Summary
대류 강화 전달 (CED)은 큰 조직 볼륨의 직접 관류에 의해 뇌로 치료제의 효과적인 전달을 가능하게하는 방법입니다. 절차는 카테터와 최적화 된 주입 절차의 사용을 필요로한다. 이 프로토콜은 마우스 뇌로 항체의 CED에 대한 방법론을 설명합니다.
Abstract
대류 강화 전달 (CED)는 카테터 시스템을 사용하여 큰 뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게하는 신경 외과 기술입니다. 이러한 접근법은 혈액 뇌 장벽(BBB)을 우회하여 안전한 전달 방법을 제공하므로 BBB 투과성이 좋지 않은 치료제 또는 전신 노출이 바람직하지 않은 치료제(예를 들어 독성으로 인한 치료)를 허용합니다. CED는 카테터 설계, 주입 프로토콜 및 난간 특성의 최적화가 필요합니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 마우스의 카우데이트 푸타멘내로 항체의 최대 20 μg를 포함하는 용액의 CED를 수행하는 방법을 기술한다. 그것은 단계 카테터의 준비를 설명하고, 시험관 내에서 시험하고 램핑 주입 프로그램을 사용하여 마우스에서 CED를 수행합니다. 프로토콜은 다른 주입 볼륨에 대해 쉽게 조절될 수 있으며 화학요법, 사이토카인, 바이러스 입자 및 리포좀을 포함한 다양한 트레이서 또는 약리활성 또는 비활성 물질을 주입하는데 사용할 수 있습니다.
Introduction
혈액 뇌 장벽 (BBB) 혈액 순환에서 중추 신 경계를 분리 하는 반 투과성 국경을 형성 (CNS). 그러나 치료와 함께 CNS에 도달하는 것은 뇌종양, 알츠하이머 병 (AD) 또는 파킨슨 병 (PD)과같은 다양한 질병의 맥락에서 필요하다 1. 이것은 새로운 치료법의 개발에 중요하게 되고, 특히 시험된 약물이 BBB 투과성이 좋지 않거나전신 노출이 위험한 독성으로 이어질 수 있는 경우 1,2. 임상적으로 사용된 항체 중 일부는 이러한 두 가지 특징을 모두 표시한다. 이 문제에 대한 해결책은 BBB 바로 뒤에 치료제를 전달하는 것입니다.
대류 강화 배달 (CED) 큰 두뇌 볼륨의 효과적인 관류를 가능하게 하는 신경 외과 기술입니다. 이것은 표적으로 한 지역에 하나 이상의 카테터를 외과적으로 설치함으로써 달성됩니다. 약물 적용 중에 카테터의 개구부에서 압력 구배가 형성되며, 이는 조직3,4에서난간 분산의 원동력이됩니다. 따라서 관류 범위 2,4,5를결정하는 확산 계수가 아닌 주입의 지속 시간입니다. 이는 종래의 확산기반 내뇌주사 방법2,6에비해 훨씬 더 큰 뇌부피에 대한 배음의 균일한 전달을 제공한다. 동시에,이 전달 양식은 조직 손상의 낮은 위험을 갖는다2. 따라서, CED는 CNS 종양의 치료를 위한 기존의 화학치료제의 안전하고 효과적인 투여를 가능하게 할 수 있으며, 다른 CNS 장애 2에서 면역조절제 또는 작용작용및 길항항체의 전달을 가능하게 할 수 있다2 ,7,8,9. CED는 현재 파킨슨 병, 알츠하이머 병뿐만 아니라 고급 신경교종 2, 7,8,10,11의치료법에서 테스트됩니다.
카테터 설계 및 주사 요법은 CED 10,12,13,14,15,16의결과에 영향을 미치는 가장 중요한 요인 중 하나입니다. 더욱이, 입자의 적당한 크기, 음이온 전하 및 낮은 조직 친화도 10,17을포함하는 난간내 특이적 물리화학적 특성을 요구한다. 이들 파라미터각각은2,10,17을표적으로 하는 뇌 영역의 조직학적 특징에 따라 잠재적으로 조정되어야 한다.
여기에서 우리는 마우스의 카우데이트 푸타멘 (striatum)으로 항체 용액의 CED를 수행하기위한 방법론을 설명합니다. 또한, 프로토콜은 실험실 설정에서 스텝 카테터의 준비를 포함, 시험관내에서 테스트 및 CED를 수행.
캐뉼라의 모양, 사용되는 재료 및 카테터 개구부 수(12,15,18,19,20)에 따라 문학에서 사용할 수있는 여러 카테터 디자인이있습니다. ,21,22. 우리는 무딘 말단 금속 바늘에서 1mm 돌출된 융합실리카 모세관으로 만든 스텝 카테터를 사용하고 있습니다. 이러한 카테터 설계는 연구실험실에서 쉽게 제조될 수 있으며, 생체내 뇌의 자렌치마(23)와 유사한 물리적 파라미터를 가진 아가로즈 블록을 시험관내에서 시험할 때 좋은 CED 결과를 재현할 수 있다.
또한, 우리는 생체 내에서 5 μL의 난파를 전달하기위한 램핑 요법을 구현합니다. 이러한 프로토콜에서 주사 속도는 0.2 μL / min에서 최대 0.8 μL / min로 증가하므로 카테터를 따라 소화기 역류의 기회와 조직 손상 의 위험을 최소화합니다16. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 11 분 30 초의 과정을 통해 PBS의 5 μL에서 항체의 최대 20 μg를 가진 마우스를 성공적으로 관리했습니다.
프로토콜은 다른 주입 볼륨또는 화학 요법, 사이토 카인, 바이러스 입자 또는 리포좀 2,10,14,18과 같은 다양한 다른 물질을 주입하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. ,22. 항체의 인산완충식염수(PBS) 또는 인공 뇌척수액(aCSF) 용액에 비해 극히 다른 물리화학적 특성을 가진 침심물을 사용하는 경우 추가적인 검증 단계가 권장됩니다. 카테터 어셈블리, 검증 및 CED의 경우 일반 입체 프레임에 장착된 드릴 및 사출 유닛이 있는 입체 로봇을 사용하는 모든 단계를 설명합니다. 이 절차는 또한 설명된 유리 미세 시링거를 구동할 수 있는 프로그래밍 가능한 미세 주입 펌프에 연결된 수동 입체 프레임으로 수행될 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 스위스 주 수의학 사무소의 라이센스 번호 ZH246/15에 따라 승인되었습니다.
1. 스텝 카테터 의 준비
- 카테터의 단계에 대한 융합 실리카 튜브의 제조
- 융합된 실리카 모세관을 내경 0.1mm, 벽 두께 0.0325mm의 두께로 30mm 길이로 자른다.
- 튜브 개구부가 매끄러운 표면을 가지고 있는지 확인하기 위해 마이크로 포지를 사용하여 끝을 균열 및 열 연마 튜브를 검사합니다.
- 금속 바늘에 내부 튜브의 고정
- 10 μL 주사기에 27 G 바늘을 장착하고 주사기를 입체 로봇에 놓습니다.
- 로봇을 사용하여 주사기를 단단한 표면 위로 이동하고 바늘 끝으로 만지다. 이 위치는 카테터 단계의 길이를 설정하기위한 참조 표면 역할을하기 때문에 소프트웨어에 주목하거나 저장해야합니다.
- 바늘 내부에 융합 실리카 모세관의 배치를 가능하게하기 위해 바늘을 상승
- 융합된 실리카 모세관을 바늘에서 20mm의 모세관이 돌출되도록 바늘에 놓습니다.
- 피펫을 사용하여, 도2에 도시된 바와 같이, 금속 바늘로부터 시작하여 모세관의 하부 말단 위로 10 mm를 마무리하여 모세관 위에 고점도 시아노아크릴레이트 접착제의 2 μL을 고르게 퍼낸다.
- 입체 로봇을 사용하여 금속 바늘의 끝이 기준 표면 위에 1mm가 될 때까지 바늘을 낮춥시됩니다. 이렇게 융합된 실리카 모세관은 금속 바늘에 고정되고 금속 바늘의 끝에서 1mm 단계를 형성할 것이다. 금속 바늘 끝에 형성되는 접착제의 과잉을 제거하여 단계를 무디게하지 않도록하십시오.
- 접착제가 굳어지고 스테레오틱 로봇에서 카테터로 주사기를 제거할 때까지 15분 기다립니다. 단계에서 현미경으로 카테터의 끝을 확인하여 모든 여분의 접착제가 제거되었는지 확인하십시오.
- 아가로오스 블록을 사용하여 스텝 카테터 테스트
- 종래의 겔 트레이에 PBS로 0.6% 아가로즈 용액을 준비하고 중합될 때까지 기다립니다. 아가로즈를 약 20mm x 20mm 블록으로 자른다. 사용할 때까지 블록을 PBS에 담그십시오.
- 스텝 카테터 주사기를 여과된 트라이판 블루의 0.4% 용액 10 μL로 수동으로 채웁니다.
- 입체 로봇을 사용하여 고정 절차 중에 카테터 의 단계의 밀봉을 평가하기 위해 0.2 μL / min에서 1 μL을 분배하십시오. 트라이판 블루 용액은 카테터의 끝에서만 볼 수 있어야합니다. 종이 티슈로 닦아냅니다.
- 입체 로봇에 아가로즈 블록을 놓고 카테터의 끝이 아가로즈 블록의 표면에 대해 참조되도록 로봇을 보정합니다.
- CED에 대한 사출 매개변수를 프로그래밍합니다.
- 5 μL의 주입 량의 경우, 다음 단계를 사용하십시오: 0.2 μL/min에서 1 μL, 0.5 μL/min에서 2 μL, 0.8 μL/min에서 2 μL. 각 단계의 지속 시간을 비례적으로 변경하여 특정 실험 계획에 따라 최종 주입 량을 조정합니다.
- 무린 카우데이트 푸타멘 (striatum)에 용액을 주입하기 위해, 3.5 mm의 깊이에서 브레그마에서 위치 1mm 정면 및 1.5-2 mm 측면에서 이러한 주입을 수행합니다.
- 주입 후 카테터를 2 분 동안 제자리에 둔 다음 1mm / min에서 후퇴하여 뇌의 유체분산과 카테터 제거 시 주입 관의 밀봉을 보장하십시오.
참고: 사용되는 특정 입체 로봇에 따라 모든 매개 변수를 단일 스크립트로 프로그래밍할 수 있습니다. 예제 스크립트는 보조자료로 사용할 수 있습니다.
- CED 절차를 시작하고 아가로즈 블록에 트라이판 블루 용액 5 μL을 주입합니다.
- 아가로스에서 트라이판 블루의 구름 의 모양과 카테터 관을 따라 잠재적 인 누설을 평가합니다. 트립판 블루는 카테터 팁 주위의 중심과 적어도 1mm의 직경과 타원형 또는 둥근 구름을 형성한다. 금속 바늘 의 끝을 통해 주요 역류가 볼 수 없습니다.
- 새로운 아가로즈 블록을 놓고 아가로스와 카테터의 막힘을 평가하기 위해 0.2 μL / min에서 1 μL의 두 번째 주입을 시작합니다. 트립판 블루는 다시 주입의 시작 직후 카테터의 끝에서 구름을 형성하기 시작한다.
- 주사기내의 남은 부피가 3 μL에 해당하는지 평가한다. 모든 변형은 카테터 장착 또는 주사기 플런저를 통해 유체누출을 가리킬 수 있습니다.
- 모든 테스트 주사가 성공하면 카테터가 잘 밀봉되고 직선이며 트라이판 블루 용액이 카테터 팁이 아닌 다른 지점에서 관찰되지 않고 탈이온 H2O (dH2O)로 카테터를 씻어 트라이판 블루의 흔적이 보이지 않습니다. 이어서 10회 세척한 후 70% 에탄올과 100% 에탄올을 세척한 다음 70% 에탄올로 다시 세척하고 깨끗한 탈이온수를 세척합니다.
- 카테터를 건조한 조건에서 보관하십시오.
2. 뮤린 뇌에 항체 용액의 대류 강화 전달
참고: 지역 동물 복지 규정에 따라 다양한 유형의 마취제, 진통제 및 항생제가이 절차를 위해 시행 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 주사 마취의 사용을 설명합니다. 이소플루란과 같은 흡입 마취제는 또한 입체 프레임에 코 마스크를 장착하여 사용할 수 있습니다. 또한 감염 예방을 위해 식수에 항생제를 추가하는 것이 좋습니다.
- 수술 설정
- 마취제 및 해독제를 준비하십시오. 마우스는 펜타닐 (0.05 mg/kg), 미다졸람 (5 mg /kg) 및 메데토미딘 (0.5 mg /kg)을 함유 한 3 성분 마취를 사용하여 멸균 dH2O로 안전하게 마취 할 수 있습니다. 우리는 멸균 dH2O (첫 번째 해독제 용액)에서 플루마제닐 (0.5 mg / kg)과 부프레 노르핀 (0.1 mg / kg)을 함유 한 두 가지 해독제 용액을 사용하여 2 단계 웨이크 업 절차를 수행합니다. 두 번째 는 멸균 dH2O (두 번째 해독제 용액)에 아티파메졸 (2.5 mg / kg)을 함유하고 있습니다.
- 멸균 dH2O로 희석 된 카프로펜 (5.667 mg / kg)을 함유 한 진통 용액을 준비하십시오.
- 입체 프레임, 난방 패드 및 입체 로봇의 요소를 청소합니다. 로봇의 모든 부품을 손상 위험 없이 청소할 수 있는 것은 아닙니다. 청소 및 사용 준비에 대한 자세한 내용은 로봇 매뉴얼을 참조하십시오.
- 스텝 카테터로 주사기를 조립하고 dH 2O,70% 에탄올 및 100% 에탄올로 여러 번 세척한 다음 70% 에탄올 및 dH2O로 다시 플러싱합니다. 마지막으로, 두개내 주사용액의 준비에 사용할 PBS 또는 다른 완충제(예: 인공 뇌척수액)로 주사기를 플러시합니다. 주사기의 플런저는 전체 절차 중에 원활하고 자유롭게 움직여야합니다.
- 입체 적 프레임으로 입체 로봇 소프트웨어를 보정합니다.
- 로봇 팔이 자유롭게 움직이고 사출 펌프가 제대로 연결되어 있는지 확인하여 입체 로봇 소프트웨어를 테스트하고 방해없이 CED 절차를 수행할 수 있습니다. 여기에는 로봇 이동 테스트, 램핑 주입, 2분 대기 단계 및 카테터 후퇴 속도 확인이 포함됩니다. 모든 매개 변수는 점 1.3.5에 설명된 미리 프로그래밍된 CED 절차에 맞아야 합니다.
- 드릴에 드릴 비트를 삽입합니다. 사용하기 전에 드릴 비트를 소독하는 것이 좋습니다.
- PBS 또는 aCSF와 같은 다른 완충 액을 사용하여 항체 용액을 준비합니다. 5 μL에서 항체의 1 ~ 20 μg는 단일 CED 절차로 주입 될 수있다. 다른 부적 및 단백질 양은 실험을 수행하기 전에 시험되어야 한다. 점도가 높은 솔루션을 사용하면 카테터 막힘이 발생할 수 있습니다.
- 희석 된 항체로 주사기를 수동으로로드하십시오.
- CED에 의한 항체 주입을 줄무늬로
- 마우스를 무게와 체중에 따라 각막에 세 성분 마취 용액을 주입. 사출 시간을 기록합니다. 가열 패드로 가열된 별도의 케이지로 마우스를 옮김.
- 마우스를 관찰하여 언제 완화가 시작되는지 확인합니다. 마우스가 움직이지 않는 즉시, 수술 중 각막이 건조해지는 것을 막기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 전체 감미는 일반적으로 3 성분 마취 용액의 주입에서 10-15 분 시작됩니다.
- 동물의 완전한 마취를 보장하기 위해 핀치 반사 테스트를 사용하여 통증 반응을 확인하십시오.
- 헤어 트리머를 사용하여 머리를 면도하십시오.
- 요오드 용액에 담근 면봉으로 피부를 소독하십시오. 피부를 원을 그리며 세 번 문질러 주세요.
- 메스를 사용하여 눈 높이에서 두개골 중간선을 따라 10mm 피부 절개를 합니다.
- 노즈 클램프와 이어 바를 사용하여 마우스를 입체 프레임에 고정합니다. 두개골 표면이 수평으로 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 정확한 해부학 적 탐색 외에도 이것은 또한 드릴링 및 CED 절차 동안 두개골의 기울기를 피하기 위해 중요합니다.
- 주사기가 입체 로봇에 놓습니다.
- 드릴 비트를 참조점에서 카테터 팁과 동기화합니다. 드릴과 주사기의 위치 사이의 관계가 소프트웨어에서 정확하게 결정되므로 주사는 뇌의 원하는 해부학 적 영역에서 수행 될 수 있습니다.
- 집게를 사용하여 피부를 철회하고 두개골 표면에 bregma를 지역화하십시오.
- 드릴 비트의 팁을 사용하여 소프트웨어의 bregma를 참조합니다.
- 드릴을 브레그마에서 1mm 정면 및 측면 2mm 위치로 이동하고 버 구멍을 뚫습니다. 경막이 손상되지 않도록 주의하십시오.
- 버 구멍 위로 주사기를 이동합니다.
- 주사기에서 0.5-1 μL을 분배하여 카테터에 기포가 남지 않도록 합니다.
- 포인트 1.3.5에 설명된 CED 프로그램을 시작합니다. 주사 지점에서 유체 역류의 흔적이 있는지 두개골 표면을 관찰하십시오. 동물의 호흡 속도를 모니터링합니다.
- CED 프로그램이 끝나면 카테터가 뇌에서 철회되면 CED 동안 카테터 막힘이 있는지 확인하기 위해 0.2 μL /min에서 주입 펌프를 시작합니다. 막힘이 발생하지 않으면 카테터 팁에서 나오는 주사 믹스 방울이 즉시 표시됩니다.
- 카테터를 재사용하거나 보관하기 전에 카테터 단계를 육안으로 검사하여 현미경으로 손상또는 마모의 징후를 검사하고 1.3.10 단계에서와 같이 청소하십시오.
- 시술을 깨우기
- 입체 프레임에서 마우스를 부드럽게 제거합니다.
- 멸균 식염수로 수술 부위를 씻으소서.
- 집게를 사용하여 버 구멍을 뼈 왁스로 채웁니다.
- 얇은 팁 집게로 피부를 닫고 절단 위에 10 μL 파이펫으로 수술 용 접착제를 적용합니다. 접착제가 중합될 때까지 15-30s기다립니다.
- 피하 주사로 진통 용액을 적용하십시오. 주입 시간을 기록하십시오.
- 첫 번째 해독제 용액을 적용합니다. 주입 시간을 기록하십시오.
- 가열 패드가있는 별도의 케이지에 마우스를 전송하고 깜짝 반사에 대한 동물을 모니터링합니다.
- 마우스가 제1 해독제 용액을 투여한 후 15분 후에 완전한 의식을 얻지 못하면, 피하 주사에 의해 제2 해독제 용액을 적용한다.
- 회복 단계에서 동물을 모니터링합니다.
- 수술 후 합병증에 대한 다음 날뿐만 아니라 1-2 시간 나중에 확인하십시오. 필요한 경우 진통을 다시 적용하십시오.
- 감염 예방을 위해, 설파독신(최종 농도 0.08% w/v)과 트리메토프림(최종 농도 0.016% w/v)을 동물이 수술 후 1주일 동안 광고 리비툼에 접근할 수 있는 식수에 추가합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 실험실 환경에서 CED절차에서 사용하기 위한 단계 카테터(그림 1)의 제조를 가능하게 한다. 카테터를 누출, 바늘 관을 따라 역류 및 막힘에 대한 카테터를 제어하려면 염료(예: 트라이판 블루 용액)를 아가로즈 블록으로 주사하는 것이 좋습니다. 도 3은 CED 카테터를 사용하여 0.5 μL/분에서 1 μL의 주입 후 트라이판 블루 형성의 구름을 도시한다(도3A). 카테터 단계의 시작 부분에 바늘 관을 따라 역류가 보이지 않았습니다. 더욱이, 분산된 구름은 원하는 구형 형상을 형성했다. 이는 현저한 역류가 관찰될 수 있는 종래의 27G 무딘 말단 바늘(도3B)을사용하여 얻은 결과와 대조적이다.
또한 CED는 최적화된 주입 절차가 필요합니다. 도 4는 프로토콜(A)에 기재된 램핑 절차를 이용하여 2 μL의 트리판 블루를 아가로즈 블록내로 주입한 결과를 2 μL/분(B)의 꾸준한 속도로 주사한 결과와 비교한 것이다. 높은 주입 속도는 CED 카테터를 사용하는 경우에도 카테터를 따라 역류를 강요했다.
마지막으로, 그림 5에도시된 바와 같이, CED는 뮤린 뇌의 대량 의 관류를 가능하게 한다. 마우스를 CED(상부 패널) 또는 종래의 볼루스 주사(하단 패널)에 의해 PBS의 5 μL에서 FITC-dextran과 결합된 랫트 항마우스 TNFα 항체를 주사하였다. CED의 관류 프로필은 종래의 주사보다 더 균일하고 적은 조직 손상을 관찰할 수 있었다. 두 경우 모두 코퍼스 캘로섬 위에 항체 및 덱스렌 입자의 전형적인 분포 프로파일이 있었다. 그러나, 주입된 항체의 분산 프로파일은 고분자량 덱젠보다 더 확산되었고, 상이한 난간 사이의 분포에서의 차이를 예시했다.
그림 1: CED 스텝 카테터 팁을 보여주는 회로도 도면. 정면 (A) 및 측면 (B) 보기. 구성표는 확장까지 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 접착제의 적용 영역을 나타내는 회로도 도면입니다. 융합 실리카 튜브의 상부 10mm는 금속 바늘에 삽입됩니다. 금속 바늘 의 끝에서 시작하여 튜브의 10mm에 접착제를 적용합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CED 카테터 또는 무딘 말단 바늘을 사용한 주입 결과의 비교. CED 카테터(A)와 27G 무딘 엔드 니들(B)을 이용하여 0.5 μL/분에서0.6% 아가로즈 블록에 0.4% 트라이판 블루의 1 μL을 주입하였다. 카테터 또는 바늘 철수 직후 찍은 사진. 크로스는 카테터 또는 바늘의 끝을 표시합니다. 배율 표시줄 = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 꾸준한 속도 프로토콜로 CED 프로토콜을 램핑하는 주입 결과 비교. 램핑 CED 프로토콜을 사용하여 0.6% 아가로즈 블록에 0.4% 트라이판 블루 2 μL을 주입한 다음 0.8 μL/min에서 0.8 μL/ min 및 0.8 μL(A) 또는 2 μL/min 의 안정율 주입 프로토콜(B)을 사용합니다. 두 경우 모두 CED 카테터를 사용했습니다. 카테터 철수 직후 찍은 사진. 크로스는 카테터의 끝을 표시합니다. 배율 표시줄 = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: CED 또는 통상의 볼루스 주사에 의한 뮤린 줄무액 관류의 대표적인 결과. 마우스를 5 μL의 분자량 2,000 kDa와 FITC-Dextran의 1 μg와 결합된 쥐 항 마우스 TNFα 1 μg의 1 μg으로 줄무늬(포면 1 mm 정면 및 브레그마로부터의 2 mm 측면, 3.5 mm)에 주입하였다. CED 프로토콜(상부 패널) 또는 종래의 볼루스 주사(27 G 바늘, 주사율 1 μL/분)를 수행하였다(아래). 마우스는 CED 시술 직후 대조CO2 질식에 의해 희생되었고 PBS에서 4% 포름알데히드로 침공하였다. 뇌는 24시간 동안 4°C에서 PBS에서 4% 포름알데히드로 해부되고 추가로 고정되었다. 이어서, 뇌를 60분 동안 15% 자당으로 세척하고 4°C에서 30% 자당으로 옮겼다. 24 시간 후, 뇌는 드라이 아이스에 얼어 붙었다. 자유 부동 부동 부류 섹션(25 μm)은 알렉사 플루어 647과 결합된 폴리클로날 염소 항쥐IgG(H+L) 항체를 사용하여 염색하고 DAPI로 반점화하였다. 이미지는 ImageJ의 피지 분포를 사용하여 처리되었다. 10x 배율, 스케일 바 = 5 mm. 그룹당 4 마우스; 대표 사진이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
대류 강화 된 배달, 또는 뇌에 압력 매개 약물 주입, 처음에 처음 제안 되었다 19903. 이 접근은 통제된 방식으로 혈액 두뇌 방벽 의 뒤에 큰 두뇌 양의 관류를 약속합니다2. 그러나, 지금까지, 몇몇 임상 시험은 임상 설치에 있는 CED가 기술적으로 요구하는 것으로 나타났기 때문에 부분적으로, 이 접근을 사용하여 수행되었습니다24,25. 카테터 설계 및 주입 프로그램의 최근 발전은 이러한기술적 어려움을 극복 한 것으로 보인다 8,19. 면역조절 체크포인트 차단제의 출현을 포함하는 치료항체의 임상적 구현이 진행되고 있으며, CNS장애(10)의치료에 적용을 기다리고 있다. 이러한 개발은 소형 설치류 모델을 사용하는 것과 같은 실험 설정에 CED를 사용하여 크게 증대될 수 있습니다.
다양한 CNS 질환 모델은 마우스에서 사용할 수 있습니다. 여기에는 다발성 경화증(MS)과 알츠하이머 병(AD), 파킨슨병(PD) 또는 뇌암에 대한 유전자 조작 모델이 포함된 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)이 포함됩니다. 많은 뇌종양 모형은 또한 뮤린 신경교종 세포주의 orthotopic 종양 접종 또는 환자 파생된 이종이식의 이식에 의존합니다. 이 프로토콜은 항체 솔루션을 특정 해부학 적 위치로 직접 전달하여 치료 절차를 닮을 수 있게 합니다. 그것은 정확한 두뇌 지구에 항체의 납품이 중추적인 역할을 하는 각종 실험적인 배치에서 실행될 수 있습니다.
마우스에서 CED를 수행하는 데 중요한 요소는 카테터의 가용성입니다. 이 프로토콜은 단계 카테터를 조립하고 일련의 시험관 내 실험에서 테스트하는 방법에 대한 정확한 설명을 포함합니다. 스텝 튜브가 만들어지는 융합 실리카는 부서지기 쉬운 재료이며 주어진 카테터가있는 CED의 품질은 시간이 지남에 따라 감소 할 수 있음을 명심해야합니다. 1.3 프로토콜 섹션에 기재된 시험관내 테스트를 반복하여 생체 내 실험 사이에 단계 카테터의 파라미터를 조절하는 것이 좋습니다.
프로토콜은 다른 주입 볼륨에 대 한 조정할 수 있습니다., 난홍과 뇌 영역의 종류. 사출 부피는 사출 단계의 지속 시간을 비례적으로 변경하여 조작할 수 있습니다. 여기서 우리는 5 μL의 주입을 기술하지만, 항체 용액의 10 μL을 가진 CED는 뮤린 뇌종양 모델에서 유사한 접근법을 사용하여 문헌에 보고되어, 우수한 조직 분포 및 관류 부피를 크게 초과하는 bolus 주입 7을 초과합니다7 . 더욱이, 최대 28 μL 난가체 부피가 쥐 뇌에 액체를 적용하기 위해 CED를 사용하여 보고되었다22,26. 비 단백질 성 물질은 또한 CED에 의해 주입 될 수 있습니다., fusate 좁은 카 테 터 팁의 막힘을 피하기 위해 높은 점도 안 다는 것을 명심. 리포솜을 사용하여, 주입된 분자의 전하가 조직 침투에 크게 영향을 미칠 수 있으며, 중성 또는 음전하 입자가 가장 큰 부피(22)에 걸쳐 분포될 수 있음을 입증하였다. 그림5에 도시된 바와 같이, FITC-dextran 및 항체는 다르게 분산됩니다: 항체와 FITC-dextran 이 모두 코퍼스 캘로섬을 따라 유사하게 분포하지만, 뇌 실질의 항체 침투는 FITC-dextran에 대한 것보다 더 확산되고, 이는 더 작은 반지름과 더 얼룩이 많은 분포 패턴을 보여줍니다. 이것은 다양한 물리 화학 적 특성을 가진 침심 사이의 CED 프로파일의 차이를 강조합니다.
더욱이, 도 5에 기재된 CED 실험은 건강한 마우스에 항마우스 TNFα 항체를 주입하여 수행하였고, 그래서 줄무늬에서 최소한의 표적량을 가정하였다. 동체 항원의 존재는 조직 분포 패턴을 바꿀 것이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 코퍼스 캘로섬을 따라 난간분포를 분포시킴으로써 해부학적 부위에서 불균일한 조직에 의해 더 영향을 받을 수 있다.
마지막으로, CED는 간질 유체의 흐름에 의해 영향을받는데, 이는 줄무늬 주입의 경우, 측면 심실(27)을향해 침심을 플러시 할 수 있습니다. 실제로, CED를 마친 직후에 조직이 고정되더라도, 우리는 주입된 항체가 심실 벽에 현저하게 부착되는것을 관찰할 수 있다(그림 5). 이것은 더 중뇌의 병리학 조건에 의해, 예를 들면 뇌종양의 맥락에서 영향을 받을 수 있습니다. 국소 괴사, 종종 고급 뇌 종양에서 관찰28,간질 유체의 흐름에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 난간29의분포 패턴을 변경할 수 있습니다. 건강한 중대와 비교하여 난독의 변화된 조직 분포로 이어질 수 있는 그밖 병리학적 조건은 뇌졸중 또는 외상성 뇌 손상을 포함한다30. 요약하자면, 모든 일련의 CED 실험은 표적 뇌 영역의 성공적인 관류를 보장하기 위해 신중하게 검증되어야 합니다.
현재 연구자들은 CSF 또는 뇌 (종양) 실증에 물질을 전달하기 위해 이식형 삼투성 펌프를 자주 사용하며31,32,33. 여기서 설명된 바와 같은 특정 경우에 CED는 대안으로 사용될 수 있다. 그것은 뇌 영역, 난독의 종류, 볼륨 및 마취 프로토콜에 따라 주파수로 여러 번 수행 할 수 있습니다. 간헐적 약물 전달은 난독에 대한 확장된 노출이 내성 또는 전신 부작용으로 이어질 때 특히 관련이 있을 수 있다. 높은 유지력과 반감기 난화가 전달되는 경우, 이 접근법은 펌프 이식이 필요하지 않으므로 3R 원칙에 따라 정제될 것이라고 생각할 수 있습니다. 결론적으로,이 프로토콜은 무린 줄무늬에 대량의 항체 용액을 주입하는 효율적인 방법을 설명하고 다른 뇌 영역 및 난독증 유형을 조정할 수 있습니다.
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Disclosures
요하네스 복 베르그는 취리히 대학의 특허 출원 (PCT / EP2012 / 070088)에 발명가로 언급된다. 미칼 베핑거, 린다 셸해머, 요하네스 복베르그는 취리히 대학의 특허 출원(EP19166231)에 대한 발명가로 언급된다. 저자는 추가적인 재정적 이해관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 취리히 대학의 보조금에 의해 지원되었다 (FK-15-057), 의료 생물학 연구를위한 노바티스 재단 (16C231) 스위스 암 연구 (KFS-3852-02-2016, KFS-4146-02-2017) 요하네스 보름 버그와 다리 증거 (개념의 20B1 _177300) - 린다 셸해머.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 27 G blunt end needle | Hamilton | 7762-01 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| Atipamezol | Janssen | ||
| Bone wax | Braun | 1029754 | |
| Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | ||
| Carprofen | Pfizer AG | ||
| Dental drill bits, steel, size ISO 009 | Hager & Meisinger | 1RF009 | |
| Ethanol 100% | Reuss-Chemie AG | 179-VL03K-/1 | |
| Fentanyl | Helvepharm AG | ||
| FITC-Dextran, 2000 kDa | Sigma Aldrich | FD2000S | |
| Flumazenil | Labatec Pharma AG | ||
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775-500ML | |
| High viscosity cyanoacrylate glue | Migros | ||
| Iodine solution | Mundipharma | ||
| Medetomidin | Orion Pharma AG | ||
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Midazolam | Roche Pharma AG | ||
| Ophthalmic ointment | Bausch + Lomb | Vitamin A Blache | |
| PBS | ThermoFischer Scientific | 10010023 | |
| Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647 | Jackson Immuno | ||
| Scalpels | Braun | BB518 | |
| Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm | Postnova | Z-FSS-100165 | |
| Stereotactic frame for mice | Stoelting | 51615 | |
| Stereotactic robot | Neurostar | Drill and Injection Robot | |
| Succrose | Sigma Aldrich | S0389-500G | |
| Topical tissue adhesive | Zoetis | GLUture | |
| Trypan blue | ThermoFischer Scientific | 15250061 | |
| Water | Bichsel | 1000004 |
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