Summary
Sekvens specificitet er afgørende for genregulering. Regulatoriske proteiner, der genkender specifikke sekvenser, er vigtige for genreguleringen. Definering af funktionelle bindingssteder for sådanne proteiner er et udfordrende biologisk problem. En iterativ tilgang til identifikation af et bindingssted for et RNA-bindende protein er beskrevet her og gælder for alle RNA-bindende proteiner.
Abstract
Gen-forordningen spiller en vigtig rolle i alle celler. Transkriptional, post-transkriptional (eller RNA Processing), translationelle og post-translationelle trin bruges til at regulere specifikke gener. Sekvens specifikke nukleinsyre bindende proteiner målretter mod specifikke sekvenser for at styre det fysiske eller tidsmæssige genekspression. Bindings stederne i nukleinsyrer er typisk karakteriseret ved mutationsanalyse. Men, talrige proteiner af interesse har ingen kendt bindingssted for en sådan karakterisering. Her beskriver vi en tilgang til at identificere hidtil ukendte bindingssteder for RNA-bindende proteiner. Det involverer iterativ udvælgelse og forstærkning af sekvenser, der starter med en randomiseret sekvens pulje. Efter flere runder af disse trin-transskription, binding, og forstærkning-de berigede sekvenser er sekvenseret for at identificere en foretrukken bindingssted (r). En vellykket fremgangsmåde overvåges ved hjælp af in vitro-bindende assays. Efterfølgende kan in vitro og in vivo funktionelle analyser anvendes til at vurdere den biologiske relevans af de valgte sekvenser. Denne fremgangsmåde muliggør identifikation og karakterisering af et tidligere ukendt bindingssted (r) for ethvert RNA-bindende protein, for hvilket der findes en analyse til at adskille proteinbundne og ubundne RNAs.
Introduction
I cellebiologi spiller genforordningen en central rolle. Ved et eller flere trin langs genekspressions vejen har gener potentialet til at blive reguleret. Disse trin omfatter transskription (indledning, forlængelse og opsigelse) samt splejning, polyadenylering eller 3 ' ende dannelse, RNA eksport, mRNA oversættelse, og forfald/lokalisering af primære udskrifter. På disse trin moduerer nukleinsyre bindende proteiner genreguleringen. Identifikation af bindingssteder for sådanne proteiner er et vigtigt aspekt af studiet af genkontrol. Mutational analyse og phylogenetiske sekvens sammenligning er blevet brugt til at opdage lovgivningsmæssige sekvenser eller proteinbindende steder i nukleinsyrer, såsom initiativtagere, Splice sites, polyadenylation elementer, og translationelle signaler1, 2 , 3 , 4.
Præ-mRNA splejsning er et integreret trin under genekspression og regulering. Størstedelen af pattedyrs gener, herunder hos mennesker, har introner. En stor del af disse udskrifter er alternativt spliced, der producerer flere mRNA og protein isoformer fra samme gen eller primær afskrift. Disse isoformer har celle specifikke og udviklingsmæssige roller i cellebiologi. 5 ' splejsnings sted, filial-punktet, og polypyrimidinkanalen/3 ' Splice site er kritiske spyddet signaler, der er underlagt regulering. I negativ regulering undertrykkes et ellers stærkt Splice-websted, hvorimod der i positiv regulering er aktiveret et ellers svagt Splice-websted. En kombination af disse hændelser giver en overflod af funktionelt adskilte isoformer. RNA-bindende proteiner spiller nøgleroller i disse alternative splejsning-events.
Talrige proteiner er kendt, hvis bindende site (s) eller RNA mål mangler at blive identificeret5,6. Det er ofte en kompleks proces at kæde regulerings proteiner sammen med deres efterfølgende biologiske mål eller sekvenser. For sådanne proteiner er identifikation af deres målrna eller bindingssted et vigtigt skridt i fastlæggelsen af deres biologiske funktioner. Når en binding site er identificeret, kan det yderligere karakteriseret ved hjælp af standard molekylære og biokemiske analyser.
Den fremgangsmåde, der er beskrevet her, har to fordele. For det første kan den identificere et hidtil ukendt bindingssted for et protein af interesse. For det andet, en ekstra fordel ved denne fremgangsmåde er, at det samtidig tillader mætning mutagenese, som ellers ville være arbejdskrævende at opnå sammenlignelige oplysninger om sekvens krav inden for bindingsstedet. Således, det giver en hurtigere, lettere og billigere værktøj til at identificere proteinbindende sites i RNA. Oprindeligt blev denne tilgang (SELEX eller systematisk udvikling af ligands ved eksponentiel berigelse) anvendt til at karakterisere bindingsstedet for bakteriophage T4 DNA Polymerase (gen 43 protein), som overlapper med ribosom bindingsstedet i sin egen mRNA. Bindingsstedet indeholder en 8-base loop sekvens, der repræsenterer 65.536 randomiserede varianter til analyse7. For det andet blev tilgangen også selvstændigt anvendt til at påvise, at specifikke bindingssteder eller aptamere til forskellige farvestoffer kan vælges fra en pulje på ca. 1013 sekvenser8. Faktisk er denne fremgangsmåde blevet bredt anvendt i mange forskellige sammenhænge til at identificere aptamers (RNA eller DNA-sekvenser) for binding talrige ligands, såsom proteiner, små molekyler, og celler, og for katalyse9. Som et eksempel, en aptamer kan diskriminere mellem to xanthin derivater, koffein og theophyllin, som adskiller sig ved tilstedeværelsen af en methylgruppe i koffein10. Vi har flittigt brugt denne tilgang (SELEX eller iterativ udvælgelse-forstærkning) til at studere, hvordan RNA-bindende proteiner fungerer i splejsning eller splejning regel11, som vil være grundlaget for diskussionen nedenfor.
Det tilfældige bibliotek: vi brugte et tilfældigt bibliotek med 31 nukleotider. Længden for det tilfældige bibliotek var løst baseret på idéen om, at den generelle splejsning Factor U2AF65 binder sig til en sekvens mellem gren punkts sekvensen og 3 ' Splice-webstedet. I gennemsnit er afstanden mellem disse splejsning signaler i metazoans i intervallet 20 til 40 nucleotides. En anden protein sex-dødelig var kendt for at binde sig til en dårligt karakteriseret regulerende sekvens nær 3 ' Splice site af sit mål præ-mRNA, Transformer. Således valgte vi en tilfældig region med 31 nukleotider, flankeret af primer bindingssteder med restriktionsenzym sites for at tillade PCR forstærkning og fastgørelse af T7 RNA polymerase promotoren til in vitro transkription. Den teoretiske Biblioteks størrelse eller kompleksitet var 431 eller ca. 1018. Vi brugte en lille brøkdel af dette bibliotek til at forberede vores tilfældige RNA-pulje (~ 1012-1015) til de eksperimenter, der er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: figur 1 indeholder en oversigt over de vigtigste trin i processen for iterativ udvælgelse-amplifikation (SELEX).
1. generering af en tilfældig biblioteksskabelon
- Syntetisere Forward primer 5 '- Gtaatacgactcactatagggtgatcagattctgatcca-3 ' og den omvendte primer 5 '-GcgacGgatccaagcttca-3 ' ved kemisk syntese på en DNA-synthesizer.
Bemærk: primere og Random Library kan syntetiseres kommercielt. - Syntetisere en tilfældig bibliotek oligonukleotid skabelon 5 '-GGTGATCAGATTCTGATCCA (N1... N31) tgaagcttggatccgtcgc-3 ' ved kemisk syntese. Brug en ækvimolære blanding af fire phosphoramiditer under syntesen for de 31 randomiserede positioner vist ovenfor som N.
Bemærk: sekvensen af Biblioteks skabelonen indeholder 31 tilfældige nucleotider (N1 til N31) og ledsage sekvenser for bindingen af de fremad-og omvendte Primers. Forward primer indeholder T7 RNA polymerase-promotoren (understreget) til in vitro-transskription og et Begrænsnings websted Bcl1 (kursiseret) til kloning. Den omvendte primer indeholder restriktionsenzym sites BamH1 og hindiii (kursiseret) for at lette kloning.
2. generation af DNA Random Library pool
- Du skal vedhæfte T7 RNA polymerase-promotoren til biblioteket ved polymerasekædereaktion (PCR) indeholdende 1 μM DNA Random Library template, 1 μM af hver primer, 20 mM tris (pH 8,0), 1,5 mM MgCl2, 50 mm kcl, 0,1 μg/μl acetyleret bovint serumalbumin, 2 enheder af Taq < /C1 > polymerase og 200 μM hver af dNTP'er (deoxyguanosin, deoxyadenosin, deoxycytidin og deoxythymidintrifosfat).
- Brug fem cyklusser af denaturering, udglødning og forlængelses trin (94 °C i 1 min, 53 °C i 1 min, og 72 °C i 1 min) PCR efterfulgt af en udvidelses cyklus (72 °C i 10 min).
3. syntese af pool 0 RNA
- Indstil en 100 μL transkriptionsreaktion12. Bland T7 transkriptionsbuffer, 1 μM tilfældigt Biblioteks pulje-DNA, 5 mm ditiotreitol (DTT), 2 mm Guanosintrifosfat (GTP), 1 mm hver af adenosintrifosfat (ATP), cytidintrifosfat (CTP) og uridine trifosfat (UTP) og 2 enheder/μl T7 RNA-polymerase.
Bemærk: RNA kan transskriberes in vitro ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits med mulighed for T7 eller SP6 RNA polymerase. - Ovennævnte reaktionsblanding inkubates i et mikrocentrifuge glas i 2 timer ved 37 °C.
- Gel renser RNA i en 10% denaturering polyacrylamid gel.
- Identificer placeringen af transskriptionerne på gelen ved at farv den med methylenblåt eller Autoradiografi ved at medtage spor af radioaktivitet (0,5 μL eller derunder af α-32P UTP) i transkriptionsreaktionen.
- Læg gelskive i et centrifugeglas og bryd i mindre stykker, for eksempel med en homogenisator spids. Tilsæt proteinase K (PK) buffer (100 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 12,5 mM EDTA, 1% Natriumdodecyl sulfat) at nedsænke gel stykker. Lad røret på en nutator fra 2 h til overnatning ved stuetemperatur.
- Spin i en højhastigheds mikrocentrifuge (14.000 rpm eller 16.873 x g) i 5 minutter ved stuetemperatur for at fjerne gelresterne og genvinde bufferopløsningen.
- Stikprøven vortex to gange med en tilsvarende mængde phenol-chloroform og én gang med chloroform.
- Bland den vandige fase ovenfra med en tiendedel volumen natriumacetat (3,0 M, pH 5,2), 10 μg tRNA eller 20 μg glykogen og ethanol (2 – 3 volumener, opbevaret ved-20 °C). Lad rørene være ved-80 °C i 1 time.
- Drej rørene med opløsningen i 5 – 10 minutter ved 4 °C i en mikrocentrifuge (14.000 rpm eller 16.873 x g). Kassér supernatanten forsigtigt. RNA-piller skylles med 70% ethanol og spinne i 2 – 5 min. sug ethanol forsigtigt. Lufttørre RNA-pellet.
- Det opløseligte RNA-pellet i 50 μL vand behandlet med diethylpyrocarbonat (DEPC). Prøven udtages ved-20 °C til opbevaring.
Bemærk: rense RNA ved hjælp af kommercielt tilgængelige spin kolonner, som i øjeblikket er mere almindeligt anvendt til at fjerne uindarbejdet radioaktivitet og tjene som et hurtigt og mere bekvemt alternativ til RNA rensning.
Forsigtig: Brug et akrylglas skjold, handsker og andre forholdsregler for at beskytte mod radioaktivitet.
4. protein bindende reaktion og adskillelse af bundet RNA
- Bindingen af protein og RNA i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i et volumen på 100 μL ved tilsætning af følgende ingredienser til disse endelige koncentrationer: 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0,09 μg/μL bovint serumalbumin, 0,5 enheder/μL RNasin, 0,15 μg/μL tRNA , 1 mM EDTA og 30 μL passende rekombinant protein (PTB) koncentration. Tilføj RNA fra den relevante pulje.
Bemærk: splejsning-faktoren U2AF65 binder typisk til polypyrimidinkanalen/3 ' Splice-lokaliteter af model introner med en bindingsaffinitet (ligevægts dissociationskonstant eller Kd) på ca. 1 – 10 nm. Derfor de første to runder af bindende anvendte proteinkoncentration 10-Fold over Kd for U2AF65; for SXL-og PTB-proteiner var startkoncentrationen i dette interval kun vores bedste gæt. Dette sikrede, at ønskede RNA arter, der kunne binde, selv om lavere affinitet sekvenser også potentielt bundet. I runder 3 og 4 (transkriptionen, bindingen og amplificeringen) blev proteinkoncentrationen reduceret tre gange (trin 4,1). Dette blev gjort for successivt at eliminere lav affinitet RNA arter. - Rørene, der indeholder bindings reaktionerne, placeres i ca. 30 minutter ved 25 °C i en temperatur blok (eller på is).
- Fraktionere det bundne RNA fra det ubundne RNA for de første 4 runder af markerings forstærkning ved hjælp af følgende trin.
- Prøven filtreres (100 μL) ved stuetemperatur gennem et nitrocellulose filter, der er fastgjort til en vakuum Manifold.
Bemærk: RNA-protein komplekset, men ikke det ubundne RNA, forbliver på filteret. - Hak filteret med bevaret RNA i fragmenter med en steril barberkniv; Indsæt disse i et centrifugeglas. Genoprette RNA ved tumbling røret forsigtigt i mindst 3 h (eller natten) med filter stykker nedsænket i proteinase K (PK) buffer.
- Deproteinize RNA-prøven ved at vortexning det i nærværelse af et tilsvarende volumen af phenol-chloroform (1:1) og derefter af chloroform. Den vandige fase genoprettes hver gang ved at centrifuger prøven ved høj hastighed i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Bland det med natriumacetat (0,1 volumen 3,0 M, pH 5,2) og ethanol (2 – 3 volumener af absolut ethanol, 200 bevis). Lad røret i en-80 °C fryser i 30 min, centrifuge det ved høj hastighed i 10 min, og efter vask og tørring trin (trin 3,8), solubilize RNA i vand behandlet med DEPC. Disse trin er beskrevet ovenfor (trin 3,6 til 3,9).
- Prøven filtreres (100 μL) ved stuetemperatur gennem et nitrocellulose filter, der er fastgjort til en vakuum Manifold.
- De proteinbundne RNA-fraktioner adskilles fra de ubundne fraktioner i de sidste 2 runder (runder 5 og 6; transkriptionen, bindingen og amplificeringen) på følgende måde. Reducer proteinkoncentrationen i bindings reaktionen (trin 4,1) med yderligere tre gange for yderligere markerings Tryk for at berige bindings sekvenser med høj affinitet, og fjern fortrinsvis lav-affinitets sekvenser.
- Pre-Cast en Native polyacrylamid gel (5% med 60:1 acrylamid: bis-acrylamid ratio) i 0,5 x TBE-buffer (Tris-Borat-EDTA) forud for opsætning af ovennævnte RNA: proteinbindende (trin 4,1) reaktion. Elektrophorese denne gel i et koldt rum (4 °C) ved at anvende 250 V i 15 min.
- Afpipettere ovennævnte RNA: proteinbindende reaktioner (trin 4,1) i forskellige brønde af denne gel.
Bemærk: proteinet opbevares ved-80 °c og fortyndes før brug i 20 mm 4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsyre (Hepes), pH 8,0, 20% glycerol, 0,2 mm ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), 0,05% NP-40 og 1 mm ditiotreitol (DTT). Tilsætning af 0,5 – 1,0 mM proteasehæmmer phenylmethane sulfonylfluorid (PMSF) er frivillig. I bindings reaktionen bidrager denne buffer med omkring 6% glycerol, hvilket giver mulighed for direkte indlæsning af prøver i brøndene uden behov for at blande dem med en separat gel-loading buffer. - Fraktionere det bundne RNA fra det ubundne RNA ved hjælp af gel-elektroforese i et kølerum (4 °C) ved 250 V i 1 til 2 timer. Denne proces er også kendt som gel Mobility Shift assay.
Bemærk: varigheden af elektroforese varierer afhængigt af funktionerne i RNA og protein, der anvendes til binding. - Udsæt gelen til en røntgenfilm og Identificer placeringen af det bundne RNA ved hjælp af autoradiography. Skær gelskiven ud med det bundne RNA, og sæt den i et rør.
- Den knuste gele skive i den PK-buffer, der anvendes til eluering i 3 timer eller over natten, inkubates.
- Gentag trin 3,5 til 3,9, som er skitseret ovenfor. Kortvarigt, vortex den elueret RNA prøve energisk først med phenol-chloroform og derefter med chloroform.
- Bland natriumacetat og ethanol med den vandige fase efter chloroform ekstraktion. Efter inkubation i-80 °C fryser, spin ved 4 °C i 5 – 10 minutter for at indsamle RNA-pellet. Du skal vaske RNA-pellet med ethanol og lufttørre det ved at lade låget af røret være åbent. RNA opløses i vand, som er behandlet med DEPC.
Bemærk: Skift til gel Mobility Shift assay for fraktionering tillader eliminering af uønskede RNA-arter, der kunne have været beriget til binding, for eksempel til nitrocellulose filteret her (eller en matrix), der anvendes i de indledende runder for fraktionering.
5. reverse transkriptionen og PCR amplifikation
- Syntetisere cDNA fra det opløste RNA ved hjælp af revers transkriptase og den omvendte primer ved inkubering af 20 μL reaktionen (2 μL 10x RT buffer, 2 μL AMV revers transkriptase, 1 μM omvendt primer, 10 μL RNA, Rnasehæmmer valgfri) ved 42 °C i 60 min.
- Amplificere cDNA ved hjælp af 20 – 25 PCR cyklusser som beskrevet i trin 2,1.
6. transskription og proteinbinding
- Gentag processen med RNA-syntese, proteinbinding, separation af proteinbundet og ubundet fraktion, som beskrevet i afsnit 3 – 5 ovenfor.
7. analyse af RNA-protein interaktioner
- Brug gel Mobility Shift-analysen (trin 4,4) eller filter bindings analysen (trin 4,3) til at bestemme bindingsaffinitet og specificitet for udvalgte puljer eller individuelle sekvenser inden for hver pulje (Se trin 8,3).
- Brug autoradiography eller en fosfor Imager til at detektere og kvantificere bands i den bundne fraktion og ubundne fraktion.
8. kloning og sekvensering
- Fordøje det endelige PCR-DNA-produkt med begrænsnings enzymer Bcl1 og hindiii i 1 – 2 timer, ligere med de passende Ford øjede pGEM3 eller andre plasmider, der transporterer restriktions stederne fra 2 timer til natten, omdanne ligations produktet til kompetente bakterieceller ved varmechok eller elektro portering ved hjælp af standard molekylærbiologiske procedurer13.
- Vokse bakterier natten over ved at plating de transformerede celler på agar plader med Luria-Bertani (LB) medium og ampicillin (50 μg/mL) ved 37 °C. Pick kolonier til at inokulere kulturrør, der indeholder LB flydende medium med ampicillin og vokse ved 37 °C i en ryste inkubator natten over. Purify plasmid DNAs indeholdende DNA skær ved hjælp af en standard plasmid isolation protokol13.
Bemærk: kommercielle kits er tilgængelige for plasmid rensning. - Sekvens plasmiderne med DNA-skær ved hjælp af dideoxy Chain opsigelse sekventering Protocol, efter producentens anvisninger for sekvensering14.
Bemærk: sekvensering kan udføres i hus eller gøres kommercielt.
9. sekvens justering
- Juster sekvenser, og få et konsensus bindingssted (er) ved hjælp af tilgængelige online justeringsværktøjer
(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende observationer viser en vellykket udvælgelse-amplifikation (SELEX). For det første analyserede vi pulje 0 og de valgte sekvenser for binding til det protein, der blev brugt til den iterativ markerings forstærknings metode. Figur 2 viser, at det pattedyrs polypyrimidinbindende protein (PTB) viser knap detekterbar binding til pulje 0-sekvensen, men høj affinitet for den valgte sekvens pulje. Der var næppe detekterbar binding til pulje 0, når vi brugte omkring 300-fold højere proteinkoncentration for binding end anvendt til den valgte pulje. Der var således mindst en flere hundrede gange forskel i proteinbindende tilhørsforhold mellem den tilfældige eller begyndende pulje og den valgte pulje. Denne observation eksperimentelt bekræfter, at udvælgelsen-amplifikation protokol beskrevet her er vellykket.
For det andet, vi sekvenserede den valgte pulje og fastlagt en konsensus binding site. Den konsensus sekvens, som blev opnået ved tilpasningen af de fleste udvalgte sekvenser fra den valgte pulje af pattedyr PTB var: GCCUG (Y/G) UGCYYYYCYYYG (Y/G) CCC. Dette viser, at vi har valgt unikke pyrimidinrige sekvenser, der binder PTB11. Da vi udførte iterativ udvælgelse-forstærkning for RNA-bindende domæne af Drosophila PTB, BERIGEDE vi cu-rige sekvenser afbrudt af guanosines. Blandt de høje affinitets sekvenser, som Drosophila PTB valgte, var en 84% pyrimidinrig SEKVENS: GCUUUCCUCUGUCGCCCUUCUUCGUCCCCUG. Faktisk er denne sekvens ligner den pyrimidin-rige sekvens til stede i Alpha-tropomyosin intron, som binder med høj affinitet til og er reguleret af pattedyr PTB15. Vi har med succes brugt denne fremgangsmåde gentagne gange til at studere RNA-bindende egenskaber og funktioner splejsning regulatorer og en splejsning faktor11,15,16. Tabel 1 viser vellykkede eksempler på RNA-bindende proteiner, for hvilke SELEX blev anvendt til at identificere deres foretrukne eller konsensus bindingssted (er).
For det tredje viser en in vitro-splejsning-analyse, som er baseret på alternativ 3 ' Splice-websteds valg, funktionel relevans af særskilte, men overlappende RNA-bindings karakteristika af polypyrimidinbindende proteiner. Der henviser til, at der som standard anvendes et upstream 3 ' spind-site, idet tilsætning af det rekombinante PTB fører til aktivering af det alternative eller efterfølgende 3 ' Splice-websted (figur 3). I modsætning hertil, tilsætning af rekombinant hnRNP C17 fører til undertrykkelse af både 3 ' Splice sites. Tilsætning af den rekombinante generelle splicingfaktor U2AF65 Reverserer den hnRNP C1-medierede 3 ' Splice site undertrykkelse (figur 3) samt PTB-mediated effekt på downstream 3 ' Splice site aktivering (data ikke vist). En simpel forklaring på disse virkninger er en direkte konkurrence mellem bindingen af den generelle Splice faktor U2AF65 og PTB (også kaldet hnrnp I), som fortrinsvis binder til og undertrykker visse 3 ' splejsninger-lokaliteter eller mellem U2AF65 og hnRNP C, som binder til og undertrykker begge 3 ' Splice sites.
Figur 1: Resumé af de vigtigste trin i iterativ udvælgelse-amplifikation proces (SELEX). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: berigelse af PTB-bindende RNAs. Stigende koncentration (fyldte trekanter) af rekombinant PTB blev anvendt med enten radioaktivt mærket pool 0 RNA eller den valgte pulje opnået efter seks runder af udvælgelse og forstærkning. Positioner af ubundet RNA og RNA: protein komplekset er indiceret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Splice site switching assay validerer særskilte bindings forhold for pyrimidinbindende proteiner. (A-top) Skemaer af splejnings substrat. Splejsning substrat indeholder en 5 ' Splice site og to alternative 3 ' Splice sites ledsage intron. Rektangler (åbne, med vandrette streger og fast) er exons, og linjen er en intron. (A-bottom) hnRNP C1 undertrykker opstrøms 3 ' Splice-webstedet (uden aktivering af downstream 3 ' Splice-webstedet), mens PTB fører til aktivering af downstream 3 ' Splice-webstedet. Splejsning substrat blev inkuberet i en Hela celle nukleare ekstrakt. Splejsning produkter (vist på siderne) blev analyseret ved hjælp af en primer forlængelse assay18 med Splice-Junction primere (pile), som genkender splejsning af den fælles 5 ' Splice site til enten upstream eller downstream 3 ' Splice site. B) rekombinant U2AF65 (rU2AF65) vender den repressive virkning af hnrnp C1. Tilsætning af de rekombinante hnrnp C1-, PTB-eller rU2AF65 -proteiner til splejsning-reaktionen er indikeret med +-symbolerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protein | Foretrukne sekvens (er) |
| U2AF65 | U-rige indeholdende CS |
| Sxl | U-rige indeholder 2-4 GS |
| Ptb | UCUUC-rig med nogle GS |
| hnRNP C1 | U-Rich (5-6 lang) |
| CstF64 | GU-Rich |
| hnRNP E1/E2 og K | C-rige |
| U2AF65/U2af35 heterodimer | UUUYYYYUNUAGGU |
Tabel 1: foretrukne bindingssteder for visse RNA-bindende proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nukleinsyre bindende proteiner er vigtige regulatorer af dyre-og plante udvikling. Et centralt krav til SELEX-proceduren er udvikling af en analyse, der kan anvendes til at adskille proteinbundne og ubundne RNA-fraktioner. I princippet kan denne analyse være en in vitro-bindings test, såsom filter bindende assay, gel Mobility Shift-analysen eller en matrix bindings analyse19 for rekombinante proteiner, rensede proteiner eller protein komplekser. Analysen kan også være en enzymatisk analyse, hvor prækursorerne og produkterne (eller mellemprodukter) kan adskilles baseret på størrelse eller andre midler20.
Mens mutagenese har været almindeligt anvendt til at karakterisere bindende steder for proteiner, det er omstændelig, og tidskrævende og længere sekvenser er ikke så let modtagelig for mætning mutagenese. Betydningen af den iterativ binding og amplifikation tilgang beskrevet her er, at ikke alene er det overvinde nogle af de ovennævnte begrænsninger, kan det vigtigst identificere tidligere ukendte bindingssteder og give vigtige oplysninger om nukleotidbehov ved hver position på samme tid.
En vigtig overvejelse for succesen af iterativ udvælgelse-amplifikation er bindende affinitet og specificitet. Typisk, 12 til 15 runder af udvælgelse-amplifikation er ansat og et sekvens område på 1012 til 1015 molekyler kan rutinemæssigt udtages prøver. Fremskridtene og den eventuelle succes med udvælgelses forstærknings protokollen kan overvåges ved hjælp af en bindende analyse eller direkte sekvensering, som overvåger affiniteten for eller berigning af specifikke sekvenser i henholdsvis mellemliggende puljer. Mens bindings analysen traditionelt blev anvendt, giver fremkomsten af den næste generation sekvensering analyse af sekvens berigelse på måder, der ikke er muligt ved manuel sanger sekvensering14.
Et kritisk skridt i succesen med SELEX er fold berigelse af de ønskede molekyler ved hvert trin. Antallet af cyklusser, der kræves for SELEX varierer og afhænger af flere faktorer. For eksempel, hvis fold-berigelse af ønskede eller specifikke sekvenser er højere i hver runde, vil færre runder være tilstrækkelig. Men hvis en analyse tillader en høj andel af uønskede sekvenser i den bundne pulje, vil yderligere runder blive nødvendige for at berige ønskede RNA-sekvenser. En begrænsning af teknikken eller en utilsigtet konsekvens af behovet for yderligere cyklusser af udvælgelse-forstærkning, der skal holdes i tankerne, er muligheden for, at det kan indføre artefakter eller berige sekvenser, der har ikke-relaterede egenskaber såsom deres evne til at forstærke. Endelig, mens nogle applikationer drage fordel af de højeste affinitets bindere, til andre formål, skal en balance være ramt under udvælgelsen-amplifikation proces mellem binding affinitet og funktion, fordi strammeste bindende sekvenser ikke nødvendigvis være de mest funktionelle sekvenser i biologiske sammenhænge (f. eks. Hvis en sekvens genkendes flere gange af forskellige proteiner under splejningen).
Blandt de ændringer og fejlfinding for at forbedre proceduren, negative udvælgelse eller Counter udvælgelse kan anvendes til at øge specificitet. Tilsvarende kan brugen af forskellige partitioneringsprotokoller, såsom filter bindings analysen efterfulgt af gel Mobility Shift-analysen, eliminere tilsætning af uønskede sekvenser, der binder for eksempel til nitrocellulose filteret eller en kolonne matrix21. Da proteiner-nukleinsyre interaktioner har både specifikke og ikke-specifikke komponenter, buffer betingelser såsom salt og pH har virkninger på RNA-protein interaktioner. Desuden kan anvendelse af passende proteinkoncentration have en direkte virkning på fastholdelse af stærke, svage og ikke-specifikke bindemidler. Selektions trykket kan øges i successive runder, for eksempel ved at medtage en konkurrent RNA, reducere proteinkoncentrationen, eller reducere inkubationstiden. Derfor kan omhyggelige overvejelser og optimering af disse parametre påvirke udfaldet af SELEX-protokollen.
For nylig er der udviklet mange variationer eller modifikationer af den oprindelige SELEX-protokol, som overvinder nogle af ovennævnte begrænsninger. Disse omfatter høj gennemløb-SELEX (HT-SELEX), som kombinerer SELEX og massivt parallel sekvensering6, rnacompete, som involverer inkubation med overskydende ikke-tilfældige RNA, pull-down af det bundne RNA, fluorescerende mærkning af RNA og analyse på microarrays5, RNA bind-n-SEQ, som kombinerer RNA Affinity analyse i en kvantitativ og høj gennemløb mode22, og Rapid-SELEX, som forkorter processen og omfatter en ikke-amplifikation trin23.
Kemisk modificerede baser er blevet brugt til at udvide repertoire af RNA-molekyler til specifikke anvendelser24. Diagnostik, Therapeutics, samt molekyler med katalytiske aktiviteter er blandt de mange applikationer (herunder i medicin) af de udvalgte molekyler25. Aptamers supplerer antistof-baserede protokoller og giver fremragende værktøjer, hvis potentiale, for eksempel i diagnostik, Therapeutics, og andre applikationer, er stadig at blive udnyttet fuldt ud26,27,28. I fremtiden, for eksempel, kliniske fordele er blandt de mange ønskede applikationer, ud over hvad den første FDA-godkendte aptamer (Pegaptanib natrium) kunne levere til aldersrelaterede makuladegeneration. Den skalerbare proteomisk teknologi til protein målinger giver et skridt i retning af at forstå sundhed og sygdomme24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer, at han ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatteren takker National Institutes of Health for tidligere finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Recombinant PTB | Laboratory Preparation | Not applicable | |
| Reverse Transcriptase | NEB | M0277S | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| X-ray films | Standard | Standard |
References
- Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (3), 784-788 (1975).
- Breathnach, R., Chambon, P. Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual Review of Biochemistry. 50, 349-383 (1981).
- Wickens, M., Stephenson, P. Role of the conserved AAUAAA sequence: four AAUAAA point mutants prevent messenger RNA 3' end formation. Science. 226 (4678), 1045-1051 (1984).
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15 (20), 8125-8148 (1987).
- Ray, D., Ha, K. C. H., Nie, K., Zheng, H., Hughes, T. R., Morris, Q. D. RNAcompete methodology and application to determine sequence preferences of unconventional RNA-binding proteins. Methods. 118, 3-15 (2017).
- Jolma, A., et al. Multiplexed massively parallel SELEX for characterization of human transcription factor binding specificities. Genome Research. 20 (6), 861-873 (2010).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Cowperthwaite, M. C., Ellington, A. D. Bioinformatic analysis of the contribution of primer sequences to aptamer structures. Journal of Molecular Evolution. 67 (1), 95-102 (2008).
- Jenison, R. D., Gill, S. C., Pardi, A., Polisky, B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science. 263 (5152), 1425-1429 (1994).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 180, 51-62 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Robida, M., Sridharan, V., Morgan, S., Rao, T., Singh, R. Drosophila polypyrimidine tract-binding protein is necessary for spermatid individualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2010).
- Banerjee, H., Rahn, A., Gawande, B., Guth, S., Valcarcel, J., Singh, R. The conserved RNA recognition motif 3 of U2 snRNA auxiliary factor (U2AF(65)) is essential in vivo but dispensable for activity in vitro. RNA. 10 (65), 240-253 (2004).
- Gorlach, M., Burd, C. G., Dreyfuss, G. The determinants of RNA-binding specificity of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C proteins. J Biol Chem. 269 (37), 23074-23078 (1994).
- Valcarcel, J., Singh, R., Zamore, P. D., Green, M. R. The protein Sex-lethal antagonizes the splicing factor U2AF to regulate alternative splicing of transformer pre-mRNA. Nature. 362 (6416), 171-175 (1993).
- Wilson, C., Szostak, J. W. Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity. Chemistry & Biology. 5 (11), 609-617 (1998).
- Joyce, G. F.
- McKeague, M., Derosa, M. C. Challenges and opportunities for small molecule aptamer development. Journal of Nucleic Acids. 2012, 748913 (2012).
- Lambert, N., Robertson, A., Jangi, M., McGeary, S., Sharp, P. A., Burge, C. B. RNA Bind-n-Seq: quantitative assessment of the sequence and structural binding specificity of RNA binding proteins. Molecular Cell. 54 (5), 887-900 (2014).
- Szeto, K., et al.
- Rohloff, J. C., et al. Nucleic Acid Ligands With Protein-like Side Chains: Modified Aptamers and Their Use as Diagnostic and Therapeutic Agents. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, e201 (2014).
- Gold, L., et al. Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One. 5 (12), e15004 (2010).
- Zhuo, Z., et al. Recent Advances in SELEX Technology and Aptamer Applications in Biomedicine. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Blind, M., Blank, M. Aptamer Selection Technology and Recent Advances. Molecular Therapy. Nucleic Acids. 4, e223 (2015).
- Jijakli, K., et al.
