Summary
Burada, küçük bağırsak hasarının önemli uç noktalarını ve proliferatif belirteçleri ve kemoterapi kaynaklı Mukozit modeli kullanılarak telafi edilen hiperproliferasyonu oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Biz bir hücre döngüsü özel marker kullanarak proliferasyon hücrelerin tespiti ve küçük bağırsak ağırlığı kullanarak göstermek, Crypt derinliği, ve uç noktaları olarak villus yüksekliği.
Abstract
Intestinal adaptasyon, bağırsak travması nedeniyle kaybolduğunda oluşan doğal telafi edici bir mekanizmadır. Crypt hücre proliferasyonu ve artan besin emilimi gibi adaptif tepkiler, kurtarma açısından kritik öneme sahiptir, ancak kötü anlaşılmalıdır. Adaptif yanıtların arkasındaki moleküler mekanizmayı anlamak, adaptasyon geliştirmek için besin veya ilaçların tanımlanması için çok önemlidir. Literatürde farklı yaklaşımlar ve modeller tanımlanmıştır, ancak yeniden üretilebilen veriler elde etmek için prosedürler için ayrıntılı açıklayıcı bir yöntem gereklidir. Burada, küçük bağırsak hasarının önemli uç noktalarını ve proliferatif belirteçleri ve farelerde kemoterapi kaynaklı Mukozit modeli kullanılarak telafi edilen hiperproliferasyonu tahmin etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bir hücre döngüsü belirli marker kullanarak proliferasyon hücrelerin tespiti, yanı sıra küçük bağırsak ağırlığı kullanarak göstermek, Crypt derinliği, ve uç noktaları olarak villus yüksekliği. Açıklanan yöntem içindeki kritik adımlardan bazıları, küçük bağırsak ve bu tekniğin ölçümü için önerilen oldukça karmaşık yazılım sistemi kaldırma ve tartım vardır. Bu yöntemler, onlar zaman alıcı değildir ve maliyet-etkili ve kolay yürütmek ve ölçmek için avantajları vardır.
Introduction
Intestinal adaptasyon, bağırsak hastalığı veya ameliyatı nedeniyle kaybolduğunda oluşan doğal telafi edici bir mekanizmadır1,2. Travma sonrası, bağırsak bir morfometrik ve fonksiyonel adaptif yanıt uğrar, Crypt hücre proliferasyon ve artan besin emilimi ile karakterize3. Bu adım, kurtarma, henüz kötü anlaşılır önemlidir. Bağırsak adaptif tepkisini deneysel çalışmalar fareler, fareler ve domuzlar küçük bağırsak rezeksiyondan sonra meydana gelen değişiklikler üzerinde duruldu, ancak diğer yaralanmalarda adaptif tepki arkasındaki moleküler mekanizmayı anlamak (örn., kimyasal veya bakteriyel) adaptasyon geliştirmek için besin veya ilaçların tanımlanması kolaylaştırmak için çok önemlidir. Deneysel olarak, histopatolojik Puanlama ve yaralanma sonucunu ölçme dahil olmak üzere küçük bağırsak patolojisinin kompleks moleküler ve hücresel indeksi tanımlamak için farklı yaklaşımlar kullanılmıştır. Buna rağmen, literatürden eksik olan şey, tekrarlanabilir veriler elde etmek için gereken yordamları nasıl gerçekleştirebileceğiniz hakkında ayrıntılı bir açıklamasıdır. Bağırsak hormonları, kolay, düşük maliyetli ve yeniden üretilebilen hayvan modeli gibi adaptasyon faktörleri tanımlanırken, burada kemoterapi kaynaklı intestinal Mukozit (CıM) modelini kullanmanızı öneririz.
Hem yaralanma hem de adaptasyon için en basit ve çok bilgilendirici uç noktaların biri ince bağırsak kütlesini ölçmek için (sı). Biliyoruz ki, mukozisin bir damgasını, enterositlerin apoptozis, zamana bağlı villus atrofisi ve azaltılmış mitozis vardır. Bu nedenle, bağırsak morfolojisi incelendiğinde,4,5preklinik modellerde oldukça ilgilidir. İnsanlarda, plazma Citrulline bir düşüş, işleyen bir enterositlerin bir marker, toksisite puanları ve inflamatuar işaretçileri ile ilişkilendirir6 absorptif kapasiteye ek olarak7, bu amino asit öneren mükemmel bir biyomarker olduğunu Mukozit. Citrulline hem fareler ve fareler ölçülür, ve villus uzunluğu8ile mükemmel korelasyonlar göstermiştir, Crypt Survival9, ve radyasyon kaynaklı Mukozit10.
Plazma sitrulin ölçme büyük bir avantajı bir hayvan tekrarlayan ölçümler toplamak için yeteneğidir. Ancak, farelerde birden fazla kan örnekleme 6 μL/g/hafta toplam kan hacmine sınırlıdır ve genel anestezisi gerektirir. Bu maalesef aynı zamanda fareler sitrulline ölçümleri kullanımını sınırlar. Ayrıca, sitrulin ölçümü, pahalı ve zaman alıcı olan yüksek performanslı sıvı kromatografi11,12gerektirir. Son zamanlarda, farelerdeki sitrulin düzeylerinin sı ağırlığı (p < 0,001) (yayınlanmamış veriler) ile önemli ölçüde korelasyon gösterdiğini, sitrulin enterocayt kütlesini yansıtan doğrudan bir ölçüm yapmasını göstermiştir. Sı ağırlığı ölçümü için bir sınırlama farelerin feda edilmesi zorunluluktur ve böylece aynı fare içinde tekrarlanan ölçümler mümkün değildir. Yine de Yöntem Araştırma sorusu yönlendirilmiş diğer doku analizleri çeşitli gerçekleştirmek için imkanı sağlar, ve bu gerçekler makul hayvanların ek kullanımı için telafi edebilirsiniz. Biz, bu nedenle, kolay, düşük maliyetli ve hızlı yaralanma ve fare adaptasyon biyomarker sı ağırlığı kullanarak öneririz. Tekrarlanabilirlik ve kabul edilebilir analitik varyasyonu sağlamak için, bağırsak dikkatli bir şekilde hayvandan çıkarılmalı, tuz ile temizlendi, boşaltılmış ve Tartmadan önce kurutulur. Bu makalede, bu yordamın tam olarak nasıl gerçekleştirildiği gösterilir.
Başka bir Mukozit damgasını, kripterlerde proliferasyon hücrelerinin kaybı ve rejeneratif dönemde telafi edici bir hiperproliferasyonu3. Hücresel Marker Ki67, İmmünohistokimya13ile hızlı proliferatif hücreleri belirlemek için sıklıkla kullanılmıştır. Ki67 proliferasyon basit bir marker olsa da, Ki67 olarak hücre döngüsünün tüm aktif aşamaları (G1, S, G2 ve M)14olduğu gibi hassas bir eğilim vardır. Belirli etiketleme, çoğalan hücreleri tespit etmek için gereklidir, bu nedenle S-faz15' teki hücreleri çoğalarak büyük ölçüde kısıtlandığı için, 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), trimidinin sentetik bir analininin situ birleştirmesi öneriyoruz. BrdU hayvanlarda enjekte edilir 150 ödün vermeden önce ve hücreler daha sonra BrdU spesifik antikorlar kullanarak immünhistokimya ile tespit edilebilir. Bu yöntem makalesinde, ücretsiz bir görüntü yazılımı kullanarak bir crypt içinde BrdU immünopozitif hücrelerin alanını ölçmek için tam olarak nasıl gösterir.
Morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler genellikle intestinal adaptasyon villus yüksekliği ve Crypt derinliği tarafından değerlendirilir 5-FU indüklenen Mukozit modelleri, incelenmiştir. Bu çalışmada, yaralanma aşamasına eşit olan Mukozit akut fazında, BrdU birleşmesi ile ölçülen proliferasyon Crypt derinliği ile ilişkili değildir. Bunun aksine, Crypt derinliği, İndüksiyondan 3 ila 5 gün sonra Mukozit onarımı aşamasında görülen proliferasyon ile önemli ölçüde ilişkilidir. Bu, mukozitte akut fazın tek başına derinlik ile ölçülebilir olmadığını göstermektedir. Mukozit fareler akut aşamasında bir uç nokta olarak proliferasyon kullanırken, BrdU kuruluş tercihen kullanılmalıdır ancak rejeneratif faz sırasında daha sonraki aşamada hiperproliferasyon niceleme zaman, Crypt derinliği makul bir BrdU kuruluş alternatifi. Bu çalışmanın amacı, bu modeli tüm araştırmacılar tarafından, hem onkoloji alanında hem de özellikle bağırsak yaralanması modellerini aşina olmayan araştırmacılar tarafından kullanılabilecek şekilde açıklamak oldu.
Açıklanan model vücut ağırlığı, sı ağırlığı ve uç noktaları olarak Crypt derinliği kullanarak uyarlanabilir tepkiyle göre fenotip transgenik modeller için kullanılabilir. Örnek olarak, burada 5-fluorourasil (5-FU) kaynaklı Mukozit modelinin yetersiz L-hücreli salgılanması16ile hücresel bir vuruş modelinde nasıl kullanıldığını göstereceğiz. Glukagon-like peptid-1 (GLP-1) ve glukagon-benzeri peptid-2 (GLP-2), gıda alımı için yanıt olarak enteroendokrin L-hücrelerinden ortak salgılanan intestinal hormonlardır17,18. GLP-2 intestinal şifa için önemli bir faktör olarak kabul edilir, mukozal apoptozis düzenlenmesi ve bariyer işlevinin iyileştirilmesi sı19,20,21,22. Literatüre dayanarak, endojen hormonların yaralanmadan sonra uyarlanabilir tepki içinde meydana gelen telafi edici hiperproliferasyon için gerekli olduğunu hipotez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Açıklanan tüm yöntemler, hayvan deneyleri (1987) yöneten Danimarkalı mevzuat kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmalar Danimarka hayvan deneyler müfettişinin (2013-15-2934-00833) ve Yerel Etik Komitesinin izni ile yapıldı.
Not: kadın C57BL/6J fareler (~ 20 − 25 g) elde edilmiş ve Standart 12 saat ışık, 12 h karanlık döngüsü ücretsiz su ve standart Chow erişimi ile kafes başına sekiz barındırıldı. Hayvanlar deneyler başlamadan önce bir hafta boyunca boyunca uyum sağlamasına bırakılmıştı.
1.5-fluorourasil kullanarak Mukozit indüksiyon
- 50 mg/mL çözeltisi içinde 5-fluorourasil (5-FU) elde edilir.
- Farelerin vücut ağırlığını tartın ve kaydedin. Vücut ağırlığı, enjeksiyon için 5-FU miktarını hesaplamak (örneğin, 400 mg/kg).
- 27 G x 30 mm iğne bağlı 1 mL şırınga hazırlayın ve enjeksiyon için 5-FU hesaplanan miktarı ile şırınga doldurun.
- Fare scruff yöntemi ile restrain. Bunu yapmak için, bir elle kuyruğun tabanı kapmak ve bir tel çubuk kapağı gibi bir Toe-kavrama yüzeyine yerleştirin. Kuyruğunu bir elinizle konumlandırırken, boynun scruff 'ı diğer el ile tutun.
- Parmağınızın gövdesini, öndeki ve başparmak geri mümkün olduğunca uzatarak tek el üzerinde sıkıca konumlandırın. Fareyi güvenli hale getirmek için kuyruğunu aynı elin parmaklarının arasına yerleştirin.
- Bir firma ama nazik kavrama fare korurken, fare ventral tarafı maruz ve karın alt sağ veya sol çeyreğinde intraperitoneal boşluğa iğne yerleştirin. Uygun yerleştirme sağlamak ve 400 mg/kg 5-FU enjekte aspirate.
2. doku koleksiyonu
- Tuz çözeltisi (0,9% NaCl) seyreltilmiş ketamin/xylazine (100/10 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyon ile fareyi anestezize. Tutam çekme refleksi gözlemleyerek anestezinin derinliğini izleyin.
Not: anestezi, iyileşme olmayan bir anestezdir. - Anestezize fare ağırlığı kaydedin.
- Fareyi bir sırtüstü konumuna getirin ve abdominal boşluğu açığa çıkarmak için bir laparotomi gerçekleştirin, ardından akciğer boşluğunun bir kesi ile pnömotoraks tanıtın.
- Makas kullanarak, diyaframı keserek hayvanı feda etmek.
- İnce bağırsak çıkarın. Pirus üstün kes, dikkatle çekum ulaşılana kadar ince bağırsak uzak karkas geri çekin ve çekum hemen önce bir kesim yapmak.
- Forseps kullanarak, yavaşça proksimal lümen kapalı kelepçe. 25 G iğneli 1 mL şırıngayı kullanarak, dışkı çıkarmak için ince bağırsakları tuzlu tuz ile yıkayın.
- Cerrahi enstrümanlarla bağırsak lümeninden tuzlu tuzu yavaşça çıkarın.
- Dikkatle aşırı tuz kaldırmak için temiz Blot kağıt üzerine ince bağırsak yerleştirin.
- Temizlenen dokusunun ağırlığını kaydedin.
- Vücut ağırlığı yüzdesi olarak temizlendi küçük bağırsak ağırlığı hesaplayın.
3. ince bağırsak histolojisi
-
Doku hazırlama
- Bir duman kaputu içinde, duodenum, jejunum ve ileum ve% 10 formalin, oda sıcaklığında 24 saat için sabitleme bölümlerinden her fare, temizlendi bağırsak dokusunun 3 cm bölümlerini kesmek için makas kullanın.
Not: sabitleme hacmi doku hacminin 5 − 10 kez olmalıdır. - Sabit dokusu bir kesme tahtasında aktarın.
- Bir neşter kullanarak, yaklaşık 1 cm doku kırpma ve gömme kaset içine transfer.
Not: kaset, kalem içinde örnek kimlik (KIMLIK) ile etiketlenmiş olmalıdır. - % 70 etanol içinde kaseti ve 4 °C ' de depoyla daha fazla işleme kadar Submerge.
- Bir duman kaputu içinde, duodenum, jejunum ve ileum ve% 10 formalin, oda sıcaklığında 24 saat için sabitleme bölümlerinden her fare, temizlendi bağırsak dokusunun 3 cm bölümlerini kesmek için makas kullanın.
-
Parafin içinde doku gömme
- Artan alkol çözeltileri yerleştirerek doku kurutmak. 1 saat için% 70 etanol, 1 saat için% 80 etanol, 1 saat için% 95 etanol ve 1,5 h için% 100 etanol için kasedi yerleştirin.% 100 etanol için ksile, 1,5 h için kasedi aktarın.
- Kasetini 58 − 60 °C arasında ısıtılan parafin mumu ile batırın. Bir enine yönde doku konumlandırmak için forseps kullanın ve katı kadar 24 saat soğutmak için blokları bırakın.
-
Mikrotome kullanarak doku kesme
- Yer bloğu, 5 dakika boyunca buzlu doku yüzü. Microtome kullanarak, doku yüzeyini açığa çıkarmak için 10 − 30 μm kalınlığındaki parafin bloklarını kırpın.
- 3 − 5 μm arasındaki doku bloğunun çapraz bölümlerini kesebilir, duodenumdan, jejunum ve ileum 'dan enine bölümler yapılır.
- 40 − 45 °C arasında yer alan bir su banyosuna parafin şeridi yerleştirin. Bölümleri ayırmak için forseps kullanın.
- Su bölümlerini almak için mikroskop slaytlar kullanın.
- Hava, boyaymadan önce 30 dakika boyunca kaydırarak kurutur.
Not: daha uzun bir süre boyunca depolama Için, slaytlar bir buzdolabında saklayın.
-
Hematoxylin-dokuların eozsin boyama
- Mikroskop slaytlarını Histoloji beşiğine yerleştirin. 60 °C ' de 60 dakika için bir Isıtma kabinindeki slaytları deparaffinize et.
Not: doğrudan buzdolabında slaytlar bir Isıtma kabine yerleştirmeden önce oda sıcaklığına ulaşmak için bırakılmalıdır. - Duman kaputu içinde, bir temizleme ajanı (malzeme tablosu) 3 değişikliklerde doku rehidrat, ilk Temizleme Aracı kavanoz 20 dips yapmak ve sonra onları 7 − 8 dakika her iki ek temizleme aracı kavanoz içinde stand izin. Azalan alkol çözümleri için slaytlar transfer,% 99 etanol 3 değişiklik ile başlayan,% 96 etanol ve% 70 etanol 2 değişiklik izledi. Her kavanozda en az 20 dips yapın. Akan suya aktar ve slaytların 5 dakika durmaya izin ver.
- Slaytları süzülmüş Meyer 'in hematoksilen 1 dakika boyunca batırın.
- 5 dakika için musluk suyu çalışan örnekleri yıkayın.
- 1 − 2 dakika boyunca eozin lekelenme kısımlarını daldırın, ardından musluk suyuna durulayın.
- Artan alkol çözeltileri yerleştirerek doku kurutmak. % 70 etanol ile başlayın, takip 96% etanol,% 96 etanol, ve 4 kez% 99 etanol. Her kavanozda en az 20 dips yapın ve beşik 99% etanol içinde onlar monte kadar stand izin verin.
- Küçük bir miktar montaj ortamını slaytların yüzeyine uygulayarak montaj kaplamaları. Lamel magazini altında kabarcıklar oluşturmadan montaj ortamının üstüne lamel magazini koyun. 24 saat kurumasına izin verin.
- Histolojik fotoğraflar elde etmek için bir kameraya bağlı ışık mikroskobu kullanarak dokusu inceleyin. Doku slaytının tam kapsama alanına ulaşılana kadar anlık görüntü almak için 10X objektif kullanın.
- Mikroskop slaytlarını Histoloji beşiğine yerleştirin. 60 °C ' de 60 dakika için bir Isıtma kabinindeki slaytları deparaffinize et.
4. crypt derinliği ve/veya villus yüksekliği ölçümü
- Analiz yazılımını indirin ve yükleyin (örn., Zen Lite, malzeme tablosu).
- Resmi yazılımla açın ve kameraya bağlanın. 20X amacı ile kamera modunda anlık görüntüleri alın.
- İşleme modunda anlık görüntüyü açın.
- Crypt derinliğini ölçmek için: 2D görünümünde, grafik sekmesinden çizgi aracını seçin. iyi odaklı Crypt seçin ve bir villus alt satırında başlatmak ve Crypt alt kısmında bitirmek. 20 iyi odaklı kripts için bu eylemi tekrarlayın (Tamamlayıcı Şekil 1).
- Villus yüksekliğini ölçmek için: 2D görünümünde, grafik sekmesinden çizgi aracını seçin. iyi odaklı bir villus seçin ve luminal projeksiyon sonunda hattı başlatmak ve Crypt başlangıcında bitirmek. Bu eylemi 20 iyi oryantasyonlu Villi için tekrarlayın (Tamamlayıcı Şekil 1).
- Ölçümleri görüntülemek için 2B görünümden ölçü birimi görünümüne geçin.
- Ölçümleri dışa aktarın ve Crypt derinliği ve villus yüksekliği ortalamasını hesaplayın.
5. immunohistokimya tarafından BrdU ölçümü (proliferasyon)
- BrdU çözeltisi enjeksiyon
- Farelerin vücut ağırlığını tartın ve kaydedin.
- Bir duman kaputu, fosfat tamponlu tuzlu (PBS)% 0,5 w/v bromodeoxyuridine (BrdU) çözeltisi temsili bir miktar hazırlayın.
- Duman kaputunda, intraperitoneal enjeksiyonu ile 50 mg/kg BrdU enjekte edilir.
Not: her fareyi tam 150 min sonrası BrdU enjeksiyonu ile ötenize olduğundan emin olmak Için, doku koleksiyonunu düzgün bir şekilde gerçekleştirmek için, her fareyi 10 − 20 dk. aralıkla arkaya enjekte edin. - Enjeksiyon süresini kaydedin.
- 150 dakika bekleyin, sonra fareler anestezi ve 2.1 − 2.7 adımda açıklandığı gibi doku toplamak. 5,2 bölümünde açıklandığı gibi BrdU immünhistokimya gerçekleştirin.
- BrdU immünhistokimya
- Dokusunu 3.1.1 − 3.3.4 adımda açıklandığı gibi hazırlayın.
- Antijen alımı için, cam Histoloji kavanozu bölümlerinde bir slayt beşiği yerleştirin ve 750 W 'de 1 dakika için bir mikrodalga fırınında EDTA tampon (pH 9) ile doldurun ve ardından 350 W 'de 9 dk. tekrar döngüsü.
Not: doku kurutmaz emin olun, hangi Isıtma arasında kavanozlara daha fazla tampon ekleme gerektirebilir. - 2 − 3 kez Tris-tamponlu tuz ve polisorbat 20 (TBS-T) tamponlarında üç dakika yıkama bölümleri.
- Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için oda sıcaklığında 10 − 15 dakika boyunca 5 damla peroksit bloğu (malzeme tablosu) uygulayın. 2 − 3 kez TBS-T tamponlarında 3 dakika yıkama bölümleri.
- Özel olmayan bağlayıcılığı engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 5 damla kemirgen blok tamponu (malzeme tablosu) uygulayın. 2 − 3 kez TBS-T tamponlarında 3 dakika yıkama bölümleri.
- Bir monoklonal fare Anti-BrdU antikor ile bölümleri inkük 1:500 için 1 h oda sıcaklığında seyreltilmiş. 2 − 3 kez TBS-T tamponlarında 3 dakika yıkama bölümleri.
- 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB) kullanarak immünopozitliği görselleştirerek her slayda 5 damla horserpu peroksidaz uygulayarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye yapın. Bölümleri bir duman kaputunda aktarın, 150 μL DAB ekleyin ve 5 dakika boyunca inküye yapın.
Not: DAB kullanırken her zaman eldiven giyin ve atıkları uygun şekilde atın. - Deiyonize suyun içindeki bölümleri durulayın.
- Doku kurutmak ve adımlar 3.4.6 ve 3.4.7 açıklandığı gibi bir lamel magazini monte.
- İmmünoreactions görselleştirme
- Doku örneğini bir kameraya bağlı ışık mikroskobu ile görselleştirin.
- Tüm bölümlerde 20X amacı kullanarak mikroskop görüntüleri almak ve dosyaları kaydetmek için analiz yazılımını kullanın. JPG formatında.
- Imagej yazılımı içinde bir kalibrasyon aracı olarak kullanılacak bir 20X amacı kullanarak bir aşama mikrometre bir anlık alın.
- BrdU immunoreaktif hücrelerin alanını ölçme
- Imagej yazılımını (malzeme tablosu) yükleyin.
- Imagej 'de bir görüntüye ölçek atama: ımagej dosyasını kullanarak sahne alanı mikrometre görüntüsünü açın | Menü komutunu açın. Düz çizgi seçim aracını seçin.
- Düz aracı seçin ve bilinen bir mesafeyi tanımlamak için mikrometre görüntüsünde düz bir çizgi çizin.
- Analiz menüsünün altında Ölçek ayarla 'yı seçin.
- Bilinen mesafe kutusuna bir değer girin ve uzunluk birimi kutusunda uzunluk birimini tanımlayın. Bu kalibrasyon, bu ımagej oturumunda açılan tüm görüntüler için geçerli olacak şekilde Global 'i seçin.
- Imagej dosyasını kullanarak ilgi alanı görüntüsünü açın | Crypt başına BrdU İmmünoreaktif hücrelerin alanını ölçmek için menü komutunu açın.
- Renk grafiklerini görüntü/tür menüsünün altında 8 bit olarak ayarlayın.
- İşlem/artış kontrastı altında görüntünün kontrastı artırın ve% 0,4 için doymuş pikselleri ayarlayın.
- İmmünopositifliği segmentine ayırmak için görüntüye bir eşik uygulayın. Seçin Image/Adjust altında menü, sonra Threshold ve kırmızı renk seçin (kırmızı gösterilen karanlık alan). Eşik çubuğunu taşıyarak% 10 − 20 civarında bir eşik seçin.
Not: mümkün olduğunca az arka plan ile tüm BrdU pozitif hücreleri içeren bir eşik seçin. Seçilen yüzde tüm bölümler için geçerli olmalıdır. - İyi odaklı Crypt, yani, bozulmamış dokudan tam bir crypt seçin ve çevresindeki alanı işaretlemek için ücretsiz el seçim aracını seçin.
- Eşik alanını ölçmek için analiz sekmesini seçin ve ardından parçacıkları analizedin. Analiz parçacık penceresinde, boyutu 20-sonsuzlukolarak ayarlayın, kutu piksel birimlerinitıklatın, Döngülerliği 0.00 − 1.00olarak ayarlayın ve anahatlara göster 'i ayarlayın. Kutuları görüntüle, sonuçları özetleyinve delikleri Ekle'yi tıklatın.
Not: BrdU pozitif hücreler için değerler, her BrdU pozitif hücre için bireysel ölçümleri gösteren bir sonuç penceresinde otomatik olarak oluşturulur. Ayrıca, BrdU pozitif hücrelerle alan sayısının, Toplam alan, ortalama boyut ve yüzde sayısını gösteren bir Özet penceresi otomatik olarak oluşturulur. - Yeni bir crypt ölçmek için 5.4.10 ve 5.4.11 adımları yineleyin. Tüm ölçülen kript sonuçları Özet penceresinde görüntülenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk deneyde, biz 0 gün farelerde Mukozit indüklenen ve her gün 5 ardışık gün için bir grup fare feda etti. Sı ağırlığını ölçerken, bu parametrenin 2 günden gün 4 ' e kadar, enterocayt kütlesinde bir kayıp olduğunu düşündürmüştür. Biz de 5 gün, sı ağırlığı önemli ölçüde farklı değildi bulundu 0 (tedavi edilmemiş fareler) (Şekil 1). BrdU 'nun birleşmesi ile ölçülen proliferasyon, 1 ve gün 2 ' de neredeyse kaldırılıyordu, ancak 4 ve gün 5 ' te, sırasıyla yaklaşık dört kat ve beş kat artış vardı (Şekil 2). Bu hiperproliferasyon da Crypt derinliği ölçümünde gösterilmiştir (Şekil 3). Crypt derinliği ölçme tarafından gösterilmiyor ne gün 1 ve gün 2, burada Crypt derinliği yaklaşık% 13 azalır ama sağlıklı fareler önemli ölçüde farklı değildi Proliferasyona hücrelerde kaybı. Biz, mukozanın rejeneratif aşamasında BrdU birleşme ve Crypt derinliği arasında güçlü bir korelasyon olduğunu gösterebiliriz, ancak bu bir uç nokta olarak Crypt derinliğinin akut faz uygun olmayabilir gösteren akut faz için sayılmaz Mukozit (Şekil 4).
İkinci çalışmada, biz yetersiz L hücre salgılanması ile transgenik fare modeli mucostis inceledi. Eksik GLP-1 ve GLP-2 ile fareler, vahşi tip (WT) 5-FU fareler (p < 0,01) (Şekil 5A, B) ile karşılaştırıldığında son derece önemli olan iyileşme aşamasında ağır vücut ağırlığı kaybı (BW) ve sı ağırlığı azalma gösterdi. Dahası, transgenik fareler telafi edici hiperproliferasyonu gösteremedi; kripts WT fareler ve sağlıklı kontroller daha önemli ölçüde kısaydı. Bunun aksine WT fareleri, hiperproliferasyon belirtisi olarak Crypt derinliğinde bir artış gösterdi (Şekil 5c).
Şekil 1: küçük bağırsak ağırlığı. Fareler 1 ila 5 gün sonra 5-FU enjeksiyonuna 0 gün sonra kurban edildi ve bağırsak ağırlığı açıklandığı gibi ölçüldü. Sonuçlar ortalama ± standart hata olarak gösterilir (SEM). n = 13. Bu rakam Hytting-Andreasen ve ark.16' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: sı 'nin duodenum, jejunum ve ileum için Crypt başına BrdU immunopositive hücreler. Fareden 1 ila 5 gün sonra 5-FU enjeksiyonu 0 gün feda edildi ve BrdU birleşmesi açıklandığı gibi immünhistokimya tarafından nicelik oldu. Sonuçlar ortalama ± SEM. n = 13 olarak gösterilir. * p < 0,05, * * * p < 0,001 gün 0 ile karşılaştırıldığında (varyans analizi [ANOVA] Dunnett birden fazla karşılaştırma testi izledi). p < 0,001 gün 0 ile karşılaştırıldığında (ANOVA Dunnett birden fazla karşılaştırma testi izledi). Bu rakam Hytting-Andreasen ve ark.16' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Crypt derinliği ölçümü. Fareden 1 ila 5 gün sonra 5-FU enjeksiyonu yaptıktan sonra 0 ' da kurban edildi ve mezar derinliği açıklandığı gibi ölçüldü. Sonuçlar ortalama ± SEM. n = 13 olarak gösterilir. * p < 0,05, * * * p < 0,001 gün 0 ile karşılaştırıldığında (ANOVA Dunnett birden fazla karşılaştırma testi izledi). Bu rakam Hytting-Andreasen ve ark.16' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Crypt derinliği ve BrdU korelasyon. Crypt derinliği (duodenum, jejunum, ve ileum) iki kuyruklu Pearson korelasyon testi kullanarak fedakarlık her gün BrdU kuruluşunda korelasyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: GLP-1 ve GLP-2 eksikliği fareler akut Mukozit sonra yeniden oluşturmak için başarısız. (A) BW (%), (B) sı ağırlığı (g) ve (C) ileum (μm) içinde Crypt derinliği değişimi. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak gösterilir. TG = transjenik fareler; WT = vahşi tip fareler; 5-FU = 5-fluorourasil. n = 4 − 8. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 ile karşılaştırıldığında sağlıklı kontrol (WT tuzlu), a = p < 0,05, aa = p < 0,01, aaa = p < 0,001 WT 5-FU ile karşılaştırıldığında (iki yönlü ANOVA tarafından izlenen Bonferroni çoklu karşılaştırma testi [BW] veya ANOVA takip Dunnett birden fazla comparis test). Bu rakam Hytting-Andreasen ve ark.16' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Tamamlayıcı Şekil 1: akut faz ve mukozanın iyileşme aşaması sırasında, mukozanın indüksiyonunda küçük bağırsak dokusu. (A) tedavi edilmemiş farelerde haemotoxylin ve eozin (H & E) boyama ve (D) BrdU boya. Panelde Siyah noktalı çizgi A iyi odaklı Crypt örneklendirir, noktalı yeşil çizgi iyi odaklı villus gösterir ise. (B) mukozanın akut aşamasında H & E boyama ve (e) BrdU boyama. (C) H & E boya ve (F) Mukozit indüksiyonunda iyileşme aşamasında BrdU boyama. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, bir fare modelinde sı yaralanma ve rejenerasyon çalışması için yaygın olarak erişilebilir bir yöntem göstermektedir. Bağırsak yaralanması preklinik hayvan modelleri çok çeşitli var, ama biz her model benzersiz ve uç noktaları araştırma sorusu cevaplamak için uygun olması gerektiğini anlamak hayati önem taşımaktadır. Bu model yaralanmaya adaptif yanıtı incelemek için mükemmeldir, ancak modeli Mukozit öncesi klinik modeli olarak kullanırken uç noktalar değiştirilmesi gerekir. Ancak hayvan modellerinden hastalara çeviri23' e zorludur. Sı ağırlığı ve proliferasyonu bizim önerilen uç noktaları sadece adaptif yanıt çalışması ile sınırlı olmalıdır. Endojen faktörlerin çalışması genellikle transgenik fareler kullanımı gerektirir, ve küçük bağırsak rezeksiyonu fareler1mümkün olsa bile, bu model sonrası-operatif mortalite önlemek için bir alternatif olabilir. Bu modeli transjenik fareler için uygularken, fareleri dikkatle izlemek ve her gün ağırlığını izlemek önemlidir. Bu çalışmada, bazı fareler kadar kilo kaybı yaşadı 30%, oldukça önemli olan. Hassas fenotiplerde yüksek mortaliteyi önlemek için, dozaj ayarı gerekli olabileceği için transgenik farelerde pilot çalışmaları yapmanızı öneririz.
Açıklanan yöntem içinde kritik bir adım sı kaldırma ve tartım olduğunu. Bu kaldırma ve işleme aynı şekilde ve aynı araştırmacı tarafından her zaman büyük inter-tahlil varyasyonları önlemek için gerçekleştirilmelidir önemlidir.
Crypt ve villus seçiminin tutarlılığı, Crypt derinliği ve villus yüksekliğini ölçerken varyans ve önyargı önlemek için önemlidir. Parafin içinde doku Katıştırırken, bağırsak, böylece bozulmamış Villi ve Crypts olasılığını artırmak, enine kesikler yapmak için dik pozisyonda konumlandırılmış. Dokusunun kesildikten sonra, iyi odaklı Crypt ve/veya villus seçilir. Seçim aynı düzlemde tüm Crypt ve villus tam görselleştirme ve Crypt ve villus içinde hücrelerin açık sınırları varlığı dayanmaktadır. Bu yöntem için bir sınırlama, iyi odaklı Crypt ve/veya Villi seçimi beri doku kesme sonra yapılmış bir iyi odaklı Crypt seçerken biraz subjektif bir yaklaşımdır. Bir önceki çalışma24 bu sınırlama aşmak için alternatif bir yöntem sundu, nerede mikrodiseksiyon kullanın. Bu yöntemle, Villi ve kripts bir mikroskop altında gözlemlerken, doku kesilmeden önce seçilir, böylece bozulmamış bir crypt ve Villi dokudan disseke edilmesini sağlamak için mümkün hale.
Miktar BrdU pozitif hücreler için kullanılan önceki yöntemlerin aksine25,26, bu protokol Crypt başına BrdU pozitif hücrelerin alanını açıklar, her Crypt içinde proliferatif hücreler quantitate için hızlı bir yol sağlar. Bu teknik, ancak, bu tekniğin ölçümü için önerilen yazılım daha derin bir bilgi gerektirdiğinden biraz kısıtlayıcı olabilir. Bu protokolün gelecekteki bir uygulaması, BrdU pozitif hücreleri ölçecek ve ölçmek için daha otomatik oluşturulan bir yöntem oluşturmak olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Novo Nordisk merkezi temel metabolik araştırma ve Lundbeck Vakfı 'ndan sınırsız hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
- Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
- Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
- Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
- Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
- Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
- Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
- Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
- Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
- van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
- Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
- Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
- Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
- Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
- Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
- Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
- Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
- Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
- Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
- Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
- Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
- Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).
