 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150
2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
Nr 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150
2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150
3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150
2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150
No 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150
2DS4 C5F 250 C5R 250 P5b 150
STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150

Tabel 1: combinatie en concentratie van inleidingen en sondes gebruikt in elke qKAT reactie 27 .

Reactie Primer Aliquots (µL) Sonde Aliquots (µL)
R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 WATER STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60
R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R WATER STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6
2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60
Opmerking: moet 20 µL minder water in de MasterMix
R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 WATER STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60
R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 WATER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60
R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R WATER STAT6F STAT6R P4B P5B - 2L 4 PSTAT6
2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60
R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R WATER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60
R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R WATER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60
R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R WATER STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6
3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60
R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 WATER STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6
2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60
R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R WATER STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6
2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60

Tabel 2: Volumes (µL) van 100 µM stamoplossingen van de primer/sonde aanbrengen van de primer en sonde combinatie aliquots.

Naam Richting 5´ wijziging wijziging van de 3´ Volgorde (5' →3') Lengte TM GC % Exon Positie
P4a Zin FAM BHQ-1 TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA		 27 60 44,4 4 425-451
P4b Antisense FAM BHQ-1 AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		 28 62 50 4 576-603
P5b Zin ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG		 25 60 52 5 828-852
P5b - 2DL 4 Zin ATTO647N BHQ-2 AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG		 25 61 56 5 828-852
P9 Zin ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC		 24 60 62,5 9 1246-1269
PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT		 26 62 50

Tabel 3: lijst van sondes gebruikt in qKAT 1, 27. de fluorescente kleurstoffen gebruikt aan het einde 5' van de oligo sondes P5b, P5b - 2 DL 4, P9 en PSTAT6 waren aangepast aan ATTO kleurstoffen.

Gen Inleidingen Richting Volgorde (5´-3´) Lengte TM GC % Exon Positie Amplicon (bp) Allelen kunnen worden gemist
3DL2e4 A1F Voorwaarts GCCCCTGCTGAA
ATCAGG		 18 52 61,1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038.
A1R Omgekeerde CTGCAAGGACAG
GCATCAA		 19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048
3DP1 A4F Voorwaarts GTCCCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 112 Geen
A5R Omgekeerde GTGAGGCGCAAA
GTGTCA		 18 52 55,6 492-509 Geen
2DS2 A2F Voorwaarts GTCGCCTGGTGA
AATCAGA		 19 49 52,6 4 398-416 111 Geen
A6R Omgekeerde TGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT		 21 51 42,9 488-508 Geen
3DL 3 A8Fa Voorwaarts GTGAAATCGGGA
GAGACG		 18 50 55,6 4 406-423 139 Geen
A8Fb Voorwaarts GGTGAAATCAGG
AGAGACG		 19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905.
A8R Omgekeerde AGTTGACCTGGG
AACCCG		 18 51 61,1 526-543 Geen
3DL1e4 B1F Voorwaarts CATCGGTCCCAT
GATGCT		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089
C1s Omgekeerde GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502
3DS1 B2F Voorwaarts CATCGGTTCCAT
GATGCG		 18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047; 3DL 1 * 054 kan opnemen.
C1s Omgekeerde GGGAGCTGACAA
CTGATAGG		 20 52 55 614-633 Geen
2DL 1 B3F Voorwaarts TTCTCCATCAGT
CGCATGAC		 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028
B3R Omgekeerde GTCACTGGGAGC
TGACAC		 18 50 61,1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030
2DS1 B4F Voorwaarts TCTCCATCAGTC
GCATGAA		 19 51 47.4 4 545-563 96 2DS1 * 001
B4R Omgekeerde GGTCACTGGGAG
CTGAC		 17 49 64,7 624-640 Geen
2DS3 B5F Voorwaarts CTCCATCGGTCG
CATGAG		 18 53 61,1 4 546-563 96 Geen
B5R Omgekeerde GGGTCACTGGGA
GCTGAA		 18 51 61,1 624-641 Geen
2DS5 B6F2 Voorwaarts AGAGAGGGGACG
TTTAACC		 19 50 52,6 4 475-493 173 Geen
B6R3 Omgekeerde TCCAGAGGGTCA
CTGGGC		 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003
2DL 4 C1F Voorwaarts GCAGTGCCCAGC
ATCAAT		 18 52 55,6 5 808-825 83 Geen
C1R Omgekeerde CCGAAGCATCTG
TAGGTCT		 19 52 52,6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019
2DL 2 2DL2F4 Voorwaarts GAGGTGGAGGCC
CATGAAT		 19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009; 782G gewijzigd naar A.
C3R2 Omgekeerde TCGAGTTTGACC
ACTCGTAT		 20 51 45 909-928 Geen
2DS4 C5F Voorwaarts TCCCTGCAGTGC
GCAGC		 17 57 70,6 5 803-819 120 Geen
C5R Omgekeerde TTGACCACTCGT
AGGGAGC		 19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013
2DS4Del 2DS4Del Voorwaarts CCTTGTCCTGCA
GCTCCAT		 19 54 57,9 5 750-768 203 Geen
2DS4R2 Omgekeerde TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Geen
2DS4FL 2DS4FL Voorwaarts CCGGAGCTCCTA
TGACATG		 19 53 57,9 5 744-762 209 Geen
2DS4R2 Omgekeerde TGACGGAAACAA
GCAGTGGA		 20 53 50 933-952 Geen
2DL 3 D1F Voorwaarts AGACCCTCAGGA
GGTGA		 17 48 58,8 9 1180-1196 156 Geen
D1R Omgekeerde CAGGAGACAACT
TTGGATCA		 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 en 2DL 3 * 01802
2DL 5 D2F Voorwaarts CACTGCGTTTTC
ACACAGAC		 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 en 2DL5B * 020
D2R Omgekeerde GGCAGGAGACAA
TGATCTT		 19 49 47.4 1315-1333 Geen
2DP1 D3F Voorwaarts CCTCAGGAGGTG
ACATACGT		 20 53 55 9 1184-1203 121 Geen
D3R Omgekeerde TTGGAAGTTCCG
TGTACACT		 20 50 45 1285-1304 Geen
3DL1e9 D4F Voorwaarts CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068
D4R2 Omgekeerde CCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA		 23 53 43,5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098
3DL2e9 D4F Voorwaarts CACAGTTGGATC
ACTGCGT		 19 52 52,6 9 1203-1221 156 Geen
D5R Omgekeerde GACCTGACTGTG
GTGCTCG		 19 54 63,2 1340-1358 Geen
STAT6 STAT6F Voorwaarts CCAGATGCCTAC
CATGGTGC		 20 54 60 129
STAT6R Omgekeerde CCATCTGCACAG
ACCACTCC		 20 54 60

Tabel 4: sequenties van de inleidingen gebruikt in qKAT 1, 27.

KIR gen 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1
EX9		 3DL 1
EX9		 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4
Totaal		 2DS4
FL		 2DS4
DEL		 3DL 2
EX4		 3DL 2
EX9
Meest voorkomende exemplaaraantal 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2

Tabel 5: Meest voorkomende exemplaaraantal voor KIR genen vaak waargenomen in Europese oorsprong monsters.

Koppeling onevenwicht regels voor qKAT op basis van de Europese bevolking Kopie nummer check
1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 en KIR3DL2 zijn kader genen aanwezig zijn op beide haplotypes. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 en KIR3DL2 = 2
2 KIR2DS2 en KIR2DL2 zijn in LD met elkaar 2DS2=2 DL 2
3 KIR2DL2 en KIR2DL3 zijn allelen van hetzelfde gen 2 DL 2+2 DL 3= 2
4 KIR2DP1 en KIR2DL1 zijn in LD met elkaar 2DP1=2 DL 1
5 Exon 4 van KIR3DL1 en KIR3DL2 is gelijk aan exon 9 van KIR3DL1 en KIR3DL2 respectievelijk. 3DL1ex4=3DL1ex9 en 3DL2ex4=3DL2ex9
6 KIR3DL1 en KIR3DS1 zijn allelen 3 DL 1+3DS1= 2
7 KIR2DS3 en KIR2DS5 zijn in LD met KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5
8 KIR3DS1 en KIR2DS1 zijn in LD 3DS1=2DS1
9 Aanwezigheid van KIR2DS1 en KIR2DS4TOsten is uitsluiten op een haplotype 2DS1+2DS4TOTAL= 2
10 KIR2DS4FL en KIR2DS4del zijn varianten van KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabel 6: koppeling onevenwicht tussen KIR genen vaak waargenomen in Europese oorsprong populaties kunnen worden gebruikt voor het controleren van het aantal gegevens kopiëren 1,27.

Discussion

We beschreven een nieuwe semi-automatische high-throughput methode, genaamd qKAT, dat vergemakkelijkt het nummer typen van het exemplaar van KIR genen. De methode is een verbetering ten opzichte conventionele methoden zoals SSP-PCR, die laag-doorvoer en kunnen alleen wijzen op de aanwezigheid of afwezigheid van deze zeer polymorfe genen.

De juistheid van de verkregen kopie aantal gegevens is afhankelijk van meerdere factoren, met inbegrip van de kwaliteit en concentratie-uniformiteit van de gDNA monsters en de kwaliteit van de reagentia. De kwaliteit en nauwkeurigheid van de gDNA monsters over een plaat zijn uitermate belangrijk, aangezien verschillen in concentratie over de plaat in fouten in de berekening van het exemplaaraantal resulteren kunnen. Aangezien de testen zijn gevalideerd met behulp van Europese oorsprong sample sets, vereisen gegevens van cohorten uit andere delen van de wereld meer grondige controles. Dit is om ervoor te zorgen dat instanties van allel dropout of aspecifieke primer/sonde bindende kopie nummer variatie niet worden geïnterpreteerd.

Terwijl de tests werden ontworpen en geoptimaliseerd voor het uitvoeren als high-throughput, kunnen ze worden gewijzigd voor het uitvoeren van minder monsters. De metriek van het vertrouwen in de kopie nummer analysesoftware wordt beïnvloed als minder monsters te analyseren, maar dit kan worden verbeterd als besturingselement genomic DNA-monsters met een bekende KIR gene exemplaaraantal zijn opgenomen op de plaat en extra monster wordt gerepliceerd zijn opgenomen.

Voor laboratoria zonder vloeistof/plaat-handling-robots, master mix kan worden afgezien van elke gebruik van meerkanaals pipetten en platen handmatig in het qPCR-instrument kunnen worden geladen.

Het voornaamste doel achter de ontwikkeling van qKAT was om een eenvoudige, hoge-doorvoer, met een hoge resolutie en kosteneffectieve methode om genotype KIRs voor ziekte vereniging studies. Dit werd met succes bereikt aangezien qKAT is werkzaam bij het onderzoeken van de rol van KIR in verschillende grote ziekte vereniging studies, met inbegrip van een aantal infectieziekten, auto-immune voorwaarden en zwangerschap stoornissen4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het project kreeg financiële steun van de medische Raad voor onderzoek (MRC), de European Research Council (ERC) kader van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma (grant overeenkomst nr. 695551) en het National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedische Research Centre en NIH onderzoek bloed en transplantatie Research Unit (NIHR BTRU) in het gebied van orgaandonatie en -transplantatie aan de Universiteit van Cambridge en in partnerschap met de NHS bloed en transplantatie (NHSBT). De standpunten zijn die van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs die van de NHS, de NIHR, het ministerie van volksgezondheid of de NHSBT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
Name Company Catalog Number Comments
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938 (2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Tags

Genetica kwestie 145 Immunogenetica killer cel immunoglobuline-achtig receptor (KIRs) kopiëren nummer variatie haplotype menselijke leukocyten antigeen (HLA) natural killer cel kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR)
qKAT: kwantitatieve Semi-automated te typen van Killer-cel immunoglobuline-achtig Receptor genen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di,… More

Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter