Summary
腫瘍の微小環境は、がんの成長と侵攻の不可欠な部分です。癌腫の進行を模倣するためには、生物学的に関連したヒトマトリックスが必要である。このプロトコルは、ヒト平滑筋腫ベースのマトリックスを適用することによって in vitro 三次元スフェロイドの侵襲アッセイの改善を導入する。このプロトコルは、コンピュータベースの細胞浸潤解析も導入している。
Abstract
二次元細胞培養ベースのアッセイは、体外癌研究において一般的に使用されています。しかし、それらは、腫瘍微小環境を形成するいくつかの基本的な要素を欠いている。より信頼性の高いインビトロ結果を得るために、いくつかの三次元 (3D) 細胞培養アッセイが導入されている。これらのアッセイは、癌細胞が細胞外マトリックスと相互作用することを可能にする。この相互作用は、細胞の形態と同様に、増殖および浸潤などの細胞の挙動に影響を与えます。さらに、この相互作用は、いくつかのプロおよび抗腫瘍化分子の発現を誘発または抑制する可能性がある。スフェロイド浸潤アッセイは、癌細胞浸潤を研究するための適切な 3D in vitro 法を提供するために開発された。現在、動物由来マトリックスは、マウス肉腫由来マトリックス (MSDM) およびラットテールタイプ I 型コラーゲンなど、主にスフェロイドの侵襲アッセイにおいて使用されている。ヒト腫瘍微小環境と動物由来マトリックスとの違いを考慮して、良性子宮平滑筋腫組織からヒト子宮筋腫由来マトリックス (HMDM) が開発された。HMDM が MSDM よりも癌細胞の遊走と浸潤を誘導することが示されている。このプロトコルは、HMDM/フィブリンマトリクスを使用して簡単で、再現性があり、かつ信頼性の高い3D ヒト腫瘍ベースのスフェロイドの侵襲アッセイを提供した。また、イメージングと分析に関する詳細な説明も含まれています。スフェロイドは HMDM/フィブリンマトリックス内の U 字形超低アタッチメントプレートに生育し、それを介して侵入する。侵略は ilastik およびフィジーの ImageJ ソフトウェアを使用して毎日イメージし、測定し、そして分析される。アッセイプラットフォームは、ヒト喉頭原発および転移性扁平上皮癌細胞株を用いて示された。しかし、このプロトコルは他の固形癌細胞株にも適している。
Introduction
従来の二次元 (2D) 細胞培養研究は、がん研究に大きく貢献してきました。現在、研究者は、インビボ条件1をよりよく模倣するために三次元 (3d) 細胞培養アッセイに向けてより多くシフトしている。3d 癌細胞培養は、細胞細胞および細胞マトリックス相互作用の点で複雑な腫瘍微小環境をより正確に反映し、遺伝子発現プロファイル、薬剤感受性、およびシグナル伝達経路活性2,3である。
いくつかの3d 細胞培養モデルは、腫瘍組織 explant、チップ上の腫瘍、多細胞腫瘍スフェロイドの3,4などの癌研究に使用されている。多細胞腫瘍スフェロイドは現在広く使用されており、ヒト腫瘍1,5におけるインビボ条件のいくつかの特徴を模倣している。スフェロイド径が500μ m を超えると、低酸素領域や壊死中心も有しており、このようにインビボ腫瘍状況2を表す。
多くの合成物 (例えば、ポリジメチルシロキサン) および動物由来の (例えば、ラットテールタイプ I コラーゲンおよびマウス肉腫由来マトリックス、マトリゲル、MSDM と称される) マトリクスが、3d 細胞培養アッセイ3、6のために開発された、 7、8。これまでのところ、市販のマトリクスはいずれもヒト腫瘍組織から生じたものではない。したがって、それらは、ヒト腫瘍微小環境の特徴を欠く、癌細胞浸潤プロセス8に著しい影響を及ぼす。
Myogel (ヒト子宮筋腫由来マトリックスは、HMDM と称される) をヒト子宮平滑筋腫腫瘍組織9から抽出する。HMDM のタンパク質含量は MSDM と大きく異なることが示されている。実際、HMDM タンパク質の 66% は、MSDM タンパク質とは異なります。一方、ラミニン、IV 型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、nidogen、および表皮成長因子などの一部のタンパク質は、両方のマトリクス10に存在している。さらに、マウスは酵素含量においてヒトとは異なり、ヒトはマウス11よりも78少ないプロテアーゼを有する。
フィブリンは、足場材料12として単独または他の材料と組み合わせて広く使用されてきた。3D 細胞培養アッセイにおいて、商業的に入手可能なヒトのフィブリノーゲンおよびトロンビンは、フィブリンヒドロゲル12を形成するように結合される。
このプロトコルは、以前に導入された3D 腫瘍スフェロイドの浸潤アッセイ7の改善を説明する。この新しいプロトコルは、マウス由来腫瘍マトリックスの代わりにヒト腫瘍由来マトリックスを適用する。また、ilastik およびフィジー ImageJ ソフトウェアを使用したイメージングおよび解析技術も含まれます。このプロトコルは、いくつかの異なる固形癌細胞株のスフェロイドアッセイに使用することができる。それは新しい抗癌療法を開発し、癌細胞の侵略に特定の分子の効果を研究するために生物学的に関連した用具を提供する。
Protocol
1. 多細胞腫瘍スフェロイドの生成
注:このプロトコルは、ここでは UT-SCC-42A および-42B 細胞株と共に実証されているが、他の細胞株を用いて適用することもできる。
- 42B 細胞をリン酸緩衝生理食塩水 6 mL で洗浄し、0.05% トリプシン-EDTA (75 cm2 フラスコに 3 mL) を加え、フラスコを細胞培養インキュベーター (37 ° c、5% co2、95% の湿度) に2-5 分間置きます。
- 細胞が顕微鏡下で取り外されていることを確認してください。その後、完全なダルベッコ改変イーグルミディアム (DMEM) 培地 (dmem + 10% ウシ胎児血清、100 U/mL ペニシリン、100μ g/mL ストレプトマイシン、250 ng/mL のアムホテリシン B、0.4 μ g/mL ヒドロコルチゾン、および50μ g/mL のアスコルビン酸) 酵素を中和する (6 mL の 75 cm2フラスコ) 細胞懸濁液を 15 mL の円錐状のチューブに移した。
注: 研究対象の細胞に適した細胞培養培地を選択してください。 - 細胞懸濁液を 200 x gで5分間遠心します。
- 上清を除去し、2-5 mL の完全な DMEM 中の細胞ペレットを懸濁させる。
- 細胞を数えて、完全な DMEM で細胞懸濁液を2万細胞/ml の最終濃度に希釈します。
注:細胞株ごとに最適なセル数を決定する必要があります。 - 1ウェルあたり1000細胞の最終的な濃度のために十分に、各超低接続96のウェル丸底プレートウェルに細胞懸濁液の50μ l を分配します。
- プレートを細胞培養インキュベーター (37 ° c、5% CO2、95% の湿度) に移します。4日後、倒立顕微鏡で腫瘍スフェロイド形成を目視で確認し、アッセイを進める。ウェルごとに1つのスフェロイドのみが存在することを確認します。
注:回転楕円体を形成するのにかかる時間は、異なる細胞株の間で変化する。
2. 三次元スフェロイドの浸潤アッセイ
注:ウェルに添加するとゲルが1:1 希釈されるため、2倍の溶液を調製します。
- 37° c に維持された水浴中の氷およびフィブリノーゲン原液溶液に HMDM を融解する。それは完全に可溶化され、氷の上に溶液を入れていないまで、フィブリノーゲンを乱さないでください。降水が発生します。
- 各試薬の適切な容量を混ぜ合わせます: 1mg/mL HMDM (最終濃度: 0.5 mg/mL)、0.6 U/ml トロンビン (最終濃度: 0.3 U/mL)、66.6 mg/mL アプロチニン (最終濃度: 33.3 ug/mL)、および 1 mg/mL のフィブリノーゲン (最終濃度: 0.5 mg/mL).
注:ウェルに混合物を分配し、迅速に動作する直前にフィブリノーゲンを追加します。それは数分でゲルを形成します。.一度にいくつかの井戸を扱います。 - 各ウェルに50μ l のゲルを加えます。先端を井戸の内壁に向けて、ゆっくりと pipet ます。空気の泡 (逆ピペット操作を使用) を避け、回転楕円体を井戸の中心から動かさないようにしてください。
- プレートを細胞培養インキュベーターに戻し、HMDM/フィブリンマトリックスを30分間固化させ、ゲルの上部に各ウェルに100μ l の完全な DMEM をそっと加えます。
3. イメージング
- 倒立光顕微鏡を用いてスフェロイドを毎日画像する。または、自動イメージングシステムを使用します。
4. Ilastik による画像セグメンテーション
- Ilastik を開き、[ピクセル分類] ワークフローを選択します (図 1A)。ユーザーが作成した注釈に基づいてピクセルを分類します。Ilastik プロジェクト (ilp) をコンピュータに保存します。
- 解析用の画像を追加します。[入力データ] をクリックして新規追加し、画像を選択します (図 1B)。
-
フィーチャ選択の場合は、[フィーチャの選択] をクリックし、フィーチャを選択します (図 1C、赤の四角形)。
注:選択したフィーチャは、オブジェクトをバックグラウンドから分離するビジュアルプロパティにほぼ対応し、分類器のトレーニングに使用されます。- ボックスをクリックしてフィーチャを選択します。選択したボックスが緑色に変わります (図 1C、青の四角形)。
注:ここでは、ユーザーは、いくつかの異なる機能の種類やスケールから選択することができます。色または輝度に基づいてオブジェクトを分離するには、色/輝度を選択する必要があります。明るさまたは色のグラデーションに基づいてオブジェクトを分離するには、[エッジ] を選択します。テクスチャは、イメージ内のオブジェクトに特殊なテクスチャの外観がある場合に重要な機能です。このアッセイでは、色/強度 (σ 0) とエッジ (σ 6) が使用されます。
- ボックスをクリックしてフィーチャを選択します。選択したボックスが緑色に変わります (図 1C、青の四角形)。
-
トレーニングの場合は、[トレーニング] をクリックし、[トレーニング] セクションにラベル1とラベル 2 (図 1D、赤の四角形) という2つのラベルがあります。ラベルが1つしかない場合は、[ラベルを追加] を押して新しいラベルを追加します (図 1D、青の四角形)。
- ラベルの1つ (図 1d、黄) と、もう一方のラベルを持つセル (図 1d、青) を使用して、背景にマークを付けます。
- イメージの最初の 10% のためのソフトウェアを訓練してください。現在のビューから次の画像を選択します。
- セルと背景が (最初の画像の) マークされたら、ライブアップデート(図 1D、紫色の長方形) を押します。
注: 次の画像では、ilastik は前の画像に従って自動的に解析を実行します。
- トレーニングが完了し、ilastik がすべての画像を解析したら、[予測エクスポート] をクリックします。ソースから単純なセグメンテーションを選択します。確率やその他のものを選択しないでください (図 1E)。
- 予測エクスポートセクション (図 1E) で、[イメージ設定のエクスポート] を選択してから目的の出力ファイル形式を選択します。[すべてエクスポート] をクリックしてラベル付けの結果をエクスポートします (図 1F)。ファイルは、元の画像と同じフォルダにエクスポートされます。
注: この実験では、. h5 形式が使用されます。
5. フィジー ImageJ による地域分析
-
スケール設定
- フィジー ImageJ の縮尺記号を使用して元の画像を開きます (図 2a)。イメージのサイズと寸法が分析されたイメージと同じであることを確認します。ライン選択ツールを使用して、既知の長さのラインを描画します (図 2B)。
注:このプロトコルは、フィジー ImageJ 1.51 (64 ビット) と ilastik rc を使用して実行されます。 - [解析と尺度の設定] をクリックします (図 2C)。[既知の距離] フィールドに既知の距離を設定し、適切な単位を設定し、[グローバル] をクリックします (図 2D)。
- フィジー ImageJ の縮尺記号を使用して元の画像を開きます (図 2a)。イメージのサイズと寸法が分析されたイメージと同じであることを確認します。ライン選択ツールを使用して、既知の長さのラインを描画します (図 2B)。
-
マクロのインストール
- プラグインilastikがインストールされていない場合は、次の手順に従います。ヘルプをクリックして更新...開いているウィンドウImageJ アップデータで、[更新サイトの管理] をクリックします。開いているウィンドウで更新サイトを管理し、ilastik の [次へ] をクリックし、[閉じる] をクリックします。次に、[ウィンドウImageJ アップデータの変更を適用] をクリックします。このプロセスには時間がかかることがあります。次のウィンドウは、テキストが正常に更新された情報になります。[ OK ] をクリックし、ImageJ を再起動します。
- プラグイン、マクロ、およびインストールをクリックします (図 3A)。次に、ijm ファイル (補足情報を参照) を選択し、「開く」をクリックします。
注:マクロは、特に面積を測定するために書かれました。ソフトウェアを開くたびに、マクロをインストールする必要があります。
-
エリア分析
- すべてのプラグインがインストールされているときに画像を分析します。プラグインをクリックし、 ilastikまでスクロールします (図 3C)。[インポート HDF5を選択し、ファイルを [h5] 形式で選択し、[開く] をクリックして LUT (図 3C、D) をロードして適用します。
- キーボード (マクロ) からaボタンを押すと、領域が集計ウィンドウに合計面積として表示されます (図 3E)。
Representative Results
UT-42B (転移性喉頭 SCC 細胞株) を播種した4日後に、マトリックス (HMDM/フィブリン、MSDM、またはコラーゲン) を形成されたスフェロイドに添加し (0 日目)、侵襲を3日間モニタリングした。ここでの画像は、倒立顕微鏡を用いて毎日入手した (図 4)。
いったん埋め込まれると、HMDM/フィブリンマトリックス中の細胞は、1日後に急速に浸潤し始め、マトリックス中に伸長した (図 4A)。MSDM の細胞は周囲のマトリックスに侵入せず、代わりに非対称構造を形成した (図 4B)。一方、コラーゲン中の細胞は僅かに浸潤したが、マトリックス収縮により分析は困難であった (図 4C)。いくつかのコラーゲンウェルでは、スフェロイドは3日後にも消失した (図 4C)。
図 5は、初代喉頭 SCC 細胞株 UT − Scc −42a および対応する転移性細胞株 UT − Scc −42B の HMDM/フィブリンにおける細胞浸潤の定量化を図示する。HMDM/フィブリンスフェロイドの生細胞解析システムを用いて撮影されたビデオ (ムービー 1) は、マトリックス内の SCC 細胞の動きを示し、その後に他の細胞が鎖を形成する。
図 1: 画像のセグメンテーション。Ilastik を使用した画像セグメンテーションの選択されたステップ。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: スケール設定。フィジー ImageJ を使用して、スケール設定の選択されたステップ。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ImageJ を用いた侵入解析。フィジー ImageJ を使用して画像解析の選択されたステップ.この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: UT-SCC-42B の細胞浸潤を3つの異なるマトリクスで行う。3D スフェロイドにおける SCC 細胞浸潤の代表的な画像。3日間の侵攻後、倒立顕微鏡を用いて画像を毎日撮影した。(A) HMDM/フィブリン、(B) MSDM、(C) コラーゲン。最後の列は3日目の侵攻の明確化を表しています。スケールバー = 200 μ mこの図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: HMDM/フィブリンにおける SCC 細胞浸潤の定量化初代喉頭 UT − SCC −42A および対応する転移性喉頭 UT − 42B SCC 細胞株の浸潤を、ilastik およびフィジー ImageJ ソフトウェアを用いて分析した。結果は、3回の独立した実験の平均±標準偏差を、三連でそれぞれ示す。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1:3 日間の HMDM/フィブリン内の SCC 細胞運動。この動画を見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードします。
Discussion
提示された方法は、d 型ヒト腫瘍ベースのアッセイを提供して、母体のヒト腫瘍微小環境内の癌細胞の侵襲性を評価する。がん細胞の侵襲は、標準的な顕微鏡を用いた毎日のイメージングと、画像解析ソフトウェアによって容易に測定することができます。この方法は単なる増殖ではなく細胞浸潤を示す。
MSDM とは異なり、HMDM/フィブリンマトリックスは、任意の温度制御を必要としません。この方法は、特に1つのプレートから別にスフェロイドを転送する必要なく、実行するのは簡単です。それは唯一の技術的に敏感なステップ、マトリックスへのフィブリノーゲンの添加を持っています。フィブリノーゲンは数分後にゲル化し始めるので、フィブリノーゲンを加えると、一度にわずかな井戸をピペットで処理し、治療する必要があります。また、ピペット操作が高圧で行われる場合、スフェロイドを妨害して U 字型の中央位置から移動させるリスクもあります。回転楕円体の脱臼は、画像化および最終的に分析を複雑にすることができる。
アッセイは、HMDM またはフィブリノーゲンの濃度を変えることによって修飾することができます。細胞はまた、その後の分子研究のために固定および染色することができる。この方法は完全に自動化された形に変更することができますが、通常の顕微鏡と2つのオープンソースソフトウェアで行うこともでき、高価な装置は必要ありません。
従来の MSDM ベースの3D アッセイと比較して、このアッセイは細胞の浸潤特性をより良く表示することができます。MSDM のようなラミニンが豊富なマトリクスを含む基底膜で成長したスフェロイドは、実際の侵襲よりも癌細胞の増殖が多くなり、それが侵入能力が低いためにいくつかの癌細胞株における浸潤アッセイには適さない可能性がある。もう1つの頻繁に使用されるマトリックスである I 型コラーゲンは、3D 培養中にエッジから収縮する傾向があり、これは、回転楕円体の局在化およびウェルの画像化に影響を及ぼす。さらに、より多くの (HSC-3) およびより少ない (SCC-25) 攻撃的な舌の癌の細胞株の内因性の侵襲的特性の違いはモデル (子宮筋腫ディスクおよびその可溶性形態マトリックス)10、13。
HMDM はヒト平滑筋腫腫瘍の余った物質から抽出されるので、アッセイは MSDM を使用するよりも倫理的です。現在、HMDM は、多くの癌関連臨床アッセイ8、10に適していると思われる唯一の利用可能なヒト腫瘍由来 ECM 産物である。将来的には、動物の組織由来マトリックスをヒト腫瘍ベースのマトリックスに置き換えることができ、マトリックス生産のために動物を犠牲にする必要性を減らすことができる。
2D 細胞培養アッセイを3D 法で置き換えることで、がん細胞の挙動に関するより正確な情報が得られます。現在、いくつかの3D モデルと商業的なマトリックスがありますが、残念ながら、どれもすべてのがん細胞株に適していません。研究者は、特定のアッセイに最適なマトリックスを選択する必要があります。アッセイとマトリックスの最適なマッチングは困難な場合がありますが、結果の信頼性が大幅に向上する可能性があります。
Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
著者は、この研究の資金に感謝します: シグリッド Jusélius 財団、フィンランド癌協会、ヘルシンキ大学中央病院の研究資金。著者らは、技術支援のためにヘルシンキ大学で Biomedicum イメージングユニットを承認しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Merck | A2942 | |
| Aprotinin from bovine lung | Merck | A6279 | Measure the protein concentration before use. |
| Ascorbic acid | Applichem | A1052 | |
| BioLite Cell Culture Treated Flasks | Thermo Scientific | 130190 | |
| DMEM/F-12 | Gibco by Life Technologies | 31330-038 | |
| DS-Fi2 Digital Camera | Nikon Instruments | ||
| DS-U3 Digital Camera Controller | Nikon Instruments | ||
| Eclipse TS100 Inverted Microscope | Nikon Instruments | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco by Life Technologies | 10270106 | Heat inactivate for 30 min at 56 °C in waterbath before use. |
| Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma | Merck | 341578 | Solubility: 25 mg/ml in H2O. Warm the H2O and the fibrinogen to 37 °C prior to dissolution. Do not disturb until the fibrinogen is completely solubilized. Stock solutions stored at -70 °C should be thawed in a water bath maintained at 37 °C. |
| Fiji ImageJ 1.51 image processing program | Freeware, NIH | ||
| Hydrocortisone | Merck | H0888 | |
| Ilastik software for image classification and segmentation | Freeware | ||
| IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System | Essen BioScience | ||
| Myogel | Lab made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab made | ||
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck | PHCC20040 | |
| Scepter Cell Counter Sensors, 60 µm | Merck | PHCC60050 | |
| Thrombin from human plasma | Merck | T6884-100UN | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) 10x, no phenol red | Gibco by Life Technologies | 15400054 | |
| Ultra-Low Attachment 96-Well Plate | Corning | 7007 | |
| UT-SCC-42A and UT-SCC-42-B cell lines | The cell lines were established at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Turku University Hospital (Turku, Finland). |
References
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