È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

7.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/59298

⸱

19 marzo 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 in una pianta commestibile.

Abstract

L'agricoltura molecolare vegetale è l'uso delle piante per produrre molecole di interesse. In questa prospettiva, piante possono essere utilizzati sia come bioreattori per la produzione e la successiva purificazione del prodotto finale e per la consegna orale diretta delle proteine eterologhe quando utilizzo di specie vegetali commestibili. In questo lavoro, vi presentiamo lo sviluppo di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 (T1D) nei sistemi di pianta commestibile utilizzando la tecnologia di pianta decostruito basati sul virus del DNA ricombinante, consegnata con infiltrazione vuoto. I nostri risultati indicano che una barbabietola rossa è un host adatto per l'espressione transitoria di un autoantigen derivato umano associato al T1D, considerato un candidato promettente come un vaccino di T1D. Foglie producendo il autoantigen accuratamente sono stati caratterizzati per la loro resistenza alla digestione gastrica, per la presenza di carica batterica residua e per il loro profilo metabolico secondario, dando una panoramica del processo produttivo per l'uso potenziale di piante per la consegna orale diretta di una proteina eterologa. La nostra analisi ha mostrato quasi completa degradazione del vaccino candidato liofilizzato orale seguendo una digestione gastrica simulata, suggerendo che è necessaria una strategia di incapsulamento nella fabbricazione del vaccino GAD pianta-derivati.

Introduzione

Dopo la rivoluzione di biologia molecolare vegetale del 1980, sistemi basati su impianto per la produzione di prodotti biofarmaceutici possono essere considerati come un'alternativa ai sistemi tradizionali basati su cellule microbiche e mammiferi1. Piante mostrano diversi vantaggi rispetto ai tradizionali piattaforme, con scalabilità, economicità e sicurezza essendo il più rilevanti2. Il prodotto ricombinante può essere purificato da tessuti vegetali trasformati e quindi somministrato, sia per via parenterale o per via orale e, inoltre, trasformata pianta commestibile può essere utilizzata direttamente per la consegna orale. Via orale contemporaneamente promuove l'immunità mucosa e sistemica, ed elimina la necessità per gli aghi e personale medico specializzato. Inoltre, la consegna orale Elimina la complessa elaborazione a valle, che normalmente rappresenta l'80% del costo totale di produzione di una proteina ricombinante3. Tutti questi vantaggi possono essere tradotte in risparmio in produzione, di forniture e di lavoro riducendo i costi di ogni dose, rendendo il farmaco a prezzi accessibili alla maggior parte della popolazione mondiale.

Diverse strategie, sia per la trasformazione stabile ed espressione transitoria, sono state sviluppate per la produzione di proteine ricombinanti in pianta. Fra loro, un sistema di espressione basata su virus ad alto rendimento decostruito pianta (per esempio, magnICON) fornisce prestazioni superiori che portano alti rendimenti di proteine ricombinanti sulle scale cronologiche relativamente breve4. Molti esempi di espressione transiente utilizzando il sistema di espressione basata su virus vegetali in piante di Nicotiana benthamiana sono segnalati, essendo l'host di produzione aurea. Tuttavia, questa pianta di modello non è considerata una specie commestibile a causa gli alcaloidi e altri metaboliti tossici che si accumulano nelle sue foglie.

In questo lavoro descriviamo il confronto tra due sistemi di pianta commestibile, barbabietola rossa (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (Spinacea oleracea cv Industria), per l'espressione delle due forme di candidato dell'isoforma 65 kDa di acido glutammico decarbossilasi (GAD65), l'impianto basato su virus vettori5. GAD65 è un autoantigen principale associato al diabete di tipo 1 (T1D) ed è attualmente sotto inchiesta nei test clinici umani per impedire o ritardare il T1D inducendo tolleranza6. La produzione di GAD65 nelle piante è stata studiata estesamente in specie di piante modello come Nicotiana tabacum e benthamiana N.4,5,6,7. Qui, descriviamo l'uso di specie vegetali commestibili per la produzione della molecola nei tessuti che può essere destinata per una consegna orale diretta. Da un punto di vista tecnico, abbiamo studiato e selezionato il sistema per pianta agroinfiltrazione e la piattaforma di pianta commestibile per la produzione di GAD65 valutando diversi parametri: livelli di espressione della proteina ricombinante, la carica microbica residua nell'impianto tessuto significato per somministrazione orale, la resistenza di GAD65 alla digestione gastrica e la bioequivalenza delle piante trasformate con il tipo selvaggio.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. rossa coltivazione di bietola e spinaci

  1. Coltivare la barbabietola rossa (b. vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (S. oleracea cv Industria) piante in una camera di crescita, utilizzando 150 µE di intensità della luce, 65% di umidità relativa, ciclo luce/buio di 12 h a 23/21 ° C, rispettivamente.
  2. Dopo la germinazione dei semi, fertilizzare le piante due volte a settimana con una soluzione di 1 g/L di un fertilizzante disponibile in commercio (Tabella materiali). Per agroinfiltrazione utilizzare cinque-settimana-vecchio spinaci e bietola rossa sei-settimana-vecchio piante.

2. transitoria espressione attraverso la tecnologia basata su virus decostruito pianta

  1. Costruzione di vettori di espressione di pianta
    1. Introdurre i vettori - il modulo 5' (pICH20111), i 3' moduli (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut e pICH7410.eGFP), preparati come descritto in precedenza1,2,7e il modulo di integrasi (pICH14011)- nel ceppo di GV3101 di Agrobacterium tumefaciens utilizzando tecniche standard. Crescere su LB medium che contiene 50 μg/mL rifampicina e vettore specifici antibiotici appropriati (50 carbenicillina μg/mL per pICH20111, pICH14011 e pICH7410.eGFP), 50 kanamicina μg/mL per pICH31070 per 2 giorni a 28 ° C.
    2. Le colonie di PCR utilizzando i seguenti primer specifici per ogni vettore della Colonia a schermo: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' e 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' per il 3' moduli pICH31070.GAD65mut e pICH31070.∆87G65mut, con una temperatura di annealing di 55 ° C e un tempo di allungamento di 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' e 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' per il terzo 3' modulo pICH7410.eGFP, con una temperatura di ricottura del 53 ° C e un tempo di allungamento di 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' e 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' per il modulo di 5', con una temperatura di ricottura del 53 ° C e un tempo di allungamento di 20 s e 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' e 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' per il modulo di integrasi con una temperatura di annealing di 57 ° C e un tempo di allungamento di 45 s.
    3. Svolgere la reazione di PCR in un volume totale di 20 μL utilizzando il seguente ciclo di reazione specifica: denaturazione iniziale 5 min a 95 ° C, 35 cicli di 30 s a 95 ° C, 30 s alla temperatura di ricottura e il passo di allungamento a 72 ° C (temperatura e allungamento del tempo di ricottura un re specifico per ogni coppia di primer) e un passo di allungamento finale di 7 min a 72 ° C.
  2. Siringa agroinfiltrazione
    1. Inoculare i tre a. tumefaciens trasformanti in 50 mL di LB medium contenente 50 μg/mL rifampicina e le seguenti antibiotici appropriate di vettore specifico: 50 carbenicillina μg/mL per a. tumefaciens trasformato con pICH20111, pICH14011 o pICH7410.eGFP o 50 kanamicina μg/mL per a. tumefaciens trasformato con pICH31070. Crescere di agitazione durante la notte a 28 ° C.
    2. A pellet pernottamento colture batteriche mediante centrifugazione a 4.500 x g per 20 minuti e li risospendere in 100 mL (o due volumi di coltura batterica iniziale) del buffer di infiltrazione contenenti acido 4-morpholineethanesulfonic di 10 mM (MES; pH 5.5) e 10 mM MgSO4, senza considerare la OD600. Incubare le sospensioni a temperatura ambiente (TA) per 3 h.
    3. Mescolare volumi uguali di sospensioni batteriche contenente uno dei tre moduli, GAD65mut, ∆87GAD65mut o eGFP 3' modulo, con 5' modulo e modulo di integrasi. Utilizzare il mix di sospensione per l'infiltrazione di siringa di foglie rosse di bietola e spinaci.
    4. Posto 5 mL di sospensione in una siringa senza ago. Premere la punta della siringa contro la parte inferiore della foglia per piante di barbabietola rossa e spinaci e nel frattempo applicare una leggera contropressione verso l'altro lato della foglia.
    5. Si infiltrano le prime tre foglie completamente espanse a partire dall'apice per ogni pianta. Etichettare le foglie agroinfiltrate con un'etichetta di carta sul gambo foglia. Restituire le piante in una camera di crescita in condizioni standard.
      Nota: Per motivi di salute e sicurezza, indossare guanti e occhiali di protezione durante il processo di infiltrazione.
    6. Agroinfiltrate raccogliere foglie da 4 a 14 giorni dopo l'infezione (dpi) e congelarli in azoto liquido. Negozio tessuti vegetali a-80 ° C.
  3. Agroinfiltrazione vuoto
    1. Crescere separatamente i tre transformants di a. tumefaciens in 50 mL di terreno LB contenente 50 μg/mL rifampicina e appropriato vettore specifico antibiotico agitando una notte a 28 ° C.
    2. Pellet di colture batteriche di notte mediante centrifugazione a 4.500 x g per 20 min. Risospendere il pellet in 1 L di tampone di infiltrazione a un OD600 di 0,35 e incubare le sospensioni a RT per 3 h.
    3. Aggiungere 0.01% v/v del detergente (polisorbato 20) per ogni sospensione. Mescolare volumi uguali di sospensioni batteriche contenente uno dei tre moduli, GAD65mut, ∆87GAD65mut o eGFP 3' modulo, con 5' modulo e modulo di integrasi.
    4. Inserire una pianta (barbabietola rossa sei-settimana-vecchio impianto, vedere sezione 1) nel supporto. Il titolare e posizionarlo sulla cima di un becher contenente il bagno di infiltrazione (2L) per immergere le foglie nella sospensione di infiltrazione.
      Nota: Assicurarsi che tutte le foglie sono completamente immersi nella sospensione batterica. Aumentare il livello con l'aggiunta della sospensione di infiltrazione supplementare se necessario.
    5. Trasferimento del bagno di infiltrazione con la pianta sommersa alla camera di infiltrazione e chiuderlo. Accendere la pompa del vuoto e aprire la valvola di aspirazione del vuoto sulla camera di infiltrazione.
    6. Una volta che la pressione nella camera di infiltrazione è ridotto a 90 mbar, mantenere il vuoto per 3 min. rilascio del vuoto per 45 s. Una volta che la camera di infiltrazione ha restituito alla pressione atmosferica, aprire la camera e rimuovere l'impianto infiltrata dal bagno batterico.
    7. Restituire le piante in una camera di crescita in condizioni standard.
    8. Raccogliere le foglie di agroinfiltrate presso il dpi di massima espressione, secondo la proteina ricombinante e congelarli in azoto liquido. Negozio tessuti vegetali a-80 ° C.

3. analisi di espressione recombinant della proteina

  1. Estrazione di proteine solubili totali (TSP)
    1. Macinare la siringa o vuoto infiltrato rossi foglie di bietola e spinaci, raccolti nei passaggi 2.2.6 e 2.3.8, polvere fine in azoto liquido usando mortaio e pestello. Trasferire la polvere in tubi di plastica da 15 mL e conservare il materiale a-80 ° C.
    2. Aggiungere 900 µ l di tampone di estrazione (50 mM sodio fosfato pH 8.0, Metabisolfito di sodio di 20 mM) a 300 mg di polvere di foglia.
      Nota: Il rapporto tra peso del tessuto di pianta (mg) al volume (µ l) di buffer selezionato è 1:3.
    3. Omogeneizzare la miscela nel Vortex per 1 min, poi Centrifugare a 30.000 x g per 40 min a 4 ° C.
    4. Raccogliere il surnatante in una provetta pulita e conservare a-80 ° C.
  2. Visualizzazione dell'impianto eGFP e quantificazione
    1. Caricare 100 µ l di ogni cucchiaino di estratto ottenuto da eGFP esprimere le foglie, in tre replicati tecnici, su una piastra a 96 pozzetti.
    2. Mettere la piastra a 96 pozzetti in un lettore di fluorescenza e avviare la misurazione. Utilizzare il 485/535 nm set di filtri necessari per la rilevazione della fluorescenza eGFP.
    3. Per la quantificazione assoluta, nello stesso piatto preparare una curva di calibrazione quantità diverse di caricamento (62,5, 125, 500, 750 e 1.000 ng) di un eGFP purificata.
  3. Dosaggio di acido bicinconinico (BCA) per quantificazione TSP
    1. Mescolare 50 parti di reagente A (Tabella materiali) con 1 parte di reagente B (Tabella materiali). Preparare un volume sufficiente di soluzione di lavoro di BCA fresco per i campioni da dosare e gli standard di calibrazione.
      Nota: Il volume di soluzione di lavoro di BCA richiesto per ogni campione è 1,9 mL. Per la procedura standard con 9 standard (tra cui uno spazio vuoto), 17,1 mL di soluzione di lavoro di BCA è richiesto.
    2. Pipettare 0,1 mL di ogni standard (tra cui uno spazio vuoto) e TSP estratti in una provetta etichettata.
      Nota: Come standard di calibrazione, preparare una nuova serie di albumina di siero bovino (BSA) gli standard nella gamma 10-1.000 μg/mL, preferibilmente utilizzando lo stesso diluente come campioni, come l'acqua. Il fusto è costituito da 0,1 mL del diluente utilizzato per standard di calibrazione e preparazione del campione.
    3. Aggiungere 1,9 mL di soluzione di lavoro di BCA e mescolare accuratamente. Coprire le provette e incubare a 37 ° C per 30 min.
    4. Lasciare raffreddare le provette a RT. misurare l'assorbanza a 562 nm di tutti i campioni entro 10 min.
      Nota: Anche a RT, continua lo sviluppo del colore. Non sarà introdotto alcun errore significativo se le misure di assorbanza di tutti i tubi sono fatte entro 10 min.
    5. Sottrarre il valore di assorbanza nm 562 del grezzo dalle letture degli standard e gli estratti TSP.
    6. Nm di trama il 562 corretta lettura per ogni standard sulla sua concentrazione. Determinare la concentrazione di ogni cucchiaino di Estratto di proteine.
  4. Eseguire Coomassie gel che macchia come descritto in precedenza in Gecchele et al.8.
  5. Analisi Western blot
    1. Eseguire l'analisi di western blot come precedentemente descritto nella Gecchele et al.8.
    2. Dopo la separazione elettroforetica delle proteine, trasferirli su una membrana di nitrocellulosa utilizzando tecniche standard. Preparare la soluzione bloccante con latte 4% in tampone fosfato salino (PBS) pH 7,4. Bloccare la membrana con 10 mL di soluzione bloccante a temperatura ambiente per 1 h.
    3. Preparare l'anticorpo primario di coniglio a 1: 10.000 per l'anti-GAD65/67 e anti-LHCB2, che a 1: 20,000 per l'anti-eGFP in 5 mL di soluzione bloccante con 0,1% detergente. Incubare la membrana con le soluzioni di anticorpo primario preparato durante la notte a 4 ° C o per 4 h a temperatura ambiente con agitazione costante.
    4. Scartare l'anticorpo primario e lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuno con blocco soluzione contenente 0,1% detergente.
    5. Preparare la perossidasi di rafano (HRP)-anticorpo anti-coniglio coniugato a 1: 10.000 nella soluzione con 0,1% detergente di blocco. Incubare la membrana per 1,5 h a RT con agitazione costante.
    6. Scartare l'anticorpo secondario e lavare la membrana 5 volte per 5 minuti ciascuno con PBS-T (PBS completati con 0,1% detergente).
    7. Incubare la membrana con una soluzione di luminol disponibili in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Rilevare il segnale utilizzando un sistema di imaging di chemiluminescenza.

4. elaborazione materiale pianta

  1. Raccolto il vuoto agroinfiltrate ∆87GAD65mut-esprimendo la barbabietola rossa lascia presso il picco di espressione (11 dpi) e congelarli in azoto liquido.
  2. Lyophilize le foglie congelate per 72 h a-50 ° C e 0,04 mbar. Conservarli a-80 ° C.
  3. Macinare le foglie polvere fine e conservarla a temperatura ambiente in un contenitore sigillato con gel di silice per escludere l'umidità.

5. analisi di integrità delle cellule e di simulazione di digestione gastrica

  1. Simulazione di digestione gastrica
    1. Pesare 100 mg di foglie di bietola rossa liofilizzato macinato e risospendere esso in 6 mL di PBS (pH 7.4).
    2. Regolare il pH del campione a 2 con 6 M HCl.
    3. Aggiungi pepsina 4mg/mL dalla mucosa gastrica suina in HCl per ottenere una concentrazione finale di pepsina di 1 mg/mL o un rapporto di 01:20 di proteine solubili totali 10 mM. Agitare il campione a 37 ° C per 120 min.
    4. Regolare i campioni a pH 8 con 1 M NaOH per inattivare la pepsina.
    5. Centrifugare 750 aliquote µ l di ogni campione a 20.000 x g per 20 min a 4 ° C. Raccogliere separatamente il surnatante e risospendere il pellet in un unico volume surnatante di tampone di caricamento (1,5 M Tris HCl, pH 6.8, SDS 3%, 15% glicerolo e 4% 2-mercaptoetanolo).
      Nota: Per motivi di salute e sicurezza, indossare guanti e lavorare sotto cappa aspirante per la preparazione del campione.
    6. Analizzare sia il sovranatante e il sedimento risospeso di western blot analisi8.
  2. Analisi dell'integrità cellulare
    1. Preparare due campioni di 100 mg di foglie di bietola rossa liofilizzato macinato e risospendere entrambi in 6 mL di PBS (pH 7.4).
    2. Regolare il pH di solo uno campione 2 con 6 M HCl. Shake entrambi campioni a 37 ° C per 120 min.
    3. Centrifugare 750 aliquote µ l di ogni campione a 20.000 x g per 20 min a 4 ° C. Raccogliere separatamente il surnatante e risospendere il pellet in un unico volume surnatante di tampone di caricamento.
    4. Analizzare sia il sovranatante e il sedimento risospeso mediante western blot.

6. Bioburden dosaggio

  1. Pesare 100 mg di foglie di bietola rossa liofilizzato. Risospendere la polvere in 8 mL di PBS sterile (pH 7,4) e vortex per 1 min.
  2. Preparare il supporto di LB senza antibiotici o contenenti (i) 50 µ g/mL rifampicina, (ii) 50 µ g/mL ciascuno di rifampicina e carbenicillina, (iii) 50 µ g/mL ciascuno di rifampicina e kanamicina o (iv) 50 µ g/mL ciascuno di rifampicina, carbenicillina e kanamicina.
  3. Piastra 1 mL di ogni foglia liofilizzata omogeneato in uno dei 5 selettiva LB media.
  4. Incubare tutte le piastre per 3 giorni a 28 ° C.
  5. Contare le colonie di Agrobacterium coltivate su ogni piatto.
  6. Calcolare e definire le cariche batteriche residue come il numero di unità formanti colonie (CFU) per mL di omogenato foglia liofilizzata (CFU/mL).

7. estrazione del metabolita

  1. Estrazione di metabolita primario
    1. Pesare 30 mg di-80 ° C immagazzinata, agroinfiltrate ∆87GAD65mut-esprimendo il vuoto della polvere di foglia di bietola rossa in un tubo di plastica di 2 mL.
    2. Aggiungere 750 µ l di freddo 70/30 (v/v) metanolo/cloroformio e vortexare per Incubare 30 s. a-20 ° C per 2 h.
      Nota: Tutti i solventi e gli additivi devono essere grado di LC-MS.
    3. Aggiungere la fase superiore idroalcolico 600 µ l di acqua fredda e centrifuga a 17.900 x g a 4 ° C per 10 min. raccolta e trasferimento in una nuova provetta da 2 mL. Scartare la fase chloroformic inferiore e l'interfase.
    4. Mettere i campioni in un concentratore a vuoto per 3 h per far evaporare i solventi.
    5. Dissolva la pallina ottenuta da punto 7.1.4 a 300 µ l di acetonitrile/acqua 50/50 (v/v) e Sonicare i campioni per 3 min.
    6. Passare le soluzioni attraverso filtri a membrana 0,2 μm e metterli in un fisso 300 µ l inserto vetro tubi trasparenti.
  2. Estrazione di metaboliti secondari
    1. Pesare 300 mg di-80 ° C immagazzinata, agroinfiltrate ∆87GAD65mut-esprimendo il vuoto della polvere di foglia di bietola rossa in un tubo di plastica da 15 mL.
    2. Aggiungere 3 mL di metanolo, vortice per 30 s e trattare con ultrasuoni 40 kHz per 15 min.
      Nota: Tutti i solventi e gli additivi devono essere grado di LC-MS.
    3. Centrifugare i campioni a 4.500 x g a 4 ° C per 10 min e trasferire i surnatanti in nuove provette da 15 mL.
    4. Diluito 100 µ l di Estratto 1:3 (v/v) con acqua e filtrare la soluzione attraverso un filtro a membrana 0,2 μm.
    5. Mettere la soluzione in un tubo di vetro dell'inserto 300 µ l fisso trasparente.
  3. Estrazione dei lipidi polari
    1. Pesare 200 mg di-80 ° C immagazzinata, agroinfiltrate ∆87GAD65mut-esprimendo il vuoto della polvere di foglia di bietola rossa in un tubo di plastica da 15 mL.
    2. Aggiungere 200 µ l di acqua e poi 2 mL di metanolo e poi tenere il ghiaccio per 1h.
      Nota: Tutti i solventi e gli additivi devono essere grado di LC-MS.
    3. Vortex per 30 s e trattare con ultrasuoni 40 kHz per 15 min.
    4. Centrifugare i campioni a 4.500 x g a 4 ° C per 25 min. raccolta e trasferimento della fase cloroformica della prova in provette da 2 mL. Scartare la fase superiore idroalcolico e l'interfase.
    5. Mettere i campioni in un concentratore a vuoto per 3 h per far evaporare il solvente.
    6. Dissolva la pallina ottenuta dal passaggio 7.3.5 con 600 µ l di metanolo.
    7. Diluito 100 µ l di Estratto 1:5 (v/v) con metanolo e filtrare la soluzione attraverso un filtro a membrana 0,2 μm.
    8. Mettere la soluzione in un tubo di vetro dell'inserto 300 µ l fisso trasparente.

8. liquido cromatografia spettrometria di massa analisi ed elaborazione dati

  1. Impostare il sistema di LC-MS come consigliato dal fornitore.
    Nota: La sezione di LC è costituito da un autocampionatore accoppiato con HPLC dotato di una colonna di guardia C18 (75 x 2.1 mm, particella 5 µm) davanti a una colonna C18 (150 x 2.1 mm, particella 3 µm) per l'analisi di metaboliti secondari e lipidi polari , mentre con una colonna di guardia HILIC (7,5 x 2.1 mm, 3 µm) davanti a una colonna HILIC (150 x 2.1 mm, particella 2.7 µm). La MS è un spettrometro di massa di trappola ionica munito di un'ionizzazione electrospray (ESI) oppure un fonti di ionizzazione chimica (APCI) pressione atmosferica.
  2. Preparare i solventi appropriati per i gradienti HPLC. Per analisi del metabolita primario, utilizzare formiato di ammonio 20 mM come A solvente; 95% acetonitrile, acqua 5% più formiato di ammonio 10 mM come solvente B. Per l'analisi di metaboliti secondari, utilizzare acqua più 0.05% acido formico (A) e acetonitrile più 0.05% acido formico (B). Per l'analisi dei lipidi polari, utilizzare acqua più 0.05% acido formico (A) e 100% acetonitrile (B).
    Nota: I solventi e gli additivi devono essere grado di LC-MS.
  3. Utilizzare i gradienti riportati nella tabella 1 per l'eluizione metabolita. Insieme la portata a 0,2 mL/min. iniettare 10 µ l di ogni campione per metaboliti secondari e lipidi polari, considerando che iniettare 5 µ l per metaboliti primari.
  4. Preparare un campione di controllo qualità (QC) con parti uguali di diversi campioni per avere una miscela rappresentativa di ogni condizione sperimentale. Analizzare il campione di controllo di qualità durante l'esperimento per monitorare l'efficienza dello strumento. In particolare, inserire l'analisi di un campione QC dopo ogni campione-lotto 10.
  5. Randomizzare i campioni per evitare effetti basati su strumento.
  6. Dopo 9 analisi, inserire una colonna di pulizia ed un'analisi vuota immediatamente dopo.
    Nota: Eseguire una pendenza lenta fra i due solventi con un'eluizione isocratica ad alta percentuale di solvente più forte. Il vuoto è costituito da un'iniezione di un puro metanolo: acqua (50/50, v/v) per migliorare la riproducibilità di tempo di ritenzione nell'analisi che segue.
  7. Impostare lo strumento per acquisire spettri di massa in modalità di ionizzazione positiva e negativa alternativo utilizzando i parametri elencati nella tabella 2.
    Nota: Altri parametri dipendono dalla piattaforma specifica.
  8. Eseguire il successivo trattamento dei dati come spiegato Dal Santo et al.9.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

In questo lavoro, il flusso di lavoro per lo sviluppo di un vaccino orale nei tessuti vegetali commestibili è presentato. Il focus di questo lavoro è l'espressione di una proteina dell'obiettivo in una specie di pianta commestibile host e la caratterizzazione del potenziale vaccino orale.

Il primo passo ha coinvolto la valutazione dell'idoneità della tecnologia di espressione basata su virus della centrale per la produzione di p...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

In questo studio abbiamo mostrato analisi preliminare per la progettazione di un candidato vaccino orale per il diabete autoimmune. La proteina dell'obiettivo per questo esperimento era una forma mutata dell'umana 65 kDa glutammato decarbossilasi, quali produzione e funzionalità sono facilmente rilevabili e misurabili12. Sua espressione nei tessuti vegetali commestibili diversi è stata mediata da vettori5, che mediare un elevato livello di produzione di proteine ricombinant...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto congiunto "L'uso delle piante per la produzione di un vaccino commestibile di diabete autoimmune (eDIVA)" (progetto ID: 891854) finanziato dall'Università di Verona nell'ambito della chiamata 2014.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.2-μ m Filtri a membrana Minisart RC4Sartorius-Stedim17764
2– mercaptoetanoloSigmaM3148Tossico; 4 % per fare tampone di carico con glicerolo, SDS e Tris-HCl
4-Morfolinetsulfonic acid (MES)SigmaM8250pH 5.5
Piastra a 96 pozzettiSarstedt833924
Acido aceticoSigma27221Corrosivo
Acetonitrile LC-MS gradoSigma34967
AcetosyringoneSigmaD134406Tossico - 0,1 M stock in DMSO
Agar Grado batteriologicoApplichemA094915 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, NaCl e triptone
formiato di ammonioSigma70221
Anticorpo anti-eGFPABCamab290
Anticorpo anti-GAD 65/67SigmaG5163
Anticorpo anti-LHCB2AgriseraAS01 003
Blu Brillante R-250SigmaB7920
C18 Colonna Grace   -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Colonna
C18 Colonna di guardiaGrace    -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Guardia  Colonna
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Fertilizzante
Carbenicillina disodicaDuchefa BiochemieC0109Sistema di
imaging a chemiluminescenzaBioRad1708370ChemiDoc Touch Imaging System
CloroformioSigmaC2432
DetergenteSigmaP5927Polisorbato 20
Lettore a fluorescenzaPerkin-Elmer 1420-011VICTOR Multilabel Counter
Acido formico LC-MS gradoSigma94318
GliceroloSigmaG551615 % per fare tampone di carico con Tris-HCl, SDS e 2– mercaptoetanolo
GoTaq G2 polimerasiPromegaM7841
HClSigmaH1758
Colonna HILICAGrace   -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; granulometria 2,7 μ m) Colonna
HILIC GuardColonna Grace    -Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Guardia  Colonna
Anticorpo anti-coniglio coniugato perossidasi di rafano (HRP)SigmaA6154Non congelare/scongelare troppe volte
Autocampionatore HPLCBeckman Coulter    -Sistema Gold 508 Autocampionatore
Sistema HPLCBeckman Coulter    -Sistema Gold 128 Modulo solvente HPLC
IsopropanoloSigma24137Solfato di
kanamicinaSigmaK4000Tossico
KClSigmaP95412 g/L con NaCl, Na2HPO4 e KH2PO4 per rendere PBS
KH2PO4 SigmaP97912,4 g/L con NaCl , Na2HPO4 e KCl per realizzare la soluzione PBS
Loading Buffer
LuminolGe HealthcareRPN2232Preparare la soluzione utilizzando il kit commerciale ECL Prime Western Blotting System
Liofilizzatore5PascalLIO5P0000DGT
Spettrometro di massaBruker -Bruker Esquire 6000; lo spettrometro di massa era dotato di una sorgente ESI e l'analizzatore era una trappola ionica
MetanoloSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Soluzione bloccante del latteRistora    -3 % in PBS
Na2HPO4SigmaS7907Utilizzare con NaH2PO4 per produrre il tampone fosfato di sodio
NaClSigmaS301480 g/L con KCl, Na2HPO4 e KH2PO4 per produrre PBS; 10 g/L per rendere il terreno LB (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, Triptone e Agar Grado batteriologico
NaH2PO4SigmaS8282  Utilizzare con Na2HPO4 per produrre tampone fosfato di sodio; 14,4 g/L per produrre PBS
NaOHSigma S8045
Membrana nitrocellulasiGe Healthcare10600002
Pepsina dalla mucosa gastrica suinaSigmaP7000
Substrato perossidasi ECLGE HealthcareRPN2235Materiale sensibile alla luce
Pompa Pressa per vuotoVWR111400000098
Reagente ASigmaB9643Utilizzare 50 parti di questo reagente con 1 parte di reagente B per preparare la soluzione di lavoro BCA
Reagente BSigmaB9643Utilizzare 1 parte di questo reagente con 50 parti di reagente A per preparare la soluzione di lavoro BCA
RifampicinaDuchefa BiochemieR0146Tossico - 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulfate)SigmaL3771Infiammabile, tossico, corrosivo-10 % di materiale; 3 % per fare tampone di carico con Tris-HCl, glicerolo e 2– mercaptoetanolo
Metabisolfito di sodioSigma7681-57-4
Sistema di sonicazioneSoltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; frequenza 40 khz
SiringaTerumo    -
Trasparente fisso 300-µ Tubi di vetro con inserto a LThermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Regolare il pH con 1N HCl per fare il tampone Tris-HCl, usare 1,5M Tris-HCl (pH 6,8) per fare il tampone di carico con SDS, glicerolo e 2– mercaptoetanolo
TriptoneFormediumTRP0310 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, NaCl e Agar Concentratore sottovuoto di grado batteriologico
Heto3878 F1-3Speed-vac System
Water LC-MS gradeSigma39253
Estratto di lievitoSigmaY13335 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con Triptone, NaCl e Agar Grado Batteriologico
tossica corrosiva infiammabile

Riferimenti

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Vaccino oraleinfiltrazione sottovuotoAgrobacteriumWestern blotdigestione gastricaliofilizzazioneproteina ricombinante
Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.