Espressione transiente in barbabietola rossa di un vaccino di biofarmaceutica candidato per il diabete di tipo 1

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la produzione di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 in una pianta commestibile.

Abstract

L'agricoltura molecolare vegetale è l'uso delle piante per produrre molecole di interesse. In questa prospettiva, piante possono essere utilizzati sia come bioreattori per la produzione e la successiva purificazione del prodotto finale e per la consegna orale diretta delle proteine eterologhe quando utilizzo di specie vegetali commestibili. In questo lavoro, vi presentiamo lo sviluppo di un candidato vaccino orale contro il diabete di tipo 1 (T1D) nei sistemi di pianta commestibile utilizzando la tecnologia di pianta decostruito basati sul virus del DNA ricombinante, consegnata con infiltrazione vuoto. I nostri risultati indicano che una barbabietola rossa è un host adatto per l'espressione transitoria di un autoantigen derivato umano associato al T1D, considerato un candidato promettente come un vaccino di T1D. Foglie producendo il autoantigen accuratamente sono stati caratterizzati per la loro resistenza alla digestione gastrica, per la presenza di carica batterica residua e per il loro profilo metabolico secondario, dando una panoramica del processo produttivo per l'uso potenziale di piante per la consegna orale diretta di una proteina eterologa. La nostra analisi ha mostrato quasi completa degradazione del vaccino candidato liofilizzato orale seguendo una digestione gastrica simulata, suggerendo che è necessaria una strategia di incapsulamento nella fabbricazione del vaccino GAD pianta-derivati.

Introduzione

Dopo la rivoluzione di biologia molecolare vegetale del 1980, sistemi basati su impianto per la produzione di prodotti biofarmaceutici possono essere considerati come un'alternativa ai sistemi tradizionali basati su cellule microbiche e mammiferi¹. Piante mostrano diversi vantaggi rispetto ai tradizionali piattaforme, con scalabilità, economicità e sicurezza essendo il più rilevanti². Il prodotto ricombinante può essere purificato da tessuti vegetali trasformati e quindi somministrato, sia per via parenterale o per via orale e, inoltre, trasformata pianta commestibile può essere utilizzata direttamente per la consegna or....

Protocollo

1. rossa coltivazione di bietola e spinaci

1. Coltivare la barbabietola rossa (b. vulgaris cv Moulin Rouge) e spinaci (S. oleracea cv Industria) piante in una camera di crescita, utilizzando 150 µE di intensità della luce, 65% di umidità relativa, ciclo luce/buio di 12 h a 23/21 ° C, rispettivamente.
2. Dopo la germinazione dei semi, fertilizzare le piante due volte a settimana con una soluzione di 1 g/L di un fertilizzante disponibile in commercio (Tabella materiali). Per agroinfiltrazione utilizzare cinque-settimana-vecchio spinaci e bietola rossa sei-settimana-vecchio piante.

2. transi....

Risultati

In questo lavoro, il flusso di lavoro per lo sviluppo di un vaccino orale nei tessuti vegetali commestibili è presentato. Il focus di questo lavoro è l'espressione di una proteina dell'obiettivo in una specie di pianta commestibile host e la caratterizzazione del potenziale vaccino orale.

Il primo passo ha coinvolto la valutazione dell'idoneità della tecnologia di espressione basata su virus della centrale per la produzione di p.......

Discussione

In questo studio abbiamo mostrato analisi preliminare per la progettazione di un candidato vaccino orale per il diabete autoimmune. La proteina dell'obiettivo per questo esperimento era una forma mutata dell'umana 65 kDa glutammato decarbossilasi, quali produzione e funzionalità sono facilmente rilevabili e misurabili¹². Sua espressione nei tessuti vegetali commestibili diversi è stata mediata da vettori⁵, che mediare un elevato livello di produzione di proteine ricombinant.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.2-μ m Filtri a membrana Minisart RC4	Sartorius-Stedim	17764
2– mercaptoetanolo	Sigma	M3148	Tossico; 4 % per fare tampone di carico con glicerolo, SDS e Tris-HCl
4-Morfolinetsulfonic acid (MES)	Sigma	M8250	pH 5.5
Piastra a 96 pozzetti	Sarstedt	833924
Acido acetico	Sigma	27221	Corrosivo
Acetonitrile LC-MS grado	Sigma	34967
Acetosyringone	Sigma	D134406	Tossico - 0,1 M stock in DMSO
Agar Grado batteriologico	Applichem	A0949	15 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, NaCl e triptone
formiato di ammonio	Sigma	70221
Anticorpo anti-eGFP	ABCam	ab290
Anticorpo anti-GAD 65/67	Sigma	G5163
Anticorpo anti-LHCB2	Agrisera	AS01 003
Blu Brillante R-250	Sigma	B7920
C18 Colonna Grace		-	Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Colonna
C18 Colonna di guardia	Grace	-	Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Guardia  Colonna
CalMag Grower	Peter Excel	15-5-15	Fertilizzante
Carbenicillina disodica	Duchefa Biochemie	C0109	Sistema di
imaging a chemiluminescenza	BioRad	1708370	ChemiDoc Touch Imaging System
Cloroformio	Sigma	C2432
Detergente	Sigma	P5927	Polisorbato 20
Lettore a fluorescenza	Perkin-Elmer	1420-011	VICTOR Multilabel Counter
Acido formico LC-MS grado	Sigma	94318
Glicerolo	Sigma	G5516	15 % per fare tampone di carico con Tris-HCl, SDS e 2– mercaptoetanolo
GoTaq G2 polimerasi	Promega	M7841
HCl	Sigma	H1758
Colonna HILICA	Grace	-	Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; granulometria 2,7 μ m) Colonna
HILIC Guard	Colonna Grace	-	Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Guardia  Colonna
Anticorpo anti-coniglio coniugato perossidasi di rafano (HRP)	Sigma	A6154	Non congelare/scongelare troppe volte
Autocampionatore HPLC	Beckman Coulter	-	Sistema Gold 508 Autocampionatore
Sistema HPLC	Beckman Coulter	-	Sistema Gold 128 Modulo solvente HPLC
Isopropanolo	Sigma	24137	Solfato di
kanamicina	Sigma	K4000	Tossico
KCl	Sigma	P9541	2 g/L con NaCl, Na2HPO4 e KH2PO4 per rendere PBS
KH2PO4	Sigma	P9791	2,4 g/L con NaCl , Na2HPO4 e KCl per realizzare la soluzione PBS
Loading Buffer
Luminol	Ge Healthcare	RPN2232	Preparare la soluzione utilizzando il kit commerciale ECL Prime Western Blotting System
Liofilizzatore	5Pascal	LIO5P0000DGT
Spettrometro di massa	Bruker -		Bruker Esquire 6000; lo spettrometro di massa era dotato di una sorgente ESI e l'analizzatore era una trappola ionica
Metanolo	Sigma	32213
MgSO4	Sigma	M7506
Soluzione bloccante del latte	Ristora	-	3 % in PBS
Na2HPO4	Sigma	S7907	Utilizzare con NaH2PO4 per produrre il tampone fosfato di sodio
NaCl	Sigma	S3014	80 g/L con KCl, Na2HPO4 e KH2PO4 per produrre PBS; 10 g/L per rendere il terreno LB (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, Triptone e Agar Grado batteriologico
NaH2PO4	Sigma	S8282	Utilizzare con Na2HPO4 per produrre tampone fosfato di sodio; 14,4 g/L per produrre PBS
NaOH		Sigma S8045
Membrana nitrocellulasi	Ge Healthcare	10600002
Pepsina dalla mucosa gastrica suina	Sigma	P7000
Substrato perossidasi ECL	GE Healthcare	RPN2235	Materiale sensibile alla luce
Pompa Pressa per vuoto	VWR	111400000098
Reagente A	Sigma	B9643	Utilizzare 50 parti di questo reagente con 1 parte di reagente B per preparare la soluzione di lavoro BCA
Reagente B	Sigma	B9643	Utilizzare 1 parte di questo reagente con 50 parti di reagente A per preparare la soluzione di lavoro BCA
Rifampicina	Duchefa Biochemie	R0146	Tossico - 25 mg/mL stock in DMSO
SDS (Sodium dodecyl sulfate)	Sigma	L3771	Infiammabile, tossico, corrosivo-10 % di materiale; 3 % per fare tampone di carico con Tris-HCl, glicerolo e 2– mercaptoetanolo
Metabisolfito di sodio	Sigma	7681-57-4
Sistema di sonicazione	Soltec	090.003.0003	Sonica® 2200 MH; frequenza 40 khz
Siringa	Terumo	-
Trasparente fisso 300-µ Tubi di vetro con inserto a L	Thermo Scientific	11573680
Trizma Base	Sigma	T1503	Regolare il pH con 1N HCl per fare il tampone Tris-HCl, usare 1,5M Tris-HCl (pH 6,8) per fare il tampone di carico con SDS, glicerolo e 2– mercaptoetanolo
Triptone	Formedium	TRP03	10 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con estratto di lievito, NaCl e Agar Concentratore sottovuoto di grado batteriologico
	Heto	3878 F1-3	Speed-vac System
Water LC-MS grade	Sigma	39253
Estratto di lievito	Sigma	Y1333	5 g/L per rendere LB medium (pH 7,5 con NaOH) con Triptone, NaCl e Agar Grado Batteriologico

tossica corrosiva infiammabile