Summary
MZmine으로 구현 된 진단 조각화 필터링은 알려지거나 알려지지 않은 천연 제품의 전체 클래스에 대 한 LC-MS/MS 데이터 집합을 화면에 제공 하는 우아한, 사후 획득 방식입니다. 이 도구는 분석가가 전체 화합물 클래스에 대 한 진단으로 정의 된 제품 이온 및/또는 중립 손실에 대 한 MS/MS 스펙트럼을 검색 합니다.
Abstract
천연 제품은 종종 단일 화합물 보다는 구조적으로 유사한 화합물의 혼합물로 서 생물 합성. 일반적인 구조적 특징으로 인해 동일한 클래스 내의 많은 화합물은 유사한 MS/MS 단편화를 겪고 있으며 여러 동일한 제품 이온 및/또는 중립 손실이 있습니다. 진단 조각화 필터링 (DFF)의 목적은 클래스 특정 제품 이온 및/또는 중성 손실이 포함 된 MS/MS 스펙트럼에 대 한 비 표적 LC-MS/MS 데이터 세트를 선별 하 여 복합 추출 물에서 주어진 클래스의 모든 화합물을 효율적으로 검출 하는 것입니다. 이 방법은 사중 극 자 Orbitrap 또는 사중 극 기 시간 질량과 같은 고해상도 질량 분석기에서 데이터 종속 수집을 통해 샘플 추출 물을 분석 해야 하는 오픈 소스 MZmine 플랫폼 내에 구현 된 DFF 모듈을 기반으로 합니다. 분석기. 이 접근법의 주된 한계는 분석가는 먼저 어떤 제품 이온 및/또는 중립 손실이 천연 제품의 표적 부류에 특정적이는가를 정의 해야 한다는 것입니다. DFF는 새로운 화합물을 포함 하 여 복잡 한 샘플 내에서 모든 관련 된 천연 제품의 후속 발견을 허용 합니다. 이 작업에서는 마이크로 cystins의 생산을 위해, 시아 노 박테리아를 유발 하는 저명한 유해한 조류 꽃 인 녹 농 균의 추출 물을 선별 하 여 dff의 효과를 입증 합니다.
Introduction
탠덤 질량 분 광 법 (MS/MS)은 충돌 유도 해리 (CID)1과 같은 활성화 에너지의 적용을 통해 전 구체 이온을 분리 하 고 분열을 유도 하는 것을 포함 하는 널리 사용 되는 질량 분석기 방법입니다. 이온 조각이 분자 구조와 밀접 하 게 연결 되는 방식. 천연 제품은 종종 단일 고유 화학 물질 보다는 구조적으로 유사한 화합물의 혼합물로 서 바이오 합성 된다2. 이와 같이, 동일한 생 합성 클래스의 일부인 구조적으로 관련 된 화합물은 종종 공유 제품 이온 및/또는 중성 손실을 포함 하 여 주요 MS/MS 단편화 특성을 공유 합니다. 클래스 특정 제품 이온 및/또는 중립 손실을 가진 화합물에 대 한 복잡 한 샘플을 스크린 하는 능력은 화합물의 전체 클래스를 검출 하는 강력한 전략, 잠재적으로 새로운 천연 제품의 발견으로 이어지는3, 4 , 5 , 6. 수십 년 동안 저해상도 계측기에서 수행 되는 중성 손실 스캔 및 전 구체 이온 스캐닝과 같은 질량 분석 방법은 동일한 중성 손실 또는 제품 이온을 가진 이온을 검출할 수 있습니다. 그러나, 특정 이온 또는 전이 실험을 수행 하기 전에 정의 될 필요가 있다. 고 분해능 질량 분석기가 연구 실험실에서 더 많이 사용 되 고 있는 것 처럼, 이제 복잡 한 샘플은 비 표적 데이터 종속 수집 (DDA) 방법을 사용해 일반적으로 선별 됩니다. 기존의 중성 손실 및 전 구체 이온 스캐닝과는 대조적으로, 구조적으로 관련 된 화합물은 획득 후 분석 (7)에 의해 식별 될 수 있다. 이 작업에서는 복잡 한 매트릭스 내에서 화합물의 전체 클래스를 감지 하는 스트레이트 포워드 및 사용자 친화적인 접근법 인 진단 조각화 필터링 (dff)5라고 하는 전략을 개발 했습니다. 이 DFF 모듈은 오픈 소스 MZmine 2 플랫폼에 구현 되 고 MZmine 2.38 또는 최신 버전을 다운로드 하 여 사용할 수 있습니다. DFF를 사용 하면 화합물의 전체 클래스에 대 한 진단 인 제품 이온 및/또는 중성 손실 (들)을 포함 하는 MS/MS 스펙트럼에 대 한 DDA 데이터 세트를 효율적으로 화면에 표시 할 수 있습니다. DFF의 제한은 특성 제품 이온 및/또는 화합물의 종류에 대 한 중립 손실은 분석가가 정의 해야 합니다.
예를 들어, 60 개 이상의 상이한 fumonisin 진 균 독 소는8,9 는 tricarballylic 측 쇄를 소유 하며,이는 m/z 157.0142을 생성 하 고,이를 통해 제품 이온 [M-H]- 이온4의 파편. 따라서 샘플의 모든 추정 된 fumonisins는 눈에 띄는 m/z 157.0142 제품 이온을 포함 하는 DDA 데이터 셋 내에서 모든 MS/ms 스펙트럼을 선별 하 여 dff를 사용 하 여 검출할 수 있습니다. 마찬가지로, 황산 화 화합물은 79.9574 Da (SO3)의 진단 중립 손실을 포함 하는 MS/ms 스펙트럼에 대 한 DDA 데이터 세트를 스크리닝 함으로써 검출 될 수 있다. 이러한 접근법은 또한 새로운 고리형 펩 티 드5 및 트립토판 또는 페닐알라닌 잔기6을 함유 하는 천연물을 검출 하는데 성공적으로 적용 되었다.
MZmine 플랫폼 (10) 내에서 dff의 효율성과 사용 편의성을 입증 하기 위해 마이크로 cystins (MCs) 분석에이 접근법을 적용 했습니다. 240의 클래스는 구조적으로 관련 된 독 소 민물 시아 노 박테리아에 의해 생산11,12,13.
가장 흔히 보고 되는 청색 증은 MCs로, MC-LR (류 신 [L]/아르기닌 [R])이 가장 자주 연구 되었습니다 (그림 1). MCs는 단 환 비 리보솜 헵 타 펩 티 드, 마이크로 시 티 스, Anabaena, nostoc 및 planktothrix12를포함 하는 다중 시아 노 박테리아에 의해 바이오 합성 된다. MCs는 5 개의 공통 잔기와 L-아미노산이 차지 하는 두 가지 가변 위치로 구성 됩니다. 거의 모든 MCs는 위치 511에서 특징적인 β-아미노산 3 아미노 9 메 톡 시 2, 트리메 틸, 6 dienoic 산 (다이) 잔류물을가지고 있다. MCs의 ms/ms 단편화 경로는 잘 설명 된14,15; 다이 잔여물은 ms/ms 제품 이온, m/z 135.0803+ ) 뿐만 아니라 다른 제품 이온(예: m/z 163.1114+ )에 대 한 책임 (그림 2) 비 표적화 된 DDA에 녹 농 세포 추출 물의 데이터 세트는 이러한 진단 이온을 사용 하 여 존재 하는 모든 microcystins에 대해 스크리닝 할 수 있으며, 마이크로 cystins에는 아 다 잔사가 있음을 부여 한다.
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Protocol
1. 비 표적 액체 크로마토그래피 (LC)-MS/MS 데이터 세트의 제조
참고: 분석 법의 대상 클래스에 최적화 된 모든 고 분해능 질량 분석기 및 분석 방법을 사용 하 여 DFF를 수행할 수 있습니다. Orbitrap 질량 분석기에서 MC에 최적화 된 LC-MS/MS 조건은 재료 표에나열 되어 있습니다.
-
MZmine 다운로드 2 (http://mzmine.github.io/)
참고: 예제 데이터 CPCC300는 https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0에서 찾을 수 있습니다.- 원시 데이터 메서드 드롭다운 메뉴에서 원시 데이터 가져오기 옵션을 선택 합니다.
- 분석할 데이터 파일을 선택 합니다. 단일 또는 여러 파일을 가져올 수 있습니다.
- 선택적 공급 업체 데이터 형식이 MZmine에서 지원 되지 않는 경우 Proteowizard16 을 사용 하 여 중심의 mzmine 데이터 파일을 생성 합니다.
- 벤더 제공 중심 알고리즘을 적용 하려면 피크 피킹 필터를 선택 합니다.
2. 가져온 DDA 파일의 진단 조각화 필터링
- 커서를 사용 하 여 기본 MZmine 화면의 원시 데이터 파일 열에서 데이터 파일을 선택 하 고 강조 표시 합니다.
- 시각화 드롭다운 메뉴에서 진단 조각화 필터링 옵션을 선택 합니다.
- 표시 되는 DFF 대화 상자 (그림 3)에서 다음 옵션을 입력 합니다.
- 보존 시간- 자동 범위 를 사용 하거나 대상 분석 물 클래스를 사용할 때 분 단위로 보존 시간 범위를 정의 합니다.
- 전 구체 m/z - 자동 범위 를 사용 하거나 적절 한 경우 다중 충전 화합물의 가능성을 포함 하 여 분석 물의 대상 클래스의 m/z 범위를 정의 합니다.
- m/z 허용 오차 – Msinment의 달성 가능한 MS/ms 질량 정확도를 입력 합니다. 0.01 m/z 또는 3.0 ppm은 Orbitrap 플랫폼에 적합 합니다. 진단 제품 이온만 조사할 경우에는 0.0 를 진단 중립 손실 값 (Da) 옵션에 입력 합니다. 반대로, 진단 중립 손실만 조사 되는 경우에는 진단 제품 이온 (m/z) 옵션에 0.0 을 입력 합니다.
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진단 제품 이온 (m/z) -클래스 특정 제품 이온을 입력 합니다. 여러 제품 이온을 쉼표로 구분 합니다.
참고: 여러 제품 이온을 입력 하면 나열 된 모든 제품 이온이 포함 된 스펙트럼을 시각화할 수 있습니다. -
진단 중립 손실 값 (Da) -클래스 특정 중립 손실 (es)을 입력 합니다. 여러 중립 손실을 쉼표로 구분 합니다.
참고: 여러 중립 손실을 입력 하면 나열 된 모든 중립 손실이 포함 된 스펙트럼을 시각화할 수 있습니다. 진단 제품 이온과 중성자 손실을 모두 입력 하면 모든 기준을 충족 하는 스펙트럼을 시각화 할 수 있습니다. - 최소 진단 이온 강도 (% 베이스 피크) -MS/ms 스펙트럼의 염기 피크의%로 서, 진단 제품 이온 및/또는 중립 손실에 대 한 최소 강도를 정의 합니다.
- Peaklist 출력 파일 – 결과를 출력할 경로와 파일 이름을 선택 합니다.
- 확인 ( OK) 단추를 눌러 dff 분석을 시작 합니다. 위의 단계를 성공적으로 완료 하면 DFF 플롯이 표시 됩니다.
참고: 두 개의 .csv 데이터 파일이 생성 됩니다. {Peaklist 출력 파일}. c s v 에는 검사의 전 구체 m/z, 스캔 번호 및 보존 시간이 포함 되어 있습니다. 이는 정의 된 DFF 기준을 충족 하는 전 구체의 추출 된 이온 크로마 토 그램 생성 하기 위해 원시 데이터 방법 > 피크 검출 > 표적 피크 검출 을 포함 하는 기존 mzmine 모듈에서 사용 될 수 있다. {Peaklist 출력 파일} _data .csv 에는 MZmine 외부의 dff 플롯 생성을 허용 하는 전 구체 m/z, 제품 이온 m/z 및 보존 시간이 포함 되어 있습니다.
3. microcystin 분석을 위한 DFF 사용의 예
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시료 전처리
- 멸 균 마 배지17 또는 다른 시아 노 박테리아의 30 ml를 함유 하는 250 ml의 삼각 플라스 크를 살 균 하 여 발포 체 스 토퍼가 장착 되어 있습니다.
- 무 균 조건 하에서 약 5×105 세포를 mL-1 로 하 여 시아 노 박테리아 배양 액으로 살 균 된 성장 배지를 접종 한다. 혈 세포 측정기로 셀 밀도를 모니터링 합니다. 이 예제에서는 12h 라이트를 사용 하 여 차가운 백색 형광등 (30 µ CPCC300)으로 조명 되는 녹 농 균 변형 률을 27 ° c에서 증가 시킵니다. 하루에 한 번 세포를 소용돌이 십시오.
- 26 일 후에 47 mm 직경의 GF/C 유리 마이크로 화이버 필터 페이퍼를 사용 하 여 진공 여과에 의해 배양 배지 로부터 세포를 분리 한다.
- 14ml 테스트 튜브에서 수확 한 세포에 80% 메탄올 (aq) 3 ml를 추가 합니다.
- 소용돌이 및 연속적으로 30 초 동안 각각의 시아 노 박테리아 세포를 함유 하는 시험관 (들)을 초음파 처리 한다. 테스트 튜브를 1 시간 동안-20°c에 보관 하십시오. 시험관을 실 온으로 돌려 샘플을 15 분 동안 해 동 하도록 합니다.
- 두 번 3.1.5 단계를 반복 하 여 효과적으로 세포를 분해 합니다.
- 얻어진 시아 노 박테리아 세포 추출 물 (들)을 0.22 μ m PTFE 주사기 필터 (들)로 필터링 한다.
- 건조 추출 물 (들)을 30°c의 온도에서 증발 시켜 부드러운 질소 가스 스트림을 사용 한다. LC-MS/MS 분석까지-20°c에서 건조 추출 물을 저장 한다.
- 분석 하기 전에 황색 HPLC 바이 알에서 30 초 동안 500 µ의 90% 메탄올 (aq) 와 소용돌이로 건조 잔사를 재구성 합니다.
- 고 분해능 질량 분석기에서 DDA 수집 방법을 사용 하 여 시아 노 박테리아 추출 물을 분석 한다.
참고: 여기에서 사용 되는 MC 분석을 위한 최적화 된 LC-MS 조건은 재질 표에나열 되어 있습니다. - 1.1 및 1.2 단계에 따라 DDA 데이터 파일을 준비 하 고 MZmine으로 가져옵니다.
- 데이터 파일를 선택 하 고 2.1-2.2 단계에 따라 dff 모듈을 시작 합니다.
- MC 분석의 경우 DFF 모듈 내에서 다음 설정을 사용 합니다 (그림 3).
- 보존 시간 – 2.00 의 범위를 6.00 분으로 입력 합니다.
- 전 구체 m/z – 430.00 ~ 1200.00의 입력 m/z 범위.
- m/z 공차 - 0.01 m/z 또는 3.0 ppm의 m/z 허용 오차를 적용 합니다.
- 진단 제품 이온 (m/z) – 135.0803의 입력 m/z , 163.1114 진단 제품 이온
- 진단 중립 손실 값 (Da) – 입력 0.0 는 진단 중립 손실이 사용 되지 않음을 정의 합니다.
- 최소 진단 이온 강도 (% 베이스 피크) -최소 강도 임계 값으로 15.00 사용
- Peaklist 출력 파일 – 출력 파일을 putative_MCs로 정의 합니다.
- 확인 ( OK) 단추를 눌러 dff 분석을 시작 합니다. 위의 단계를 성공적으로 완료 하면 DFF 플롯 (그림 4)이 나타납니다.
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Representative Results
M. 농 균 의 분석에 따라 생성 된 dff 플롯이 도 4에 도시 되어 있다. 이 플롯의 x축은 정의 된 dff 기준을 만족 하는 전 구체 이온의 m/z 이며 y축은 MCs ms/ms 스펙트럼 내의 모든 제품 이온의 m/z 를 표시 합니다. 이 분석을 위해 MC 검출 기준에는 440-1200의 m/z 범위 내에 전 구체 이온이 포함 되어 있으며, 보존 시간은 2.00 ~ 6.00 분입니다. 가장 중요 한 것은, 이러한 MS/MS 스펙트럼은 정의 된 15% 베이 페 악 세기 임계치 이상으로 m/z 135.0803 및 163.1114 (±3ppm)을 포함 한다. 이러한 조건 하에서, LC-MS/ms DDA 분석 동안 총 4116 MS/MS 스펙트럼을 획득 하였다. 그 중, dff 기준을 만족 하는 26 개의 스펙 트 라는 m. 농 균 추출 물에서 검출 되었다. 그러나, 다중 MS/MS 스펙트럼은 특히 고 강도 이온에 대해 동일한 화합물 상에 서 획득 될 수 있다. 이 추출 물에서 18 독특한 전 구체 m/z 만 발견 되었습니다. 가장 작은 이온 (m/z 497.2746, M+2H)은dff에 의해 검출 된 [m + H]+ 전 구체 m/z 993.5389의 이중 충전 된 보수입니다. 이전에 출판 된 연구에의 하면,이 m. 농 균 균 주 (18)에서 검출 된 주요 MCs는 자신 있게 mc lr과 [d-sub3] mc로 할당 될 수 있다. 나머지 추정 된 mcs의 질량 스펙트럼을 조사 하는 것은 두 개의 13c 동위 원소를 다른 검출 된 mcs(m/z 993.5389, 1025.5343) 및 또 다른 하나는 m/z 993.5389의 부가 물 및 MC 였다는 것을 밝혀 내었다. 12 개의 나머지 추정 MCs 중, 4 개는 알려진 MCs의 대 중에 상응 하 고, 8 개는 이전에는 보고 되지 않은 화합물 (보조 파일) 이었다. 표 S1).
그림 1: MC-LR의 화학 구조. 다이 잔기는 공지 된 MCs의 상당 부분에서 흔히 발생 하며, m/z 135.0803 및 163.1114에서 진단 산물 이온을 생산 한다. 위치 5에서 디 메 틸 다이 아 세 틸 다이 잔기를 포함 하는 다른 MC 변이체는 공지 되어 있고 동일한 제품 이온을 생성 하지 않을 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: MC-LR의 ms 스펙트럼. MS/MS 스펙트럼은 아 다 잔류물 로부터 유도 된 m/z 135.0803에서 두드러진 제품 이온을 나타내는 Orbitrap 질량 분 광 계에서 획득 됩니다. M/z 163.1114에서 추가 제품 이온은 또한 아 다 잔류물 로부터 유도 되 고 dff 분석의 선택 성을 증가 시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: MZmine 내의 DFF 대화 상자. 화합물의 표적 부류를 위한 진단 인 제품 이온 및/또는 중립 손실은 입력 됩니다. 보존 시간 및 전 구체 이온 필터를 사용 하 여 분석의 선택 성을 높일 수 있습니다. 최소 진단 이온 강도는 DFF 기준을 만족 시키기 위해 스펙트럼에 대해 달성 되어야 하는 진단 생성물 이온 및 중성 손실의 임계 강도를 지칭 한다. 이 값을 낮추면 거짓 긍정 조회가 발생할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: m. 농 균 세포 추출물의 MC 분석을 위한 dff 플롯. M. 농 균 추출 물의 dff 분석은 18 개의 고유한 M/z 값을 포함 하는 정의 된 dff 기준을 충족 하는 26 개의 스펙트럼을 발견 했습니다. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하면 사용자가 도메인 및/또는 범위 축을 "축소" 할 수 있습니다. 이중 충전 된 전 구체 이온이 m/z 497.2746에서 검출 되어 [m + H]+ 993.5389에서 알 수 없는 MC에 상응 합니다. 스트레인 CPCC300에서 생산 되는 두 개의 알려진 MCs는 [D-Asp3] MC 및 MC-lr 18입니다. 총 8 개의 추정 mcs가 공지 된 mcs의 m/z 에 상응 하지 않았고, 4 개의 mcs가 다 수의 성이의 m/z 에 상응 하 고, 3 개는 다른 mcs (보조 파일)의 동위 원소/adducts로 밝혀졌다. 표 S1). 여기에 표시 된 DFF 플롯은 DFF 모듈을 실행할 때 자동으로 만들어진 "putative_MCs_data" 에서 Excel에서 수동으로 생성 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 파일. M. 농 균 추출 물의 lc-ms/ms 분석을 위한 최적화 된 조건. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
DFF는 화합물의 전체 클래스를 검출 하기 위한 간단 하 고 빠른 전략, 특히 천연 제품 화합물 발견에 대 한 관련. DFF의 가장 중요 한 측면은 화합물의 표적 클래스에 대 한 특정 MS/MS 단편화 기준을 정의 하는 것입니다. 이 대표적인 예에서, DFF는 아 녹 농 세포 추출 물에 존재 하는 MCs를 함유 하는 모든 다 잔류 물을 검출 하기 위해 사용 되었다. 대다수의 MCs에는 다이 잔기가 포함 되어 있지만,이 위치에서 다른 잔기가 알려져 있으며, 특히 탈 메 틸 및 아 세 틸 디 메 틸-다 변이체는19이다. 이러한 잔류물이 있는 MCs는 정의 된 기준을 사용 하 여 감지 되지 않습니다. 그러나 DFF는 사후 취득 접근 방식 이므로 여기에 설명 된 간단한 단계별 프로토콜을 사용 하 여 동일한 데이터 집합에서 추가 진단 조각을 쉽게 조사할 수 있습니다. 또한 분석가는 진단 제품 이온 및/또는 중성 손실을 변경 하는 가상의 수정으로 화합물을 감지할 수 있습니다.
Adducts 및 소스 조각은 DFF 기준을 충족 하 고 고유 분석 물로 잘못 해석 될 수도 있습니다. 거짓 양성은 추출 물에 존재 하는 다른 화합물이 동일한 생성물 이온 및/또는 중성 손실을 나타낼 때 발생할 수 있다. 두 경우 모두, 추가 제품 이온 및 방법 선택 성을 증가 시키는 중성 손실을 사용 하 여이를 완화할 수 있습니다.
전 구체 이온이 분석가에 의해 정의 된 DFF 기준을 모두 충족 하 고 대상 클래스 내에서 화합물을 나타낼 수 있지만 절대적인 정체성은 여전히 추정 됩니다. Schymanski (2014)에 의해 제안 된 식별 신뢰도 수준을 사용 하 여,이 MS/MS 접근법을 사용 하 여 검출 된 MCs는 정확한 질량 및 동위 원소에 의해 할당 될 수 있는 전 구체 이온의 명료한 분자 공식을 가질 때 ' 레벨 3 ' 식별 신뢰도를 가진다 프로 파일20. 이 예제에서, 8 개의 추정 된 mcs는 다 수의 등 압 mcs11에 상응 하는 매스를 가졌다. 절대적인 정체성은 보존 시간과 MS/MS 스펙트럼을 실제 표준과 비교 하거나, 정제 후 NMR 및 기타 분 광 방법으로 확인 함으로써 달성 되었을 것 이다. 여기에서 감지 된 여덟 개의 대 수 MCs와 같이 대상 클래스의 알려진 구성원의 질량에 해당 하지 않는 추정 화합물은 새로운 천연 제품을 발견 하기 위한 실질적인 목표를 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 헤더로 시 온 (캐나다 피 코 로지컬 문화 센터, 워털루 대학교에서 공부한 시아 노 박테리아 문화를 연구 하 고, 칼 턴 대학교)에 게 기술 지원을 제공 해 주셔서 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
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