Summary
여기에서, 중요한 뒷다리 허혈 실험 모형은 혈관 신생 치료의 효과를 평가하기 위하여 기능적, 적학 및 분자 시험의 건전지에 선행됩니다.
Abstract
중요한 사지 허혈은 (CLI) 더 낮은 사지 절단의 고위험을 수반하는 심각한 상태입니다. 금 표준 치료인 재혈관화에도 불구하고, 상당수의 CLI 환자는 외과적 또는 혈관내 혈관 혈관 혈관 혈관 화에 적합하지 않습니다. 혈관 신생 치료는 이 환자를 위한 선택권으로 나오고 있습니다 그러나 현재 조사되고 있습니다. 인간에 있는 신청의 앞에, 그 치료는 동물 모형에서 시험되어야 하고 그것의 기계장치는 명확하게 이해되어야 합니다. 뒷다리 허혈 (HLI)의 동물 모델은 쥐에서 말단 외부 불역및 대퇴 동맥 및 정맥의 결찰 및 절제에 의해 개발되었습니다. 기능, 기능학 및 분자 수준에서 허혈 및 가용 혈관 신생 요법의 효과를 평가하기 위해 포괄적 인 테스트 패널이 모였습니다. 레이저 도플러는 관류의 유량 측정 및 기능적 평가에 사용되었다. 조직 반응은 위장근육의 조직학적 섹션상에서 항 CD31 항체로 염색한 후 모세관 밀도를 분석하고 대각선 화 후 부수적인 혈관 밀도를 측정하여 평가하였다. 혈관신생 유전자의 발현은 쥐 위장관 근육으로부터 레이저 포획 미세내부를 포착한 후 내피 세포(ECs)에서만 선택된 혈관신생 인자를 대상으로 RT-PCR 표적화에 의해 정량화되었다. 이 방법은 허혈성 및 비 허혈성 사지 사이 그리고 처리되고 처리되지 않은 사지 사이 다름을 확인하는 에서 민감했습니다. 이 프로토콜은 CLI의 재현 가능한 모델과 혈관 신생 요법을 테스트하기위한 프레임 워크를 제공합니다.
Introduction
말초 동맥 질환 (PAD)은 주로 더 낮은 사지에 영향을 미칩니다. PAD는 동맥 경화증, 하반신의 혈류에 심각한 제한을 일으킬 수있는 동맥폐쇄에 의해 발생 1. 간헐적 파행은 PAD의 첫 번째 징후이며 걸을 때 근육 통을 말합니다. CLI는 PAD의 가장 가혹한 단계, 허혈성 나머지 통증, 궤양 또는 회지2를 보여주는 환자에서 진단되고. CLI를 가진 환자는 절단의 고위험이 있습니다, 치료되지 않는 경우에 특히3. 더 낮은 사지 revascularization (개천 수술 또는 혈관 내 절차에 의해) 현재 사지 회수를 달성하는 유일한 방법입니다. 그러나, CLI 환자의 약 30%는 병변의 위치, 동맥 폐색의 패턴 및 광범위한 동반변을 포함하는 이유로 이러한절차에 적합하지 않습니다 4,5. 그러므로, 혈관신생의 승진이 더 강렬한 조사에서 전략인 것과 더불어, 이 그렇지 않으면 치료할 수 없는 환자를 위해 새로운 치료가 필요합니다.
인간에서 테스트하기 전에 생체 내 새로운 치료법의 효과와 안전성을 동물 모델에서 고려해야 합니다. 몇몇 모형은 CLI의 연구 결과를 위해 개발되었습니다, 주로마우스6,7,8,9,10에있는 뒷다리 허혈 (HLI)를 유도하 여. 그러나, 이 모형은 결찰및/또는 절제되는 동맥의 본질 및 및 주위정맥 및 신경이 또한 6,7,8, 해부되는지 의 여부를 포함하여 몇몇 양상에서 다릅니다 9,10. 종합하면, 이러한 양상은 각 동물의 허혈 재관류 손상의 중증도에 영향을 미치므로 결과를 비교하기가 어렵습니다. 따라서, 허혈을 유도하는 절차와 다른 표적의 평가를 표준화하여 주어진 혈관신생 치료가 효과적일 지 여부를 평가하는 효과적인 프로토콜을 개발하는 것이 중요하다. 이러한 모든 측면을 커버하도록 설계된 실험 프로토콜은 혈관 신생 치료가 효과를 발휘하는 메커니즘과 각 결과에서 효능의 측정을 포괄적으로 이해할 수 있습니다. 우리 팀에 의해 최근에 간행된 2개의 명백한 일은 좋은 보기11,12,치료 혈관신생을 유도하기 위하여 다른 접근이 이것에 더 상세히 기술될 것이다 동일 프로토콜을 사용하여 평가되었다는 것을 프로토콜.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 CLI의 효과를 모방하고 가양성 혈관 신생의 기능적, 적학적 및 분자 적 효과에 대한 포괄적 인 평가를위한 실험 기반을 마련 할 수있는 재현 가능한 실험 모델을 설명하는 것입니다. 에이전트.
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Protocol
모든 동물 절차는 지침 2010/63/EU에 따라 되며 기관 동물 복지 기구의 승인을 받았으며 포르투갈 동물 보호 당국인 DGAV의 허가를 받았습니다(면허 번호 023861/2013).
주의: 프로토콜에 사용된 몇몇 화학물질은 독성이 있고 유해합니다. 모든 적절한 안전 관행 및 개인 보호 장비(장갑, 실험실 코트, 전신 바지, 발가락 신발)를 사용하십시오.
1. 뒷다리 허혈의 뮤린 모델
참고: 모든 실험은 22주 된 C57BL/6 암컷 마우스에서 수행됩니다.
- 솔루션 준비
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마취 액의 준비
참고 : 이 마취 제 조합 (메데토미딘과 케타민)은 최대 30 분 의 고정 및 15 분의 수술 기간을 제공합니다. 효과는 아티파메졸의 투여에 의해 되돌릴 수있다.- 깨끗한 1cc 주사기로 메데토미딘 1 mL (1 mg / Kg 체중)을 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.
- 깨끗한 1 cc 주사기로 케타민 (75 mg / Kg 체중)의 0.75 mL를 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 메데토 미딘을 포함하는 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.
- 마취 용액 10 mL을 얻기 위해 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)의 8.25 mL를 추가하십시오.
- 화합물의 이름, 혼합 날짜 및 만료 날짜로 튜브를 식별합니다.
- 4 °C에서 어둠 속에서 저장합니다.
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진정 제 용액의 준비
- 깨끗한 1 cc 주사기로 아티파메졸 (5 mg / Kg 체중)의 1 mL을 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.
- 10 mL의 회귀 용액을 얻기 위해 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)의 9 mL를 추가하십시오.
- 화합물의 이름, 혼합 날짜 및 만료 날짜로 튜브를 식별합니다.
- 4 °C에서 어둠 속에서 저장합니다.
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수술 후 진통 용액의 준비
- 깨끗한 1 cc 주사기로 0.5 mL의 부프레노르핀 (100 μL / 15-30g 체중)을 철회하고 정확한 측정을 위해 기포를 제거하고 15 mL 팔콘 튜브에 추가하십시오.
- 진통 용액 10 mL을 얻기 위해 멸균 식염수 (0.9 % NaCl)의 9.5 mL를 추가하십시오.
- 화합물의 이름, 혼합 날짜 및 만료 날짜로 튜브를 식별합니다.
- 4 °C에서 어둠 속에서 저장합니다.
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마취 액의 준비
- 뒷다리 허혈의 외과 유도
- 이 내정간섭을 위해 필요한 외과 공구: 뾰족한 집게, 봄 가위, 안과 바늘 홀더, 외과 가위 및 바늘 홀더. 사용하기 전에 오토클레이브의 모든 수술 도구를 소독하십시오. 피하 지방의 해부에 면봉을 사용하십시오.
- 마우스를 잡기 전에 마취 용액으로 주사기를 로드하십시오.
- 마우스가 움직이지 않도록 가능한 한 많은 피부를 잡고, 케이지의 격자에 대한 귀 뒤에 힘을 가하여 동물을 억제하십시오.
- 머리를 내리면 동물을 기울이고 마취 용액의 복강 내 주사를 수행하여 주사기를 마우스 몸체와 45 ° 각도로 유지하십시오.
- 마취의 깊이를 평가하기 위해 페달 철수 반사의 부재를 확인하십시오.
- 전기 면도기로 오른쪽 뒷다리에서 머리카락을 제거합니다. 피부 준비를 위해 클로르헨시딘 소독비누 스크럽을 사용하십시오. 깨끗한 종이 타월을 사용하여 비눗물제거합니다. 클로르헨시딘 수술 용 스크럽을 적용하고 수술 멸균 스위트로 마우스를 운반하기 전에 멸균 드레이프로 피부 영역을 보호합니다.
- 등지 방수에 동물을 놓고 네 개의 사지가 떨어져 테이프로 고정으로 억제.
주의: 동물의 체온을 안정적으로 유지하기 위해 가열 된 패드에서 절차를 수행하십시오. 외과 적 절차는 10 배 또는 20 배율에서 해부 현미경을 사용하여 수행됩니다. - 멸균 거즈를 사용하여 클로르헨시딘 살균 용액을 적용하여 피부 준비를 마무리하십시오. 11번 수술을 이용한 메스블레이드는 오른쪽 뒷다리의 허벅지를 덮어도 1cm 피부 절개를 수행한다.
- 무딘 해부 피하 지방은 신경 혈관 번들을 노출. 뾰족한 집게, 봄 가위 및 안과 바늘 홀더를 사용하여, 말단 외부 불퇴증 및 대퇴 혈관을 드러내기 위하여 membranous 일리오 대퇴 칼집을 엽니다.
- 혈관 (동맥및 정맥)을 신경에서 해부하고 분리하십시오. 7.0 비흡수성 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 말단 외부 장골 동맥 및 정맥 및 말단 대퇴 동맥 및 정맥을 리게이트한다.
- 봄 가위로 말단과 근위 매듭 사이의 일리오 대퇴 동맥과 정맥의 세그먼트를 변환합니다.
- 흡수성 봉합사(예: 5.0 Vicryl 봉합사)로 절개를 닫습니다.
- 주사기를 진정 방지 용액으로 적재하고 1.2.3 및 1.2.4에 자세히 설명된 동일한 방법을 사용하여 진정 방지 용액의 복강 내 주입을 수행합니다.
- 수술 후 모니터링
참고 : 동물은 모든 동물이 진정 제에서 잘 회복되도록 하기 위해 15-20 분마다 주의 깊게 관찰됩니다. 마취 된 동물은 방치되지 않습니다.- 마취에서 회복을 평가 : 1) 호흡의 속도와 깊이를 모니터링; 2) 동물 반사 (페달 및 눈 위치) 평가
- 수술 후 진통의 피하 주사를 8-12 시간마다 수행하십시오.
- 수술 후 동물의 건강 상태와 수술 부위 외관에 대한 간략한 설명을 기록한 후 매일 동물을 모니터링하고 모든 봉합사가 닫혀 있는지 확인하십시오.
- 절개가 발생하면 절개를 다시 봉합하십시오. 성공하지 못하면 절개 부위에 피부 장벽 필름을 적용하여 소변, 배설물 배설물, 피부의 마찰 및 전단을 보호하고 치유 과정을 돕습니다.
2. 혈관 신생 효과의 평가
참고 : 허혈 유도 후 연구에 치료제를 적용하고 다음과 같은 절차를 달성하십시오. 다른 시점에서 수행되는 단계는 해당 섹션에서 자세히 설명합니다.
- 레이저 도플러 관류 이미징
- 전기 면도기와 제모 크림을 사용하여 분석하기 하루 전에 양쪽 뒷다리에서 머리카락을 제거하십시오.
- 마취 용액을 사용하여 마우스를 마취.
- 동물을 37°C 가열 패드에 5분 동안 놓아 서 시술 중에 온도가 변하지 않도록 하십시오.
- 다리를 확장된 위치에 고정하여 동물을 척추 위치에 놓습니다. 동물의 위치가 시간이 지남에 따라 뒷다리 관류의 변화를 따르기 위해 절차를 반복해야 할 때마다 유사해야하기 때문에 각 동물의 오른쪽 다리와 왼쪽 다리와 발 사이의 거리를 측정합니다.
- 레이저 도플러 관류 이미저를 사용하여 데이터 수집을 시작합니다.
- 취득이 완료되면, 반대로 진정제 해결책으로 마취를 되돌리.
- 이미지 분석 소프트웨어를 열고 허혈성 뒷다리 주위의 관심 영역(ROI)과 비허혈 뒷다리 주위의 유사한 ROI를 그립니다.
- 플럭스 값을 관찰하고 비 허혈성 사지에서의 관류의 비율로 관류를 결정한다. 관류 비율의 변화는 시간이 지남에 따라 측정됩니다.
- 면역화학 및 모세관 밀도 분석
- 마취 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생하십시오.
- 두 다리의 위천혈을 수확하려면 먼저 양쪽 뒷다리에서 피부를 제거하십시오.
- 아킬레스 건을 식별하고 11 블레이드 메스를 사용하여 뼈에서 힘줄을 분리.
- 아킬레스 건을 잡고 봄 가위로 무릎 관절까지 경골과 비골에서 근육을 분리.
- 이두근 femoris위프근육과 분리하십시오.
- 무릎 관절 수준에서 위장관 근육의 삽입을 잘라 봄 가위를 사용합니다.
- 수확 한 위장 근육을 10 % 트라가 칸스의 도움으로 작은 코르크 디스크에 가로 방향으로 놓습니다.
- 액체 질소 냉각 isopentane에 표본을 동결 하 고 절편 될 때까지 -80 °C에서 그들을 저장 합니다.
- 저온 극저온에 근육 표본의 7 μm 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 마운트합니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. - 유리 슬라이드를 -20°C에서 10분 동안 냉각된 순수 아세톤(약 50mL)을 함유한 병에 고정합니다.
- 메탄올(50 mL)에 희석된 수소 과산화효소를 실온에서 30분 동안 첨가합니다.
- 총 10분 동안 인산완식염수(PBS)(50 mL)로 두 번 씻으소서.
- 섹션 주위에 소수성 펜을 사용합니다.
참고: 소수성 펜을 사용하면 프로토콜 중에 소비되는 솔루션의 양을 줄일 수 있습니다. 모든 인큐베이션의 경우 섹션당 모든 용액의 100 μL을 사용하십시오. - 실온에서 30분 동안 PBS에 5% 토끼 혈청의 차단 용액을 적용합니다.
- PBS에서 1% 소 혈청 알부민 (BSA)에서 1 :500에서 희석 된 항 CD31 래트 단일 클론 항체로 실온에서 1 시간 동안 표본을 배양합니다.
- 총 30분 동안 PBS에서 세 번 씻으소서.
- PBS에서 1% BSA에서 1:200에 이차 생체생물 토끼 항-래트 IgG 항체를 추가하고 실온에서 30분 동안 5% 토끼 혈청을 첨가한다.
- 이전과 같이 PBS에서 세척하고 실온에서 30 분 동안 라벨이 부착 된 아비딘 컨쥬게이드 퍼옥시다아제 복합체를 추가하십시오.
- PBS에서 3회 5분 간 헹구고 디아미노벤지딘(DAB) 과산화아제 기판 키트를 5분 더 추가합니다.
- 장착하기 전에 10s동안 헤마톡슬린으로 섹션을 반염색합니다.
- 각 시편에서 4개의 별개의 해부학 영역의 2개의 다른 단면도에서 수직 밝은 필드 현미경 (즉, 근세포 의 수 당 모세관의 수)를 사용하여 모세관 밀도를 측정합니다.
- 조영제 관류
- 마취 용액을 사용하여 마우스를 마취.
- 숫자 15 메스 블레이드를 사용하여 중간 개복술을 수행합니다.
- 복부 대원과 꼬리 정맥 카바를 측면으로 후퇴시키고 봄 가위를 사용한 후 노출하십시오.
- 26-게이지 카테터를 복부 대강에 넣고 다른 카테터를 같은 방향으로 코그나 카바에 삽입합니다.
- 5/0 실크 봉합사를 사용하여 카테터를 고정하여 체류 봉합사를 수행하십시오.
- 헤파린을 함유한 37°C 식염수(500 단위/100 mL)로 혈관 시스템을 10 mL 주사기를 사용하여 복부 대동맥으로 밀어 넣습니다. 뚜렷한 용액이 카테터에서 나올 때까지 부드러운 관류를 계속하십시오.
참고: 일반적으로 30 받는 사람의 하혈 식염수용의 성인 쥐의 혈관 시스템을 헹구는 데 필요한. - 아데노신 (1 mg/L)과 파파베린 (4 mg/L)을 2 분 동안 혼합하여 투여하십시오.
- 황산 바륨 과 5 % 젤라틴의 혼합물의 대동맥 카테터 10 mL에 주입.
참고: 용액은 두꺼워지지지기 위해 60°C로 보관해야 합니다. - 마우스를 적어도 4 시간 동안 4°C에서 방치하고, 혈관 캐스트가 고형화되도록 한다.
- 각 마우스의 하체에서 피부를 제거합니다.
- 다이아포화 - 스패테홀츠 기술
- 적어도 72 시간 동안 10 % 포름알데히드 용액에 침지하여 마우스를 고정시.
- 마우스를 30% 과산화수소 용액에 침지하여 24시간 동안 표백하였다.
- 동결 치환 기술을 사용하여 마우스를 탈수한다. 이 방법론은 마우스를 각각 24 시간 동안 20 °C에서 순수한 아세톤의 연속적인 통로 (평균 4)에 제출하는 것으로 구성됩니다.
- 100% 벤질 벤조에이트 및 100% 메틸 살리실산염을 3:5 비율로 함유하는 용액에 침지하여 마우스를 명확히 한다(이 혼합물은 또한 스패테홀즈 용액이라고도 함) 13.
- 일반적으로 5~7일이 걸리는 다이어프란이 될 때까지 스페이톨즈 용액내부에 침지된 마우스를 진공 챔버에 두십시오.
- 시편이 명확해지기 전에 어두워지면 용액을 교체하십시오.
- 부수적인 선박 정량화
- 스테레오택시 현미경을 사용하여 트랜스일루미네이션 하에 Spalteholz 용액에 매달린 마우스를 관찰하십시오. 미세 수술 집게를 사용하여 부드럽게 잡고 이동하십시오.
- 현미경에 연결된 디지털 카메라를 사용하여 팔다리 전체를 촬영합니다.
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 전체 팔다리 사진을 가져옵니다.
- 적절한 소프트웨어를 사용하여 부가 용기의 수동 세분화를 강조 표시합니다.
참고: 담보 용기는 대퇴, 사페누스 및 포퓰리터 동맥 및 모든 정맥 구조를 제외한 직경이 20~300 μm인 Longland의 정의, 정의된 줄기, 중간 지대 및 재진입에 따라 정의됩니다. - 수술 폐색을 둘러싸고 아래인 adductor의 동일한 해부학 영역에서 모든 마우스에서 ROI를 정의합니다.
- 총 사지 면적의 20%에 해당하는 상응하는 ROI로 부수적 용기 밀도(CVD)를 정량화합니다. CVD는 혈관 영역과 ROIs 영역 간의 비율로 계산됩니다. 모든 밀도 측정은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.
참고: 각 마우스에 대한 비 허혈성 사지의 CVD 값은 해부학, 관류 또는 대각선 화 절차의 변화를 배제하기 위해 100 %에 해당하는 것으로 가정됩니다. 허혈성 사지에서의 CVD 백분율은, 따라서, 비허혈성 하나에 대하여 계산되었다. - 허혈성 및 비허혈성 사지 사이의 CVD 백분율 간의 차이로 CVD 증가의 백분율을 결정합니다.
- 모세 혈관의 레이저 캡처 미세 해부
- 마취 후 자궁 경부 탈구로 마우스를 희생하십시오.
- 두 다리의 위천혈 근육을 수확하려면 쥐의 뒷다리에서 피부를 제거하십시오.
- 아킬레스 건을 식별하고 11 블레이드 메스를 사용하여 뼈에서 힘줄을 분리.
- 아킬레스 건을 잡고 봄 가위로 무릎 관절까지 경골과 비골에서 근육을 분리.
- 이두근 femoris위프근육과 분리하십시오.
- 무릎 관절 수준에서 위장관 근육의 삽입을 잘라 봄 가위를 사용합니다.
- 수확 된 위장 근육을 10 % tragacanth의 도움으로 작은 코르크 디스크에 가로 방향으로 놓습니다.
- 액체 질소 냉각 isopentane에 표본을 동결 하 고 절편 될 때까지 -80 °C에서 그들을 저장 합니다.
- 근육 시편의 저온 극저온 12 μm 섹션에 잘라 유리 슬라이드에 장착.
참고 : RNA 보호를 위해 미리 냉각 된 슬라이드를 가지고 손가락 (장갑)으로 슬라이드의 뒷면을 터치하여 섹션을 배치하기위한 영역만 따뜻하게하십시오. 저온 유지 법에서 절충된 부위를 접촉하여 저온 유지 를 2-3 분 동안 저온 유지 에서 -20°C에서 건조시. 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.- 유리 슬라이드를 -20°C에서 5분간 냉각된 순수 아세톤(약 50mL)을 함유한 병에 고정하고 공기 건조시.
- 섹션 주위에 소수성 펜을 사용합니다.
참고: 소수성 펜을 사용하면 프로토콜 중에 소비되는 솔루션의 양을 줄이는 데 도움이 됩니다. 모든 인큐베이션의 경우 섹션당 모든 용액의 100 μL을 사용하십시오. - 4°C에서 2M NaCl/PBS로 수분을 공급하고 2M NaCl/PBS에서 1:500에서 항 CD31 래트 모노클로날 항체로 4°C에서 밤새 시편을 배양합니다.
- 총 6분 동안 2M NaCl/PBS에서 두 번 씻으소서.
- 2M NaCl/PBS에서 1:200에서 이차 생체생물 토끼 항-래트 IgG 항체를 넣고 4°C에서 30분 동안 5% 토끼 혈청을 첨가합니다.
- 이전과 같이 2 M NaCl/PBS로 세척하고 4°C에서 30분 동안 라벨이 부착된 아비딘 컨쥬게이트 퍼옥시다아제 복합체를 첨가합니다.
- DAB 퍼옥시다아제 기판 키트를 5분 동안 헹구고 추가합니다.
- 얼음차가운 90 % 에탄올에 섹션을 탈수 한 다음 100 % 에탄올을 건조하게하십시오.
- 펄스 고체 355 nm 레이저를 갖춘 레이저 미세 해부 시스템을 사용하여 마우스 당 10 000 모세 혈관을 해부하고 해부 된 모세 혈관을 마이크로 퍼지 튜브 접착제 캡으로 투석합니다.
- RNA 추출, cDNA 합성, 사전 증폭 및 RT-PCR
- 적절한 키트를 사용하여 미세 제해된 모세혈관으로부터 총 RNA를 분리하고, 얻어진 총 RNA는 1.5-3 ng/μL 사이이다.
- 표1에 기재된 프라이머를 사용하여 합성 및 사전 증폭의 두 라운드를 위해 cDNA 합성 키트를 사용한다.
- 이전 단계에서 설명한 것과 동일한 대상에 대해 RT-PCR을 수행합니다. 95°C에서 10분 동안 초기 변성 단계로 구성된 프로그램을 사용하고, 15s의 경우 95°C에서 50사이클, 1분 동안 60°C에서 사용한다.
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Representative Results
기재된 프로토콜을 사용하여, 탯줄 중간엽 줄기 세포 및 저용량 이온화 방사선(LDIR)을 가설 혈관신생 요법으로 시험하였다 11,12. 레이저 도플러 관류 판독값은 허혈 유도 전과 허혈 유도 직후부터 허혈 후 45일까지 미리 지정된 시점에서 수득하였다. 레이저 도플러에 의한 조직 관류 수치는 색으로 구분된 이미지로 기록되었으며, 관류는 진한 파란색으로 표시되지 않고 가장 높은 관류 수준은 빨간색으로 표시되었습니다. 도 2A 및 3A에 도시된 바와 같이, 도 2B 및 3B에서정량화하고, 뒷다리 허혈의 유도 직후 모든 마우스에서 힌달보 관류의 완전한 손실이 관찰되었고, 뒷다리 허혈을 유도하기위한 기술의 재현성. 중요한 것은 허혈의 심각성은 모든 동물에서 유사합니다. 허혈성 뒷다리 주위에 ROI가 그려졌고 관류의 정량화를 수행하기 위해 비 허혈성 뒷다리 주위에 유사한 ROI가 그려졌습니다. 관류는 비허혈성 사지에서 허혈성 사지에서의 관류의 비율로 서 발현된다. 관류 비율의 변화는 시간이 지남에 따라 측정됩니다.
면역히스토화학은 허혈 후 15일에서 90일 사이에 수행되었다. 대각선화는 19- 90 일 사이 착수되었다 허혈 및 모세관 미세 해부 사이 45- 그리고 70 일 후 허혈 유도는 다른 프로 혈관 신생 치료가 지속적이고 장기간 된 단진 형성 효과를 유도하는 것을 보장.
위장혈술적 부분에서 CD31 양성 모세혈관의 정량화는 모세관 밀도를 평가하고 이것은 근육 섬유 수당 모세혈관의 수로서 발현되었다. 도4에 도시된 바와 같이, 모세관 밀도는 비허혈성 사지에 비해 허혈성에서 더 컸다.
부수적인 혈관 밀도를 평가하기 위해, 마우스를 다이어프론화하고 사지 영역의 20%에 해당하는 동등한 ROI를 정량화를 위해 선택하였다. 부수적인 혈관 밀도는 허혈성 사지에서 일관되게 증가하므로 치료 및 대조사지에 관련된 데이터는 비 허혈성 사지에서 상대적으로 비허혈성 사지의 부수적 혈관 밀도 증가의 백분율로 표현되었다(도5) ).
ECs에 의한 친혈관 신생유전자의 발현은 CD31 양성 세포의 정량적 RT-PCR에 의해 분석되었다. Vegfr2, Vegfr1, Fgf2, Angpt2, Pdgfc, Tgfb2, Hgf 및 Met에 대한 전사체는 허혈성 및 비허혈성 사지 사이의 발현의 명확한 변화를 보였으며, 독점적으로 친혈관성 자극에 노출된 마우스에서 나타났다(도 6).
그림 1 : 결찰 부위를 보여주는 마우스 뒷다리 혈관구조의 해부학적 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : LDIR은 관류 회복을 증가시킵니다. 일방적 HLI의 외과 적 유도 후, C57BL/6 마우스의 두 뒷다리는 연속일 0.3Gy의 4 개의 일일 분획으로 조사되거나 조사되었고 회복할 수 있었습니다. (a) 대표적인 레이저 도플러 유동 영상 사전 HLI, 및 일 0(d0) 및 15(d15) 후 HLI 유도. (b) ISC와 NISC 사지의 비율로 표현된 혈류량의 정량적 평가는 15일(d15) 및 45(d45) 후 HLI에서 조사된 마우스대 샴 조사 된 마우스에서 현저하게 향상된 사지 혈액 관류를 입증하였다. 그룹 간 변화는 ANOVA를 2방향 반복 측정으로 평가한 다음 본페로니 포스트호크 테스트(그룹당 n =12 마우스)를 따왔다. 평균 ± SEM이 도시된다. P < 0.001; ns, 중요하지 않습니다. HLI, 뒷다리 허혈; ISC, 허혈성; NISC, 비허혈성; 사전 HLI, 뒷다리 허혈 전에. 11에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 탯줄 중간엽 줄기세포(UCX) 관류 회복을 증가시. UCX 또는 그들의 비히클(대조군으로서)은 HLI 유도 후 5시간 후에 허혈성 위장혈증 근육에서 투여되었다. (a) 대표적인 레이저 도플러 유동 이미지 전(PRE-HLI), 직후(d0 POST-HLI) 및 7, 14 및 21일 후 HLI 유도(d7 POST-HLI, d14 POST-HLI, d21 POST-HLI). (b) ISC 대 NISC 사지의 비율로 발현된 혈류의 정량적 평가는 HLI 후 7, 14 및 21일 에서 처리된 마우스-탯줄 중간엽 줄기 세포에서 현저하게 향상된 사지 혈액 관류를 입증하였다. (각 실험군에 대해 n=16; D7: t (22.69) = 4.26; P제 0.001; 효과 크기는 1.51 및 전력 0.98; D14: t (30) = 4.7; P제 0.001; 효과 크기는 1.66 및 전력 0.99; D21: t (30) = 7.22; P제 0.001; 효과 크기는 2.56 및 전력 0.99)였습니다. HLI, 뒷다리 허혈; ISC, 허혈성; NISC, 비 허혈. 11에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : LDIR이 모세관 밀도를 높입니다. (A) HLI 후 45일째에 샴-조사 및 조사된 허혈성 위혈혈성 근육의 대표섹션. 모세혈관과 근세포는 각각 CD31 면역화학 및 헤마톡실린에 의해 확인되었다. 스케일 바, 150mm. (B) 정량적 분석은 조사된 허혈성 허혈성 근육에서 증가된 모세관 밀도(모세혈관/근심세포)가 15일 및 45일 후 HLI에서 샴조사된 허혈성 근육에 비해 증가한 것으로 나타났다. 혼합 ANOVA 다음에 본페로니 포스트 혹 시험은 ISC의 내 과목 인자 및 일의 과목 인자 및 조사 (그룹당 n=6 마우스)로 실시되었다. 개별 데이터 및 수단 ±SEM이 도시된다. P&0.001; ns, 중요하지 않습니다. ISC, 허혈성; NISC, 비 허혈. 11에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: LDIR은 부수적 밀도를 증가시킵니다. (A) 샴 조사 및 조사된 마우스에 대해 선택한 ROI의 예시 이미지. 90일 후 HLI에서 ISC 및 NISC 사지가 표시됩니다. 스케일 바, 300mm. (B) 데이터는 NISC 사지의 CVD 증가의 백분율로 상대적으로 NISC 하나에 나타내고 있다. 일 15 및 90 후 HLI에서, 조사 된 마우스는 상당히 높은 CVD 증가를 제시 (%) 대. 샴 조사 마우스. 양방향 ANOVA는 하루의 대상 인자와 조사 (그룹 당 n =6 마우스) 사이의 봉페로니 사후 테스트에 이어 실시되었다. 개별 데이터 및 수단 ±SEM이 도시된다. * P&0.05; P&0.001; ns, 중요하지 않습니다. HLI, 뒷다리 허혈; ISC, 허혈성; NISC, 비 허혈. 11에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : LDIR은 조사된 허혈성 위장혈성 근육에서 분리된 ECs에서 혈관신생 유전자의 발현을 업조절한다. 일방적 HLI의 외과 유도 후, C57BL/6 마우스의 두 뒷다리는 연속일 0.3Gy의 4개의 일일 분획으로 조사되거나 조사되었고, 회복을 허용하였다. 하루에 45 포스트 HLI, 프로 혈관 신생 인자 및 그들의 수용체의 발현은 ECs에서 독점적으로 qRT-PCR에 의해 평가되었다. 위혈병 근육 절편은 CD31에 대해 염색되었다. 개별 내피 CD31+ 세포는 레이저 미세 해부 시스템을 사용하여 가시화, 해부 및 단리되었다. 각 막대는 한 동물에서 상대적인 유전자 발현을 나타낸다. 흰색과 회색 막대는 각각 샴 조사 및 조사된 마우스를 나타낸다. 상대식 레벨을 얻기 위해 값을 18S로 정규화했습니다. 허혈성 및 비허혈성 샘플 간의 log2 배 변화로 발현된 결과는 조사된 마우스에서 전사체의 상대적 풍부를 입증하였다; 대조적으로, 다운 조절은 가짜 조사 된 마우스에서 관찰된다. 11에서적응 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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표 1: 스터디에 사용되는 프라이머.
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Discussion
CLI의 뮤린 모델은 대부분 프로펀다 페모리스 4,5,6,7,8,9의 기원에 불과한 대퇴동맥의 결찰로 이루어져있다. 이것은 7 일 9안에 사지에 혈류량을 복구하는 부수적인 순환의 대부분을 그대로 두는 것을 보여주었습니다. 부수적 인 침대의 제거는 대퇴 동맥의 절제에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 원래 혈류량의 3 분의 1까지 는 대부분의 부수적인 혈관이 내부 장골 동맥 7에서 발생한다는 것을 감안할 때 시술 후 7 일 이내에 즉시 회복 될 수 있습니다. Lejay 외는 일반적인 장골 동맥상에서 수행된 제2 결찰을 가진 순차적 결찰을 제안하, 효과적으로 내부 장골 동맥에 의해 제공되는 부수적관 관류를 감소시키는 4. 이 프로토콜 내의 중요한 단계는 단지 인대 위의 외부 장골 동맥의 식별뿐만 아니라, 이중 목적을 제공하는 말단 외부 장골과 대퇴 동맥과 정맥의 결찰 및 절제를 포함합니다: 허혈의 심각성을 증가시킬뿐만 아니라 모델의 기술적 재현성을 향상시키기 위해, 대퇴 동맥의 노출만으로도 종종 정맥이 찢어지는 결과를 초래합니다.
이 기술의 한 가지 제한은 사지로의 혈류의 급성 중단이며, 동맥 협착및 폐색으로 이어지는 죽상 경화성 플라크의 형성과 관련된 연장 된 과정과 는 다릅니다. 여전히, 혈류량의 감소는 만성 허혈의 진단을위한 설립 된 시점인 2 주 후에 잘 존재했습니다. 또한 만성 허혈성 사지에서 관찰 된 부수적 인 형성 과정을 모방한 허혈성 모욕만으로도 담보화가 증가했습니다.
허혈성 사지의 신생 혈관 세포화는 생물학적 사건, 즉 혈관 신생 및 동맥 발생의 복잡한 상호 작용을 수반합니다. 이 프로토콜은 혈관 신생 발아 (모세관 혈관 밀도) 및 부수적 인 혈관 개발 (arteriogenesis)에 대한 가양성 혈관 신생 요법의 간섭을 평가한 다양한 분석, 인간 내성에서 가장 중요한 메커니즘을 포함합니다. 하부 사지 허혈에. 동시에, 레이저 도플러는 이러한 새로운 또는 확대 혈관의 기능을 공개하는 데 사용되며, 모세 혈관의 첫 번째 레이저 미세 해부를 위해 기능 적 회복의 기초가되는 분자 메커니즘을 공개하는 EC를 수집하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 동물이 미래에 임상 맥락에서 적용 될 수있는 가능한 혈관 신생 요법으로 치료 될 때 CLI의 효과를 모방 할 수있는 재현 가능한 동물 모델을 산출합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 호세 리노와 타니아 카르발호, 생물 이미징 시설의 머리와 인스티투토 드 메디치나 분자 주앙 로보 Antunes의 조직학 및 비교 병리학 연구소의 머리, 각각 감사합니다. 우리는 또한 노바 의과 대학 / Faculdade 드 Ciências 메디카스, 유니버시 다드 노바 드 리스보아의 해부학학과에서 Vyacheslav Sushchyk 감사합니다.
자금 지원 참조: UID/IC/0306/2016 Fundação 파라 a Ciência e a Tecnologia에 의해 투자된 프로젝트. 폴라 드 올리베이라는 Fundação 파라 아 시에엔시아 e 테크놀로지아에서 펠로우십(SFRH/BD/80483/2011)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution - nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution - toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution - toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution - highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
References
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