Summary
우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 박테리아의 단세포 배양을 보여줍니다. 세균 세포를 함유하는 GV는 액적 전달 방법에 의해 제조되었고, 세균 성장의 직접적인 관찰을 위해 유리 기판 위에 지지막 에 고정시켰다. 이 접근은 또한 그밖 세포에 적응할 수 있습니다.
Abstract
우리는 거대한 소포 (GV) 안쪽에 단세포 수준에서 세균성 세포를 배양하는 방법을 개발했습니다. 세균 세포 배양은 자연 환경에서 세균 세포의 기능을 이해하는 데 중요합니다. 기술적인 진보 때문에, 다양한 세균성 세포 기능은 밀폐된 공간 안쪽에 단세포 수준에서 드러나질 수 있습니다. GV는 양과성 지질 분자로 구성된 구형 마이크로 크기의 구획이며 세포를 포함한 다양한 물질을 보유 할 수 있습니다. 본 연구에서, 단일 세균 세포를 액적 전달 방법에 의해 10-30 μm GV로 캡슐화하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 유리 기판 상에서 지지막 상에 고정시켰다. 우리의 방법은 GV 내부의 단일 박테리아의 실시간 성장을 관찰하는 데 유용합니다. 우리는 대장균 (대장균) 세포를GV 내부의 모델로 배양했지만,이 방법은 다른 세포 유형에 적응 할 수 있습니다. 우리의 방법은 미생물학, 생물학, 생명 공학 및 합성 생물학의 과학 및 산업 분야에서 사용될 수 있습니다.
Introduction
단일 세포 수준에서 세균 세포의 배양은 점점 더 주목을 받고 있다. 밀폐된 공간 내부의 단일 세포 수준에서 세균 세포를 배양하면 자형형 가변성1,2,3,4,세포 동작5, 6개 , 7명 , 8개 , 9,항생내성10,11. 배양 기술의 최근 발전으로 인해, 단일 박테리아의 배양은 잘 칩4,7,8,젤 방울12,13과 같은 제한된 공간 내에서 달성 될 수있다 및 물 -에 - 오일 (W/ O) 물방울 5,11. 단일 세균 세포의 이해 또는 활용을 촉진하기 위해 재배 기술의 추가 기술 개발이 필요합니다.
생물학적 세포막을 모방하는 소포는 양서류 분자로 구성된 구형 구획이며 다양한 물질을 보유할 수 있습니다. 소포는 크기에 따라 분류되며 소형 소포(SV, 직경 및 100nm), 대형 소포(LAV, lt;1 μm) 및 거대 소포(GV, >1 μm)를 포함합니다. SV 또는 ROV는 생물학적 세포막(14)에 대한 그들의친화성 때문에 약물 담체로서 일반적으로 사용된다. GV는 또한프로토셀(15) 또는 인공세포(16)의시공을 위한 반응기 시스템으로 사용되어 왔다. 생물학적 세포를 GV내로 캡슐화한 것은 17, 18, 이에 따라 반응기 시스템과 결합될 때 세포 배양 시스템으로서의 잠재력을 보여준다고17,18.
여기서, 실험 적인 절차의 비디오와 더불어, 우리는 GV가 새로운 세포 배양 용기로 이용될 수 있는 방법19를기술합니다. 박테리아를 함유하는 GV는 액적 전달 방법(20)에 의해 제조된 후 커버 유리 에 지지된 막에 고정시켰다. 우리는 실시간으로 GV 내부의 단일 세포 수준에서 세균 성장을 관찰하기 위해이 시스템을 사용했다.
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Protocol
1. 액적 전달 방법에 의한 세균세포를 함유하는 GV의 제조
- 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC, 10 mMM, 1 mL) 및 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올라민-N-[바이오티닐(폴리에틸레네글리콜)-2000] (비오틴-PEG-DSPE, 0.1 mM, 1 mL) 클로로폼/ 메탄올 용액 (2/1, v / v)을 하고 재고를 -20 °C에 보관하십시오.
- 지질 함유 오일 용액의 제조
- POPC 용액의 20 μL과 비오틴-PEG-DSPE 용액의 4 μL을 유리 튜브에 붓습니다(도 1b(i)).
- 유기 용매를 기류에 의해 증발시켜 지질 막을 형성하고 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1시간 동안 건조제에 필름을 배치한다(도 1b(ii)).
참고: 연기 후드에서 유기 용매를 증발할 필요가 있습니다. - 유리 병 (그림1b (iii))에 미네랄 오일 200 μL (0.84 g / mL, 재료표)를 추가합니다.
- 유리 병의 개구부를 필름으로 감싸고 초음파 욕조 (120 W)에서 초음파 처리하여 적어도 1 시간 (그림1b (iii)).) 동안 초음파 처리하십시오. POPC와 비오틴-PEG-DSPE의 최종 농도는 각각 1mMM 및 0.002 mM이다.
- 세균 세포의 사전 배양
- 대장균을 1x LB 배지(효모 추출물 1g, 바토 트립톤 2g, 염화나트륨 2g)를 LB 플레이트에서 200 mL에 접종하고 37°C에서 12-14시간(하룻밤)에 배양합니다.
- 배양 후, 배양 액의 20 μL을 수집하고 신선한 1x LB 배지의 1.98 mL로 전달하고, 세포를 2시간 동안 다시 배양한다.
- 사전 배양 용액의 600 nm(OD600)값에서 광학 밀도를 확인한다(단계 1.3.2에서 제조). OD600 = 1.0-1.5의 배양 전 솔루션을 사용해야 합니다.
- GV의 외부 및 내부 수성 용액의 제조
- 1x LB 배지에 포도당을 용해하여 GV의 외부 수성 용액을 준비합니다.
- 스톡 포도당 용액을 1x LB 배지에서200 mM으로 희석합니다(표 1).
- 자당을 1lb 배지에 용해하여 GV의 내부 수성 용액을 준비합니다.
- 배양 전 용액(OD600 = 1.0-1.5), 자당 용액(500 mM), 및 1x LB 배지(표 1)를 혼합한다. 배양 용액의 최종 OD600 값은 0.01-0.015이어야 하며 최종 자당 농도는 200 mM이어야 합니다.
참고: 삼투압을 피하십시오. 내부 용액과 외부 수성 용액 사이의 농도를 균형 잡을 필요가 있습니다.
- 세균 세포를 포함하는 물 인 오일 (W / O) 방울의 준비
- 지질(POPC 및 비오틴-PEG-DSPE를 함유한 미네랄 오일)을 함유하는 오일 용액의 50 μL에 GV의 내부 수성 용액 2 μL을 0.6 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브(그림 1b(iv))에 첨가한다.
- 튜브를 손으로 탭하여 플라스틱 튜브의 두 성분을 유화합니다(도 1b(v))).
- 세균 세포를 포함하는 GV의 대형
- 1.5mL 뚜껑이 달린 플라스틱 튜브(그림 1b(vi))에 GV의 외부 수성 용액 50 μL을 추가하고 외부 수성 표면에 지질(POPC 및 비오틴-PEG-DSPE가 있는 미네랄 오일)을 함유하는 오일 용액의 150 μL을 부드럽게 층화합니다. (그림 1b(vii)))) 이 샘플을 실온(RT, 25°C)에서 10-15분 동안 인큐베이션합니다.
- 파이펫을 사용하여 오일 및 수성 용액의 계면에 W/O 액적 용액(단계 1.5.2에서 제조)의 50 μL을 추가합니다(도 1b(viii)).
- 데스크탑 원심분리기에서 RT에서 1,600 x g에서 10분 동안 1.5 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브(단계 1.6.2)를 원심분리기(그림 1b(ix)). 원심분리 후, 피펫을 이용하여 1.5 mL 뚜껑이 있는 플라스틱 튜브로부터 오일(상부 층)을 흡인하고, 세균 세포를 함유하는 GV를 수집한다(도 1b(x)).
2. GV 관찰 시스템 준비 (세균 세포 배양 시스템)
-
구성에 대한 작은 소포 (SV)의 준비 ng a 지원되는 이중층 멤브레인
- POPC 용액의 20 μL및 4 μL의 비오틴-PEG-DSPE 용액을 유리 튜브에 붓습니다(단계 1.1에서 GV 제제에 사용되는 것과 동일한 지질 조성물을 사용함).
- 유기 용매를 공기 흐름에 의해 증발시켜 지질 막을 형성하고 이 샘플을 유기 용매를 완전히 증발시키기 위해 1시간 동안 건조기에 놓습니다.
- 유리 바이알에 1x LB 배지(GV의 외부 수성 용액)에 200 μL의 200 μL을 추가합니다.
- 유리 병의 개구부를 필름으로 감싸고 초음파 욕조 (120W)에서 적어도 1 시간 동안 초음파 처리하십시오.
- 100 nm 크기의 미니 압출기 및 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 압출 방법(21)에 의해 SV를 제조한다.
-
수제 챔버의 준비
- 양면 씰(10mm x 10mm x 1mm)에 중공 펀치가 있는 7mm 구멍을 뚫습니다.
- 커버 글래스(30mm x 40mm, 두께 0.25~0.35mm)에 구멍이 있는 양면 씰을 붙여넣습니다.
-
챔버의 구멍에 커버 유리에 지원 되는 이중 층 막의 제조
- 챔버의 구멍에 SV 용액의 30 μL을 추가하고 (섹션 2.2에서 제조) 30 분 동안 RT에서 배양.
- 파이펫팅을 통해 200 mMM 의 포도당 (GV의 외부 수성 용액)을 함유 한 1x LB 배지의 20 μL로 구멍을 두 번 부드럽게 씻으십시오.
-
에 GV의 고정 챔버 구멍의 커버 유리에 지원 되는 이중 층 멤브레인
- 10 μL의 뉴트라비딘을 GV(1 mg/mL)의 외부 수성 용액으로 구멍에 넣고 RT에서 15분 동안 인큐베이션합니다.
- 파이펫팅을 통해 200 mMM 의 포도당 (GV의 외부 수성 용액)을 함유 한 1x LB 배지의 20 μL로 구멍을 두 번 부드럽게 씻으십시오.
- 챔버의 구멍에 GV (단계 1.6.3에서 제조)를 포함하는 모든 용액을 추가하고 커버 유리 (18mm x 18mm, 두께0.13-0.17mm)로 밀봉 (그림 2b).
-
GV 내부의 세균 세포 성장의 현미경 관찰
- 40x/0.6 수치 조리개(NA) 대물 렌즈가 장착된 역현미경으로 미세한 가열 스테이지 시스템을 긴 작동 거리(그림2b)로 설정합니다.
- 챔버를 미세 한 가열 단계 시스템에놓습니다 (그림 2b). 37°C에서 6시간 동안 정적인 상태에서 챔버 내의 세균 세포를 함유하는 GV를 배양한다.
- 과학적인 보완 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라를 사용하여 30분마다 GV 내부에서 세균 세포 성장의 현미경 이미지를 캡처하고 기록합니다.
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Representative Results
액적 전달 방법을 사용하여 단일 세균 세포를 함유하는 GV를생성하는 간단한 방법을 제시한다(도 1). 도 1a는 박테리아를 함유하는 GV의 강수량의 개략적 이미지를 나타낸다. 박테리아를 포함하는 W/O 방울은 GV를 형성하기 위하여 원심분리에 의해 기름 물 (지질 단층) 계면에 걸쳐 전달됩니다. 자당 (내부 수성 용액)과 포도당 (외부 수성 용액)의 밀도 차이는 또한 W / O 방울의 오일 - 물 인터페이스의 교차를 돕습니다. 이러한 용액 간의 농도에 약간의 차이가 있어 GV의 변형및 붕괴를 유발할 수 있기 때문에 내부 및 외부 수성 용액의 삼투압을 모니터링할 필요가 있습니다. 액적 전달 방법에 의해 세균 세포를 포함하는 GV를 제조하기 위한 플로우 차트는 도 1b에나타내고 있다. 이 절차에 따라, 단일 세균 세포를 포함하는 GV는 쉽게 얻을 수 있다.
GV 내의 세균세포 성장을 관찰하기 위해, 현미경 관찰을위해 원래배양시스템을 구축하였다(그림 2). 박테리아를 함유하는 GV를 커버 유리 에 뉴트라비딘으로 코팅된 지지막 표면에 고정시켰다(도2a). 이 고정 기술은 GV의 장기간 관찰을 가능하게했습니다.
단일 세균 세포를 포함하는 다른 크기의 GV의 전형적인 위상 대조 현미경 현미경 이미지는 그림3에 도시되어 있습니다. 이 실험에서, 우리는 또한 10 μm에서 30 μm에 구역 수색하는 크기로 세균성 세포를 포함하는 GV를 장악했습니다. 도 3은 10.7 μm(도3a) 및 28 μm(도3b)의 상이한 크기를 가진 GV 내부의 단일 세포 수준에서 세균 성장을 나타낸다. GV의 두 크기에 대 한, 대장균 세포 는 신장 및 분할 프로세스를 겪었다, 하나 또는 두 개의 대장균 세포 는 6 시간 이상 세포의 매우 큰 수로 성장. 따라서, 대장균 세포는 GV 안쪽에 안정적으로 성장했습니다.
주어진 수의 세균 세포를 포함하는 GV의 상대적 주파수는 도4에 도시되어 있다. 우리의 실험 조건(OD600 = 0.01-0.015)에서, 세균 세포는 얻어진 GV의 약 10%에서 단일 세포 수준에서 캡슐화하였다(빈 GV는 약 80%). 단일 세포 수준에서 캡슐화된 GV는 도4의 인세트로부터 추정된 바와 같이 세균 세포를 함유하는 GV의 약 50%였다.
그림 1: 박테리아를 함유하는 GV의 실험 절차. (a) 액적 전달 방법에 의해 제조된 박테리아를 함유하는 GV의 방식. 박테리아를 포함하는 W/O 마이크로액작은 원심력에 의해 지질 단층 계면을 통과하고 그 때 지질 이중층 막을 형성합니다. (b) 박테리아를 함유한 GV의 합성의 흐름. (i) 지질을 함유하는 유기 용매 (POPC 및 비오틴-PEG-DSPE, 100:0.2 어금니 비). (ii) 유리 병의 하단에 있는 지질 필름. (iii) 지질을 함유하는 오일 용액. (iv) 세균 세포를 함유하는 50 μL의 오일 용액과 2 μL의 내부 수성 용액 (200 mM 자당 및 1x LB 배지)의 혼합물. (v) 손으로 두드리는 유화 (50 회 이상). (vi) 외부 수성 용액의 50 μL (1x LB 배지에서 200 mM 포도당). (vii) 외부 수성 용액상에 150 μL의 오일 용액을 적층. (viii) W/O 액적 용액의 레이어링. (ix) 튜브의 원심분리. (x) 오일의 포부 후 세균 세포를 함유하는 침전된 GV. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: O GV 내부의 세균 세포 배양 시스템. (a) GV는 커버 유리에 비오틴-뉴트라비딘 결합을 통해 지지되는 멤브레인상에 고정된다. GV는 난방 시스템에 의해 배양됩니다. (b) 핸드메이드 챔버를 포함한 관측 시스템의 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 단 하나 박테리아 세포를 포함하는 GV의 위상 대조 현미경 심상 (검은 색 화살표로 표시). 다른 크기의 GV 내부세균 세포 성장의스냅 샷. (a) 소포 크기 = 10.7 μm. (b) 소포 크기 = 28 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: GV당 캡슐화된 세균 세포의 수에 대한 통계적 분석. GV의 상대 주파수는 히스토그램으로 플롯되었다. 인세트: 단일에서 10<세포까지 세균 세포를 포함하는 GV의 상대 주파수의 배율. 총 235대의 GV가 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 외부 수성 용액 | 내부 수성 솔루션 | 최종 | |
| LB 배지가 있는 500 mM 포도당 | 200 μL | – | 200mm |
| LB 매체를 가진 500 mM 자당 | – | 200 μL | 200mm |
| 1x LB 미디엄 | 300 μL | 295 μL | – |
| 배양 전 솔루션(OD600 = 1.0-1.5) | – | 5 μL | OD600 = 0.01-0.015 |
| 총 볼륨 | 500 μL | 500 μL |
표 1: GV의 외부 및 내부 수성 용액의 조성 및 부피.
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Discussion
여기서, 우리는 GV 내부의 단세포 수준에서 세균 세포를 배양하는 방법을 기술한다. 이 간단한 방법은 액적 전달 방법을 사용하여 단일 세포 수준에서 세균 세포를 포함하는 GV를 형성하는 것을 포함한다. 세균 세포를 함유하는 GV를 얻기 위한 다른 접근법과 비교하여, 이 방법은 두 가지 장점이 있다: (i) 개발하기 쉽고, (ii) 샘플 용액의 작은 부피(2 μL)가 GV를 제조하는 데 필요하다. 세균세포를 함유하는 GV를 제조하기 위한 액적전달방법(20)은 고전적인 수화방법(22)과 미세유체학방법(17)보다 간단하다. 예를 들어, 고전적인 수화방법(22)은 GV를 제조하기 위한 간단하고 쉬운 방법이지만, GV내의 물질의 캡슐화 효율은 매우 낮고 적어도 수백 마이크로리터의 샘플이 요구된다. 최근 개발된 셀룰로오스 종이-아베트 수화(23)와 겔 보조 수화24가지 방법은 GV를 제조하기 위한 고전적인 수화 방법(22)에 비해 생체분자의 높은 캡슐화 효율을 갖는다. 그들의 캡슐화 효율은 액적 전달 기술의 그것만큼 높으며, 이 두 가지 방법은 GV 내부의 세포 캡슐화를 허용할 수 있을 것으로 예상된다. 더욱이, 미세유체학적방법(17)은 GV 내부의 단일 세포를 정확하게 캡슐화하고 GV에 물질의 매우 높은 캡슐화 효율을 나타내지만 마이크로 디바이스 및 대형 장치를 제조하기 위한 복잡한 취급 및 기술이 필요합니다. 샘플 부피(적어도 몇 밀리리터)를 튜브로 흐르게 합니다.
이 프로토콜에서, 오일-물 계면의 안정성은 세균 세포를 함유하는 GV를 획득하는 데 중요하다(도 1b(vii))). 많은 GV를 얻으려면 오일-워터 인터페이스를 평평하게 하는 것이 필수적입니다. 따라서 오일 상에 대한 적절한 준비가 필요합니다. 우리는 지질 분자를 완전히 용해시키기 위해 고출력 초음파 욕조 (120W)에서 적어도 1 시간 동안 오일 상을 초음파 처리했습니다. 초음파 처리 직후 외부 수성 용액상에 오일 상을 적층하는 것이 중요합니다 (도1b (vii))).
여기에 설명된 방법에는 두 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, GV는 종종 휴식과 세균성 세포가 외부 수성 용액으로 누출. 이는 GV 형성 중에 일부 W/O 방울이 오일-워터 인터페이스를 통해 전달되지 못하고 파열되기 때문입니다. 이는 액적 전달방법(20)을사용할 때 불가피하다. 또한 관찰 중에 GV가 파손될 수 있습니다. GV 25를 안정화시키는 인공 세포골격을 사용하는 것과 같이 GV의 안정성을 향상시켜야 합니다. 둘째, 캡슐화된 세균 세포의 수는 완벽하게 통제될 수 없습니다. 도 4는 많은 수의 세균 세포가 GV에 캡슐화되었고, 따라서, 액적 전달 방법을 사용하여 GV에서 세균 세포의 수를 조절하기 어렵다는 것을 보여준다. 세포 수를 제어하기 위해 미세 유체 공학 기술을 사용할 수 있습니다.
GV는 다른 물질(겔 방울12,13 또는 W/O 방울5,11)보다더 효과적으로 내부 수성 용액을 제어할 수 있다. 예를 들어, GV의 내부 및 외부 용액의 수성 조건은 멤브레인 투과성(26) 또는 멤브레인 기공(26) 또는 수송기(27)에 의해 촉진되는 투과성에 의해 변경된다. 본 방법에서, 오일 분자(이 경우 미네랄 오일)는막(20)에 남아 있었다. 세균 성장을 위한 영양소 또는 산소의 투과성에 막에 남아 있는 기름의 영향은 불명합니다. 우리는 영양소 또는 산소의 자연 막 투과성을 알지 못하지만, 우리는 성장 매체에 있는 양또는 산소의 양이 본 연구에서 세균 성장을 위해 충분하다고 생각합니다. 영양소 또는 산소의 자연 막 투과성은 세균 성 세포 성장에 대 한 매우 중요 하 고 미래 연구에 대 한 중요 한 주제. 투과성 제어 기술은 겔 액적12,13 또는 W/O 방울5,11을이용한 배양 방법을 사용하여 진행될 수 없다. 따라서 GV는 제한된 공간에서 세균 배양 응용 분야의 첫 번째 선택이 될 것입니다.
우리의 세균 배양 방법은 미생물학19에서 잠재적으로 새로운 개념 및 도구로 그들의 대사 산물을 얻거나 분석하기 위한 알려지지 않은 환경 박테리아를 배양한다. 더욱이, 우리의 세균세포 함유 GV는 생명공학(28)과 상향식 합성생물학(29)을 위한 새로운 도구를 만들기 위한 인공세포모델(GV)과 살아있는 세포(bacterial cell)의 하이브리드 시스템이다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 일본 의 문부과학성(MEXT)의 우수 청년 연구자(리더, 제16812285호)의 우수 청년 연구자 주도 이니셔티브(16812285호)와 젊은 과학자 연구 보조금(18K18157, 16K21034)의 지원을 받았습니다. 일본과학진흥회(JSPS)에서 M.M.까지, MEXT에서 K.K.까지 의학지원(No. 17H06417, 17H06413).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bactotryptone | BD Biosciences | 211705 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 032-21921 | |
| Cover glass (18 × 18 mm) | Matsunami Glass Ind. | C018181 | thickness 0.13–0.17 mm |
| Cover glass (30 × 40 mm) | Matsunami Glass Ind. | custom-order | thickness 0.25–0.35 mm |
| Desktop centrifuge | Hi-Tech Co. | ATT101 | swing rotor type |
| Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) | Nitoms | T4613 | |
| Glass vial | AS ONE | 6-306-01 | Durham fermentation tube |
| Glucose | Wako Pure Chemicals | 049-31165 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| Methanol | Wako Pure Chemicals | 133-16771 | |
| Microscopic heating stage system | TOKAI HIT | TP-110R-100 | |
| Mineral oil | Nacalai Tesque | 23334-85 | |
| Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Objective lens | Olympus | LUCPLFLN 40×/0.6 NA | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids | 610005 | pore size 100 nm |
| sCMOS camera | Andor | Zyla 4.2 plus | |
| Sodium chloride | Wako Pure Chemicals | 191-01665 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemicals | 196-00015 | |
| Ultrasonic bath | AS ONE | ASU-3D | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212750 | |
| 0.6 mL lidded plastic tube | Watson | 130-806C | |
| 1.5 mL lidded plastic tube | Sumitomo Bakelite Co. | MS4265-M | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline | Avanti Polar Lipids | 850457P | POPC |
| 1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti Polar Lipids | 880129P | Biotin-PEG-DSPE |
References
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