Análisis de cortante inducida por el flujo de migración de las células B de zona Marginal de Murine In Vitro
Summary
Las células de la zona marginal B (MZBs) responden a la fuerza de esquileo del flujo por reorientar su ruta de migración el flujo. Este protocolo muestra cómo grabar y analizar la migración utilizando una unidad de fluidos, bomba, sistema de proyección de imagen del microscopio y software libre.
Abstract
Las células de la zona marginal B (MZBs) son una población de células B que residen en las zonas marginal esplénicas de ratón que envuelven los folículos. Para llegar a los folículos, MZBs debe migrar la fuerza de esquileo del flujo de sangre. Aquí presentamos un método para el análisis de esta migración MZB fluir-inducido in vitro. En primer lugar, MZBs están aislados del bazo de ratón. En segundo lugar, MZBs son colocados en ligandos de integrinas en diapositivas cámara de flujo, expuestas al flujo del esquileo y fotografiadas con un microscopio al migrar. En tercer lugar, imágenes de las migración MZBs son procesados utilizando la célula automática MTrack2 seguimiento de plugin de ImageJ y las pistas de la célula resultante se cuantifican utilizando la herramienta de quimiotaxis Ibidi. Los datos de migración revelan cómo rápidamente las células mueven, con qué frecuencia cambian de dirección, si el vector de flujo afecta la dirección de migración y que ligandos de integrinas están involucrados. Aunque utilizamos MZBs, el método puede ser fácilmente adaptado para el análisis de migración de ningún leucocito que responde a la fuerza de esquileo del flujo.
Introduction
Las células inmunes son las células más móviles del cuerpo humano y a menudo deben lidiar con la fuerza de esquileo del flujo sanguíneo y linfático. Sin embargo, hay relativamente pocos estudios sobre la migración de inducida por la fuerza de esquileo de leucocitos1,2,3,4,5. Aquí presentamos un protocolo confiable y cuantitativo para analizar la respuesta de una célula inmune al flujo in vitro. Realizar el análisis no requiere la fabricación de componentes, y todos los equipos y consumibles están comercialmente disponibles. El protocolo, incluyendo análisis de la depuración y migración de la célula, se puede realizar en un solo día. Finalmente, aunque se describe la migración de células B de zona marginal (MZBs), se puede adaptar el protocolo para analizar la migración contra flujo de otros tipos de células inmunes. Por lo tanto, es factible utilizar este ensayo para analizar sistemáticamente una amplia gama de los leucocitos con un panel amplio de condiciones.
MZBs son una población de células B que en el ratón, sólo se encuentran en el bazo y el transporte entre el interior de los folículos y los marginales6,7,8,9. La zona marginal es una capa de células de células inmunitarias aproximadamente 5 – 10 gruesas. La capa de la célula envuelve el folículo y consta principalmente de MZBs y macrófagos, pero también invariantes naturales killer (iNKT) las células T, células dendríticas (DCs) y neutrófilos, entre otros10. Las células de la zona marginal se exponen al flujo unidireccional de sangre procedentes de las arterias esplénicas que terminan en un seno marginal que rodea el folículo. La sangre fluye de los orificios en el seno marginal a través de la zona marginal es recopilada en los senos venosos de la pulpa roja y restaurada la circulación11. El libre flujo de la sangre lava sobre el MZBs y expone a los antígenos en la sangre. El MZBs llevan el antígeno en el folículo por trasladar automáticamente entre la zona marginal y el interior del folículo, que no está expuesto a la sangre. Así, como lanzadera de MZBs hacia el folículo, debe migrar la fuerza de esquileo del flujo arterial12 (figura 1A).
En este protocolo, se describe cómo determinar cuantitativamente cómo las células inmune tales como MZBs respuesta in vitro de alto flujo o no flujo, para revelar cómo están programados para migrar en vivo. En el primer paso, MZBs son purificadas de un bazo de ratón mediante bolas magnéticas acopladas a anticuerpos de kits disponibles en el mercado. MZBs recientemente aisladas son introducidos en el pozo de una diapositiva de la cámara de flujo, les permitió asentarse en ligandos de integrinas y expuestas al flujo del tampón de migración usando un sistema de bomba (figura 2A). Las células son imágenes mediante un sistema de microscopia video Time-lapse. Las imágenes son luego procesadas para el análisis con un plugin gratuito de ImageJ, MTrack213,14, para seguir automáticamente las células. Las pistas pueden cuantificarse entonces la libre Ibidi quimiotaxis herramienta15 para determinar varios parámetros como velocidad, rectitud y el índice de migración. Estos valores pueden utilizarse para determinar los efectos de los inhibidores de la migración, estimuladores de células, quimiocinas y otros productos químicos que afectan la migración en la migración de esquileo del flujo inducido para entender las fuerzas que controlan el movimiento de células inmunitarias en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método para el análisis de la migración de las células que detectan la fuerza de esquileo del flujo y responde modificando su migración. Un análisis de MZBs demostró que MZBs migran espontáneamente en ICAM-1 y en presencia de flujo, migrará el flujo. En nuestro trabajo anterior, mostramos que MZBs no migrar el flujo en VCAM-1, pero en cambio permanecen fijos en su lugar. La zona marginal esplénica murina contiene principalmente ICAM-1, mientras que la pulpa roja contiene ICAM-1 y VCAM-1. De…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la “Deutsche Forschungsgemeinschaft” SFB 854/TP11 a K.-D.F.
Materials
| VWR Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 |
| Pre-Separation Filters, 30 µm | Miltenyi | 130-095-823 |
| MZB and FOB cell isolation kit | Miltenyi | 130-100-366 |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 |
| HBSS | Biochrom | L2035 |
| D-PBS 1x | Gibco by Life Technologies | 14190-094 |
| BSA albumin fraction V, fatty acid-free | Roth | "0052.3" |
| ICAM-1 | R&D Systems | 796-IC-050 |
| Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated | Ibidi | 80601 |
| Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm | Ibidi | 10963 |
| Ibidi Pump system | Ibidi | 10902 |
Riferimenti
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