Summary
Doliolids, herunder arten Dolioletta gegenbauri, er lille gelatinøs Marine zooplankton af økologisk betydning fundet på produktive subkontinentale hylde systemer på verdensplan. Vanskeligheden ved dyrkning af disse delikate organismer begrænser deres undersøgelse. I denne undersøgelse beskriver vi dyrkningsmetoder til opsamling, opdræt og vedligeholdelse af doliolid Dolioletta gegenbauri.
Abstract
Gelatinøse zooplanktoner spiller en afgørende rolle i havets økosystemer. Men det er generelt vanskeligt at undersøge deres fysiologi, vækst, frugtbarhed og trofiske interaktioner primært på grund af metodologiske udfordringer, herunder evnen til at kultur dem. Dette gælder især for doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri forekommer almindeligvis i produktive subtropiske kontinentale hylde systemer på verdensplan, ofte i Bloom koncentrationer i stand til at forbruge en stor brøkdel af den daglige primærproduktion. I denne undersøgelse beskriver vi dyrkningsmetoder til indsamling, opdræt og vedligeholdelse af D. gegenbauri med det formål at gennemføre laboratoriebaserede undersøgelser. D. gegenbauri og andre doliolid arter kan fanges levende ved hjælp af skrå trukne koniske 202 μm mesh plankton nets fra et drifting skib. Kulturer er mest pålideligt etableret, når vandtemperaturen er under 21 °C og er startet fra umodne gonozooider, modning phorozooider, og store sygeplejersker. Kulturer kan opretholdes i afrundede kultur fartøjer på et langsomt roterende plankton hjul og opretholdes på en diæt af dyrkede alger i naturligt havvand i mange generationer. Ud over evnen til at etablere laboratorie kulturer af D. gegenbauri, viser vi, at indsamlings betingelsen, alge koncentrationen, temperaturen og eksponeringen for naturligt konditioneret havvand er alle afgørende for kulturen etablering, vækst, overlevelse og reproduktion af D. gegenbauri.
Introduction
Zooplankton tegner sig for den største animalske biomasse i havet, er nøglekomponenter i Marine fødevare spindelvæv, og spiller vigtige roller i havets biogeokemiske kredsløb1,2. Zooplankton, selv om den består af en enorm mangfoldighed af organismer, kan groft skelnes i to kategorier: gelatinøse og ikke-gelatinøse med få mellemliggende taxa3,4. Sammenlignet med den ikke-gelatinøse zooplankton er gelatinøs zooplankton særligt svær at studere på grund af deres komplekse livshistorie5, og deres sarte væv beskadiges let under opsamling og håndtering. Gelatinøse zooplankton arter er derfor notorisk vanskelige at kulturen i laboratoriet og generelt mindre undersøgt sammenlignet med ikke-gelatinøse arter6.
Blandt gelatinøse zooplankton grupper, en rigelig og af økologisk betydning i verdenshavet er Thaliaceanerne. Thaliaceans er en klasse af pelagiske sækdyr, der omfatter ordrerne Salpida, Pyrosomida og Doliolida7. Doliolida, samlet kaldet doliolids, er små tøndeformede, frisvømmede pelagiske organismer, der kan nå høje mængder i produktive neritiske regioner i subtropiske oceaner. Doliolids er blandt de mest udbredte af alle zooplankton grupperne4,8. Som ophængs fødere samler doliolids madpartikler fra vandsøjlen ved at skabe filter strømme og fange dem på Slim nets9. Taksonomisk, doliolids klassificeres i phylum Urochordata10. Forfædres til kordatoerne, og i tillæg til deres økologiske betydning som centrale komponenter i Marine pelagiske systemer, Thaliaceans er af betydning for forståelsen af oprindelsen af koloniale livshistorie10,11 og udviklingen af chordates5,7,10,12,13,14.
Doliolids ' livshistorie er kompleks og bidrager til vanskelighederne ved dyrkning og opretholdelse af dem gennem deres livscyklus. En gennemgang af doliolid livscyklus og anatomi kan findes i Godeaux et al.15. Doliolids livscyklus, som indebærer en obligatorisk vekslen mellem seksuelle og aseksuelle stadier i livsforløbet, er præsenteret i figur 1. Æg og sperm produceres af de hermafroditiske gonozooider, den eneste ensomme fase af livscyklus. Gonozooider frigive sperm til vandsøjlen og æg er internt befrugtet og frigivet til at udvikle sig til larver. Larverne klækkes og omdannes til oozooider, der kan nå 1-2 mm. at antage gunstige miljøforhold og ernæring, oozooider bliver tidlige sygeplejersker inden for 1-2 dage ved 20 °C og indlede de koloniale stadier af livscyklus. Oozooider asekuelt producere knopper på deres ventrale stolon. Disse knopper forlade udløber og migrere til dorsale cadophore, hvor de line op i tre parrede rækker. De centrale dobbelt rækker bliver phorozooider, og de yderste to dobbelte rækker bliver trofozooider. Sidstnævnte giver mad til både sygeplejersken og phorozooider16,17. Trophozooider forsyner sygeplejersken med ernæring, da hun mister alle indre organer. Som den overflod af trophozooider stiger, kan størrelsen af sygeplejersken nå 15 mm i laboratoriet. Som phorozooider vokse, de indtager i stigende grad planktonopblomstringer bytte og nå ~ 1,5 mm i størrelse forud for at blive frigivet som individer17. En enkelt sygeplejerske kan frigive > 100 phorozooider i løbet af sin levetid18. Efter at phorozooider er frigivet fra cadophore, de fortsætter med at vokse og er den anden koloniale fase af livscyklus. Når de når ~ 5 mm i størrelse, hver phorozooid udvikler en klynge af gonozooider på deres ventrale pedonkel. Disse gonozooider kan indtage partikler, når de når ~ 1 mm i længden. Efter gonozooider har nået ~ 2 til 3 mm i størrelse de er frigivet fra phorozooid og blive den eneste ensomme fase af livscyklus. Når de når ~ 6 mm i størrelse, gonozooider bliver seksuelt modne17. Gonozooider kan nå 9 mm eller større i længden. Gonozooider er hermaphroditic, sperm frigives periodisk mens befrugtning af æggene opstår internt16,17. Når gonozooid er ≥ 6 mm i størrelse, det frigiver op til 6 befrugtede æg. Vellykket dyrkning kræver at understøtte de specifikke behov i hver af disse unikke livshistorie etaper.
På grund af den økologiske og evolutionære betydning af Thaliaceans, herunder doliolids, er der behov for dyrkningsmetoderne for at fremme forståelsen af denne organismes unikke biologi, fysiologi, økologi og evolutionære historie19 . Doliolids har et betydeligt løfte som eksperimentel model organismer i udviklingsmæssige biologi og funktionel genomforskning, fordi de er gennemsigtige og sandsynligvis har strømlinet genomer20,21. Manglen på pålidelige dyrkningsmetoder hæmmer imidlertid deres anvendelighed som laboratorie modeller. Selv om en håndfuld laboratorier har offentliggjort resultater baseret på dyrkede doliolids, er vores viden dyrkningsmetoder og detaljerede protokoller ikke tidligere blevet offentliggjort. Baseret på mange års erfaring, og forsøg og fejl dyrkning forsøg, formålet med denne undersøgelse var at gennemgå erfaringer og til at dele protokoller for indsamling og dyrkning af doliolids, specielt arten Dolioletta gegenbauri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af dyrknings faciliteter til opdræt D. gegenbauri
Bemærk: alle nødvendige materialer og udstyr er opført i tabellen over materialer.
- Forbered 1 M natriumhydroxid (NaOH), 0,06 M kaliumpermanganat (KMnO4) opløsning. For at tilberede denne opløsning opløses 400 g NaOH i 10 L deioniseret vand. Tilsæt 100 g KMnO4 til NaOH-opløsningen, og bland godt.
- Forbered en 0,1 M natriumbisulfit (NaHSO3) opløsning ved at opløse 100 g nahso3 i 10 L deioniseret vand og bland godt.
Forsigtig: disse reagenser er irritationsmomenter, der kan forårsage åndedrætsbesvær ved indånding. Sted i et godt ventileret område, såsom en røg hætte. Undgå hudkontakt. Bær beskyttelseshandsker, beskyttende beklædning, Øjenværn og ansigtsbeskyttelse ved håndtering. - Før du etablerer og opdrætter doliolid-kulturer i laboratoriet, Rengør og steriliserer du kultur krukker.
- Skyl 1,9 L og 3,8 L kultur krukker mindst 3 gange med deioniseret vand. Lad skruehætter tørre, da hætter ikke er inkluderet i følgende rengøringstrin.
- Rengør og Steriliser 1,9-og 3,8 L glas kultur krukker ved at fordybe dem i NaOH/KMnO4 -opløsningen. Lad krukker til at suge natten over.
- Fjern krukker fra NaOH/KMnO4 -opløsningen, og sænk krukker i natriumbisulfit-opløsningen (NaHSO3). Lad krukker til at suge natten over.
- Fjern krukker fra NaHSO3 -opløsningen og skyl grundigt med deioniseret vand. Lad krukker tørre.
- Anbring plankton hjulet (figur 2) i et temperaturkontrolleret rum (miljøkammer). Temperaturen til 20 °C. For en mere detaljeret beskrivelse af det brugerdefinerede plankton hjul henvises til det supplerende figur 1.
2. fytoplankton kultur
- Få algekulturer fra det nationale center for havalger og microbiota (NCMA) eller andre kilder, der skal anvendes som fødevarer til D. gegenbauri. Blandinger af to flagellatarter, herunder isochrysis La (CCMP 1323), rhodomonas SP (CCMP 740), og et lille Diatom, thalassiosira weissflogii (CCMP 1051) blev indhentet fra NCMA og har været anvendt i tidligere laboratorie studier til bageste doliolids med succes17.
- Forbered L1-og L1-si-vækstmedier22 som anbefalet af NCMA.
- Følg instruktionerne fra leverandøren for at starte de nye algekulturer.
- For at opretholde bestanden kulturer, ved hjælp af strenge axeniske kultur teknikker, overføre 0,5 ml af gamle senescing kultur til 25 ml friske vækstmedier i sterile 55 ml glas kultur rør hver anden uge.
Bemærk: det er ikke muligt at opbevare levende algekulturer uden at overføre dem regelmæssigt. Hvis kulturer ikke vil blive brugt i længere perioder, og det ikke er muligt at opretholde kulturer i varigheden af den manglende brug periode, anbefales det at re-erhverve disse fælles algekulturer fra deres oprindelige kilder (f. eks, NCMA). - Forbered større mængder fytoplankton til fodring doliolids i ren 500 mL plast vævskultur kolber indeholdende 200 mL vækstmedier.
- Fytoplankton fra axeniske-bestande (4 ml) til 200 ml vækstmedier (1:50 fortynding).
- Inkuber ved 20 °C med en 12:12 h lys: mørk cyklus under kølig hvidt lys belysning på 65-85 μE/m2. Læg kultur flaskerne fladt for at maksimere belysningen. Hvirvl forsigtigt kulturen dagligt.
- Bestem koncentrationen af celler ved hjælp af en partikeltæller eller mikroskop til at overvåge væksten af kulturerne.
Bemærk: efter 7-10 dage fra inokulation, vil flagellaten kulturer indeholde ~ 105-106 celler/ml og Diatom kulturen vil indeholde ~ 104-105 celler/ml. Disse koncentrationer er nok til at opretholde doliolid kulturer. - Iværksætte nye foder lagre på mindst hver anden uge for at give tilstrækkelig algebiomasse til støtte for alle kulturaktiviteter.
3. indsamling af vilde doliolids og havvand til kultur
Bemærk: en oversigt over indsamlings-og dyrkningsmetoder er skitseret i figur 3. I figur 4findes en beskrivelse af det specialiserede indsamlings plankton net og COD-end.
- Find doliolids ved at detektere dem ved hjælp af enten plankton nets eller in situ Imaging Systems23.
Bemærk: da doliolids sjældent forekommer i overfladevand og ikke kan påvises ved telemålingsteknologi, skal tilstedeværelsen af doliolids bestemmes efter den nødvendige viden om forhold, der er gunstig for doliolids (Se diskussionen). før prøvetagning. - Saml partikel rigt havvand forud for indsamling af levende doliolids som forberedelse til at initiere en D. gegenbauri -kultur.
- Implementer niskin-flasker monteret på en CTD-Rosette eller tilsvarende udstyr til opsamling af vand fra det sted, hvor doliolids er placeret, og fra dybden, der indeholder de højeste estimater af klorofyl en koncentration anslået af in situ-fluorometri.
Bemærk: chlorophyll a -koncentration anvendes som indikator for partikelkoncentrationer. På South Atlantic Bight (SAB) Mid-Continental hylde, underlaget klorofyl et maksimum er normalt tæt på bunden, men i andre steder, det kan ikke være.
- Implementer niskin-flasker monteret på en CTD-Rosette eller tilsvarende udstyr til opsamling af vand fra det sted, hvor doliolids er placeret, og fra dybden, der indeholder de højeste estimater af klorofyl en koncentration anslået af in situ-fluorometri.
- Når doliolids er placeret, Genopret ubeskadigede doliolid zooider ved hjælp af det specialiserede plankton net og COD-end. Før du implementerer nettet, skal du fylde torske enden med havvand.
- Fra et drifting skib, sænke og hæve nettet gennem vandsøjlen opretholde en skrå bugserings vinkel på ~ 15-25 ° og vertikal indsættelse og hentning hastighed ikke større end 15 m/min.
- Når nettet er ombord, forsigtigt overføre og opdele indholdet af COD-end i 3, 5-gallon (~ 20 L) plast spande hver indeholder ~ 10 L overflade havvand indsamlet fra stedet.
Bemærk: nye plastik spande bør konditioneret ved tilsætning af havvand dage før Living doliolid kollektion. Målet er at reducere udvaskning af kemikalier fra plastik. Hvis der ikke er havvand, skal du bruge renset (f. eks. Milli Q) eller ledningsvand, der er fri for giftige kontaminanter, til at tiltage spande. - Isolerer doliolid-zooider fra andre plankton.
- I små partier (~ 2 L) overføre blandede plankton fra nettet tow indhold (nu i 20 L plast spande) til en 2 L glasbæger.
- Ved hjælp af en bred-boring glas pipette (8 mm ID x 38 cm længde), forsigtigt sifon og overføre aktivt svømning doliolid zooider fra bægerglasset til rene glas kultur krukker indeholdende partikel rigt havvand indsamlet ved hjælp af Niskin flasker fra hvor doliolids blev Beliggende.
- Slip forsigtigt doliolid-zooider under havvands overfladen.
Bemærk: Indsaml gonozooider, phorozooider indeholdende tilknyttede udvikle gonozooider, og sygeplejerske stadier indeholdende tilknyttede trophozooider (figur 1).
- Efter tilsætning af doliolids, tilsættes Rhodomonas Sp. kultur til en endelig koncentration af ~ 5 x 103 -104 celler/ml (~ 50 ml af en kultur, der indeholder ~ 5 x 104 – 1 x 105 celler/ml i en 3,8 L jar). Dette er for at afgøre, om dolioliderne aktivt fodring. Når doliolids indtage rhodomonas SP., deres fordøjelseskanalen vil blive vist rødt i farve. Fjern zooider, der ikke ser ud til at være fodring.
- For at forhindre, at doliolids bliver fanget i luft-vand-grænsefladen, skal du undgå headspace i kultur krukker ved helt at fylde krukker med ufiltreret partikel rigt havvand og placere et stykke plastik wrap over krukken åbning (89 mm bred).
- Undgå at skabe luftbobler, der også kan beskadige dyrene. Skru forsigtigt hætten fast på glasset og vend forsigtigt krukken for at afgøre, om der er bobler til stede. Hvis der er bobler til stede, fjern dem.
- Efter krukker fyldes, tørres det overskydende vand fra yder glasset.
- Monter hver krukke på plankton hjulet (figur 2) ved at placere krukken på de lodrette metalstænger, der er dækket med gummislange, og mellem en slange klemme af rustfrit stål.
- Sørg for, at bagsiden af glasset er polstret mod gummislangen. Stram slangeklemmen rundt om glasset ved at justere skruen.
- Kontroller, at glasset ikke bevæger sig, når det er forsvarligt fastgjort på plads. Lad krukker rotere ved 0,3 rpm for at holde doliolids i suspension.
Forsigtig: det er vigtigt ikke at over stramme krukken for at forhindre krukken i at knække.
- På skibet, vedligeholde kultur skibene på plankton hjulet ved 20 °C i svagt lys, indtil de kan overføres til laboratoriet kultur facilitet.
- Når du vender tilbage til laboratoriet, skal du overføre de krukker, der indeholder doliolids, til den forberedte kultur facilitet. Monter krukker på plankton hjulet (Se trin 3,8) og lad krukker fortsætte med at rotere ved 0,3 rpm.
Bemærk: al opdræt af doliolids i dette studie blev udført ved 20 °C.
4. opretholdelse af D. gegenbauri kulturer
- Fra skibet til laboratoriet, tillade dyrene at akklimatisere i de oprindelige krukker til laboratoriet betingelser for 3 dage.
- Brug en bred glas pipette til at bytte 10% af vandet med ufiltreret partikel rigt havvand fra indsamlingsstedet hver dag i 3 dage i løbet af akklikalerings perioden.
- Opbevar flere copepod'er i glasset, men Fjern alle andre zooplankton, store fækale pellets og store aggregerede partikler, der kan tilstoppe doliolids filtrerings apparat (slim-net). Hvis kulturen består af tidlige sygeplejersker, holde en stor gonozooid (≥ 6 mm) i krukken.
Bemærk: det er ikke vigtigt, hvilke copepod-arter, der indgår i kulturen, men i dette eksperiment blev de mest udbredte arter, der findes, hvorfra dolioliderne blev taget, brugt.
- Efter akklikationsperioden, Overfør doliolid zooider og copepoder fra den oprindelige krukke til en ren dyrknings krukke indeholdende 80% glasfiber filter (GF/F) filtreret havvand og 20% af havvand fra den oprindelige krukke. Forbered filtreret havvand ved at filtrere havvand gennem en GF/F med en nominel porestørrelse på 0,7 μm filterpapir.
- Opretholde den nye kultur ved at udveksle 10% af vandet med GF/F filtreret havvand hver 3 dage og ved at fjerne aggregater og fækale pellets. Ugentligt, Overfør dyr til en ny krukke som beskrevet i trin 4,2.
- Foder doliolids ved at opretholde fytoplankton koncentrationer i kultur krukker mellem 40-95 μg C/L.
Bemærk: disse koncentrationer efterligner miljøforhold, der er kendt for at understøtte Bloom betingelser for D. gegenbauri17. Blandingen af algearter varierer afhængigt af livs stadiet og antallet af zooider i hver krukke. Under tidlige stadier, tilsættes 1:1 blanding (ved kulstofindhold) af cryptomonad alger (isochrysis La og rhodomonas Sp.) kun. Større bytte arter kan nemt tilstoppe fodring apparater af små sygeplejersker og udvikle trophozooider. Tilsæt Diatom Thalassiosira weissflogii til alge blandingen, også ved lige kulstofindhold, når de fodrer større sygeplejersker, phorozooider og gonozooider.- Overvåg alge koncentrationen før og efter fodring for at vejlede om, hvor hyppigt og hvor meget alger, som skal tilsættes til kulturerne. Brug en partikeltæller til at bestemme alge koncentrationen, fordi alge koncentrationerne i kultur krukker er relativt fortyndede.
- Fjern nok zooider til at opretholde alge koncentrationen af 40 – 95 μgC/L, således at de resterende doliolids vil have nok mad til at vokse.
Bemærk: den sværeste livsfase at opretholde med succes under laboratorieforhold er den udviklende larver og oozooid (tidlig sygeplejerske). I denne fase af kulturen, holde en stor gonozooid (≥ 6 mm) ud over flere copepoder i krukken med at udvikle larver og oozooider (~ 20 per 3,8 L jar). - Overfør mindst 4 sygeplejersker til en ny dyrkning jar, når mindst 8 trophozooider er synlige på sygeplejerskens cadophore (figur 1b).
Bemærk: Trophozooider vil fordoble i antal hver 1 – 2 dage ved 20 °C. Trophozooider er store nok til at være synlige for det blotte øje.- Fjern to af sygeplejerskerne, når sygeplejerskerne udvikler 20 trophozooider.
- Fjern en sygeplejerske, når sygeplejerskerne udvikler > 30 trophozooider på deres cadophores. Lad den resterende sygeplejerske udvikle phorozooider på sin cadophore.
- Fjern sygeplejersken, når sygeplejersken frigiver op til 30 phorozooider.
- Reducer antallet af dyr i krukken, når phorozooider når 3 mm i størrelse.
- Fjern alle, men fire phorozooider, når phorozooider bliver større (> 5 mm) og har udviklet gonozooide klynger.
- Reducer kulturen til to phorozooider, når antallet af gonozooider klynger stiger i størrelse og begynder at fodre.
- Fjern phorozooider, når phorozooider frigiver op til 30 gonozooider.
- Reducer antallet af gonozooider fra 30 zooider til 2 pr. krukke. Lad befrugtede æg frigives i krukken.
- Fjern en gonozooid efterlader en enkelt gonozooid i krukken, når oozooider udvikle.
Bemærk: kasserede sygeplejersker, phorozooider, og gonozooider kan bruges til at frø yderligere kulturer og til at foretage yderligere eksperimenter.
- Fjern en gonozooid efterlader en enkelt gonozooid i krukken, når oozooider udvikle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter de beskrevne procedurer for indsamling og dyrkning af doliolid, d. gegenbauri , der er skitseret i figur 3, er det muligt at opretholde en kultur af d. gegenbauri gennem hele sin komplekse livshistorie (figur 1) og opretholde det i mange generationer. Selv om dyrkning af D. gegenbauri er beskrevet her, bør disse procedurer også være relevante for dyrkning af andre doliolid-arter.
Indfangning af raske og ubeskadigede doliolid-zooider kræver anvendelse af specialiserede net og bugserings procedurer (figur 4). Som sarte dyr uden hårde strukturer, bør der udvises forsigtighed for at minimere procedurer, der kan resultere i enhver fysisk skade. Disse faktorer kan omfatte turbulens, tryk og interaktioner med overflader, herunder net-, luft-og luftbobler. På trods af deres delikate natur kan ubeskadigede doliolid-zooider imidlertid opsamles ved hjælp af et konisk plankton net med et åbnende diameter-til-længdeforhold på 1:5 og udstyret med en relativt stor vægtet ikke-filtrerende COD-end. Rutinemæssigt har vi brugt en 202 μm mesh 2,5 m (længde) plankton net med en 0,5 m åbning monteret i en drejelig sele og udstyret med en 4 L vægtet ikke-filtrering COD-end (figur 4). Selv om effekten af plankton maskestørrelse på erobringen af de kultierbare D. gegenbauri zooider ikke er blevet systematisk undersøgt, teoretisk set, kan brugen af et net med en større maskestørrelse resultere i yderligere forbedringer, da større maskestørrelse ville Reducer det tryk felt, der genereres under bugsering. Alternativt vil større maskestørrelse resultere i større vandgennemstrømning gennem nettet, potentielt skadelige doliolid zooider. Bugserings hastigheder og netvinkel skal optimeres for at minimere slæbe tiden og beskadigelse under samlingen. Det er vores erfaring, at vi har konstateret, at der kan opnås tilstrækkeligt blide bugserings forhold ved at trække nettet skråt i en vinkel på 15-25 ° fra et drifting skib med lodrette installations-og genfindings hastigheder på ikke over 15 m/min. For at orientere nettet til retningen af vandstrømmen, er plankton net monteret i en drejelig sele. Det er normalt tilfældet, at fordelingen af doliolids i vandsøjlen ikke er tilfældig og generelt største i regionen med de højeste partikel belastninger24. Derfor skal der udtages prøver af vandsøjlen under overfladen klorofyl maksimum til overfladen. I den lavvandede SAB Mid-Continental hylde (20-45 m) udtages vandsøjlen fra ~ 1 m over bunden til overfladen.
Når raske zooider er blevet indsamlet, er det afgørende at vedligeholde dem på en måde, der minimerer udsættelse for overflader. For at minimere møder med overflader holdes doliolids i afrundede krukker fyldt med havvand og forsigtigt tumblet på et langsomt roterende plankton hjul (figur 2).
Selv om det teoretisk set er muligt at starte en kultur med zooider af enhver livsfase, udforskning af succeser og fiaskoer på at etablere nye kulturer i D. gegenbauri fra 6 forsøg mellem 2015 – 2018 i den sydlige atlantiske bugt tyder på, at succes opnås oftest, når zooider opsamles fra vand, der er < 21 °C, og når andre livsstadier end store modne gonozooider udnyttes til at starte en ny kultur (tabel 1 og tabel 2). I praksis er det nyttigt, eller i det mindste ikke skadeligt, at inkludere flere livsstadier af doliolid zooider, når der indledes en ny kultur.
Succes med at opretholde en kultur af D. gegenbauri, som det er blevet beskrevet for andre pelagiske eller arter20, afhænger af at give tilstrækkelig, men ikke overdreven, mad og fødevarediversiteten kræves for at støtte hver livsfase. Da diæt kravene varierer i hele livscyklussen, skal mængden af alger, der gives ved hver fodringsperiode, varieres for at opretholde fødevare koncentrationerne ved de ønskede målniveauer (40 – 95 μg C/L) (tabel 3). Koncentrationer over eller under disse niveauer kan resultere i øget dødelighed (G.A. Paffenhöfer pers. comm.). Selvom den naturlige kost af D. gegenbauri fortsat er dårligt forstået6, kan kulturer opretholdes ved at levere relativt simple blandinger af dyrkede alger og udnytte procedurer, der giver forskellige mikrobielle samfund til at etablere i kulturen. Øge den potentielle mangfoldighed af bytte felt opnås ved at bevare en brøkdel af partikel lastet-vand fra ældre kulturer og inddragelse af et lille antal levende copepoder og store doliolids ved hver vand ændring eller overførsel. Formodentlig, disse organismer proces alger og negativt materiale og tjene til at diversificere partikelstørrelse og kvalitet spektrum til rådighed for doliolid ernæring, men yderligere undersøgelser er nødvendige for at bekræfte denne hypotese.
Tilgængeligheden af doliolid-kulturer giver mulighed for under kontrollerede eksperimentelle forhold at undersøge mange vigtige aspekter af doliolid biologi, fysiologi, økologi og molekylær biologi. For eksempel, selv om doliolids er rigelige i mange regioner i kystnære hav og er store plankton græssere25, data om satserne for fodring og vækst stadig knappe26. Udnyttelse af kulturer af D. gegenbauri, et fokus for kultur-baserede forskning har været at kvantificere fodring og vækstrater som reaktion på kritiske miljømæssige parametre, herunder temperatur og fødevarer koncentrationer26. Resultaterne af disse undersøgelser har vist, at clearance er ens i koncentrationer fra 20 til 60 μg C/L og falder, når fødevare koncentrationerne stiger (figur 5a). Clearance satser stige proportionalt over temperaturområder støtte af D. gegenbauri vækst (figur 5b). Vækstrater (k) spænder fra 0,1-0,7/dag som funktion af temperatur og fødevaretilgængelighed (figur 6). Disse undersøgelser har ud over at give praktiske oplysninger om dyrkning gjort det muligt at bestemme de kvantitative forhold mellem doliolid-fodring og vækstrater som en funktion af miljøparametre og give kritisk indsigt i den biologi og økologi af doliolids kræves for at medtage denne vigtige zooplankton gruppe i modellering rammer27.
Figur 1: livscyklus for D. gegenbauri ved 20 °c.
Den livscyklus tegning (1A) er blevet ændret efter Walters et al. 20186 og re-tegnet med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: plankton hjul, der anvendes til kultur D. gegenbauri. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk oversigt over D. gegenbauri indsamling og dyrkning tilgang.
Indsamling til søs (A), overførsel fra koncentrerede spande til små glasbæger i små partier (B), isolering af doliolid-zooider i dyrknings krukker, der indeholder partikel rigt havvand (C), vedligeholdelse på plankton hjulet gennem hele livscyklussen (D, E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: plankton net og implementering.
Installation (øverst til venstre), hentning (øverst til højre) og skematisk af net-og COD-enden (nederst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Algal-toldsatsen for D. gegenbauri gonozooider.
A) forholdet mellem (a) middelværdien (± S.E.) clearance (ml/ZooID/dag) versus fytoplankton koncentration (μg C/L) for tre størrelser af D. gegenbauri gonozooider. Hvert punkt repræsenterer 4 – 11 observationer. (B) gennemsnitlig (± S.E.) clearance (ml/ZooID/dag) versus temperatur (°c) for tre størrelser af D. gegenbauri gonozooider. Hvert punkt repræsenterer 4 – 12 observationer. Gonozooider størrelser er 2,5 mm (
), 4,5 mm (
), og 6,5 mm (
). Tallene er blevet gentegnet med tilladelse26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: vækstrater for D. gegenbauri gonozooid.
Forholdet mellem (A) middelværdi (± S.E.) vækstrater (k) versus fytoplankton koncentration (μg C/L) for tre størrelser af Dolioletta gegenbauri gonozooider. Hvert punkt repræsenterer 4 – 11 observationer. (B) middel (± S.E.) vækstrater (k) versus temperatur (°c) for tre størrelser Dolioletta gegenbauri gonozooider. Hvert punkt repræsenterer 4 – 12 observationer. Gonozooider størrelser er 2,5 mm (), 4,5 mm (), og 6,5 mm (). Tallene er blevet gentegnet med tilladelse fra Gibson og Paffenhöfer26. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Tabel 1. Oceanografiske forhold og Doliolid overflod | |||||||||||
| Overflade | Bunden | Overflade | Bunden | Overflade | Bunden | Doliolid overflod | |||||
| Dato | Cruise ID | Breddegrad (N) | Længdegrad (W) | Dybde (m) | Temperatur (⁰ C) | Temperatur (⁰ C) | Saltholdighed (PSU) | Saltholdighed (PSU) | Chla (μg/L) | Chla (μg/L) | zooider/M3 |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | 31,1889 | 80,1527 | 41,30 | 25,26 | 22,43 | 33,58 | 36,96 | Na | 0,20 | Na |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | 29,5687 | 80,3269 | 40,00 | 26,40 | 21,75 | 36,26 | 36,32 | 1,04 | 1,35 | 218 |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | 31,1674 | 80,1249 | 40,80 | 23,24 | 22,60 | 35,91 | 35,81 | 1,06 | 1,70 | 13 |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | 31,2139 | 80,1823 | 41,00 | 18,72 | 18,84 | 36,00 | 36,12 | 0,83 | 1,50 | 3 |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | 31,2144 | 80,1822 | 42,00 | 24,19 | 23,85 | 36,00 | 36,04 | 0,63 | 1,30 | 254 |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | 31,1835 | 80,1466 | 43,00 | 16,85 | 16,45 | 36,50 | 36,48 | 0,56 | 0,89 | Na |
| NA: data er ikke tilgængelige | |||||||||||
Tabel 1: oceanografiske forhold og doliolid overflod på det sydlige Atlanterhav midt på kontinentalsoklen på det tidspunkt og sted, hvor D. gegenbauri - zooider blev indsamlet og brugt til at indlede nye kulturer.
| Tabel 2. Resultater af D. gegenbauri-Culturing forsøg | ||||
| Dato | Cruise ID | Zooider indsamlet | Resultatet | Kommentarer |
| 20/05/2015 | SAV-15-10 | Seksuelt modne store (6-7 mm) gonozooider | Mislykkedes | Alle gonozooider var døde efter 4 dage. Oozooid og tidlig sygeplejerske livsstadier blev produceret, men undlod at trives. |
| 04/08/2015 | SAV-15-19 | Seksuelt modne store (8-10 mm) gonozooider | Mislykkedes | Gonozooider døde kort efter indsamlingen. Oozooider og tidlige sygeplejersker blev produceret, men undlod at trives. |
| 02/12/2015 | SAV-15-31 | Blandet samling, herunder sen sygeplejerske (4-5 mm) med vedlagte trophozooider, seksuelt modne store (6 mm) gonozooider og oozooider (2 mm) | Vellykket | Dyrkes i 4 fulde generationer, yderligere gonozooider og sygeplejersker indsamlet i januar og marts 2016 blev føjet til kulturen. Laboratoriet blev evakueret i 4 dage under orkanen Matthew i oktober 2016 og kulturen overlevede ikke. |
| 02/02/2017 | SAV-17-03 | Blandet samling, herunder gonozooider (1,5-5 mm) og store phorozooider (6 mm) med tilknyttede gonozooide klynger | Vellykket | Dyrkes i 4 fulde generationer, yderligere gonozooider indsamlet i april 2017 blev tilføjet til kulturen. Afsluttede kultur i september 2017 forud for orkanen Irma. |
| 07/11/2017 | SAV-17-23 | Gonozooider (3-6 mm) | Mislykkedes | Stor gonozooid døde efter 1 dag. Den umodne gonozooid overlevede i kultur i 14 dage. Æg blev frigivet af begge gonozooider. Oozooider blev produceret, men undlod at udvikle sig til sygeplejerske stadier. Kulturen fejlede efter 1 måned. |
| 01/02/2018 | SAV-18-02 | Stor (6-7 mm) sen sygeplejerske uden trophozooider | Vellykket | I kulturen producerede sygeplejersken trofozooider. Kulturen blev opretholdt i 3 generationer og blev afsluttet i slutningen af juni 2018, da forsøgene blev afsluttet. |
Tabel 2: resultater af forsøg på at etablere laboratorie kulturer D. gegenbauri indsamlet fra South Atlantic Bight Mid-Continental shelf.
| Dolioletta gegenbauri | ZooID-nummer pr. | ZooID-nummer pr. | |||
| Life Stage | 3,9 L jar | 1,9 L jar | Isochryse La | Rhodomonas Sp. | Thalassiosira weissflogii |
| oozooid | 20 | 10 | Omfatter | Omfatter | MEDTAG IKKE |
| tidlig sygeplejerske | 20 | 10 | Omfatter | Omfatter | MEDTAG IKKE |
| sen sygeplejerske med 8 trophozooider | 4 | 2 | Omfatter | Omfatter | Omfatter |
| sen sygeplejerske med 20 trophozooider | 2 | 1 | Omfatter | Omfatter | Omfatter |
| sen sygeplejerske med 30 trophozooider | 1 | 1 | Omfatter | Omfatter | Omfatter |
| phorozooid (1 til 3 mm) | 30 | 15 | Omfatter | Omfatter | Omfatter |
| phorozooid gonozooid klynge (> 5 mm) | 2 | 1 | Omfatter | Omfatter | Omfatter |
| gonozooid (1 til 3 mm) | 30 | 15 | Omfatter | Omfatter | Omfatter |
| gonozooid (> 5 mm) | 2 | 1 | Omfatter | Omfatter | Omfatter |
| Målkoncentrationerne af alger bør opretholdes mellem 40-95 μg C/L med lige blandinger (ved kulstofindhold) af hver alge art | |||||
Tabel 3: målkultur betingelser for hver D. gegenbauri livscyklus fase.
Supplerende figur 1: detaljeret beskrivelse af det brugerdefinerede plankton hjul. Venligst klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kapaciteten til at kultur doliolids er blevet etableret i løbet af de sidste mange årtier og er blevet brugt til at støtte forskning på flere områder. Eksperimentelle undersøgelser i vores laboratorier har støttet offentliggørelsen af mindst 15 videnskabelige undersøgelser fokuseret på fodring og vækst18,26, reproduktion18,28, Diet6, 29, fysiologi30, økologi31, og økologisk modellering27 af doliolids.
Selv om kulturen i disse delikate dyr i øjeblikket er arbejdskraftintensiv og tidskrævende, er det muligt at dyrke doliolids, og hvis det bredere samfund gennemføres, vil det fremme forståelsen af denne økologisk og evolutionært vigtig gruppe af dyr. Formålet med denne undersøgelse var at beskrive de nuværende tilgange til indsamling, opdræt og vedligeholdelse af D. gegenbauri i kultur med det formål at gennemføre laboratoriebaserede undersøgelser.
Etableringen af en doliolidkultur kræver indsamling af sunde og ubeskadigede dyr og, når de er fanget, skånsom behandling, passende ernæring og opdræt. Doliolids, især arten D. gegenbauri, forekommer omverdenpå subtropiske kontinentale hylder, men overflod kan være meget varierende. For eksempel, i en nylig undersøgelse fokuseret på midten hylde region af SAB, selv om overflod varierede dramatisk fra < 1/m3 til > 20000/m3, doliolids var til stede i hele året6. På grund af den høje variabilitet af doliolids i tid og rum og den relative vanskelighed ved prøvetagning af kontinental hylde margin miljøer, er pålidelig viden om doliolid community dynamik, hvor undersøgelserne udføres, en vigtig forudsætning for en vellykket etablering af kulturen.
Når doliolid zooider er blevet placeret og fanget, kan det være svært at afgøre, om dyrene er blevet beskadiget. Dyr kan synes at være ubeskadigede og udviser aktiv svømning og flugt adfærd, men selv den mindste skade kan resultere i deres manglende evne til at trives. Et karakteristisk træk, der er særligt relevant for sundheds vurderingen af opfangede doliolid-zooider, er deres evne til at fodre. Fodring aktivitet kan vurderes blot ved at give pigmenterede alger til friskfangede dyr. Hvis et dyr fodrer, vil tarmen blive farvet inden for en kort tidsperiode. I vores erfaring, har vi konstateret, at tilføje en lille mængde af de røde pigmenterede alger, Rhodomonas Sp., hurtigt giver oplysninger om fodring aktivitet. Hvis fodring ikke overholdes, er det højst usandsynligt, at en kultur kan etableres.
Årvågenhed og god husdyravl er afgørende for at etablere og opretholde doliolids gennem hele deres komplekse livscyklus. Måske den mest problematiske fase er udviklingen af en levedygtig sygeplejerske fra larve scenen og produktionen (spiring) af fodring trophoozoids. På dette liv fase, vi spekulere, at fødevarebehov, med hensyn til kvantitet, kvalitet, og partikelstørrelse er mest begrænset. Til vores viden, har der ikke været nogen tidligere undersøgelser, der har undersøgt fodring aktivitet af D. gegenbauri larver og oozooider. For eksempel, selv om de udviklende gonozooider og phorozooider er i stand til at indtage partikler over en bred vifte af størrelser, kapaciteten af larver, oozooider, og små sygeplejersker er sandsynligvis mere begrænset. I praksis finder vi, at en vellykket dyrkning i disse livsstadier kan opnås ved at udelade diatomer fra alge foderblandingen ved at opretholde fødevare koncentrationer i moderat grad ved at foretage hyppige fodringer ved lavere koncentrationer ved at opretholde en enkelt større gonozooid og et par copepoder med kulturen, og ved manuelt at fjerne store aggregater af efterladenskaber.
Selv om vi har bevaret kulturer af D. gegenbauri for flere generationer, der stammer fra en enkelt samling, når det er muligt, supplerer vi rutinemæssigt eksisterende kulturer med friskindsamlede dyr for at øge den genetiske diversitet og robusthed af kulturen. En potentiel fare for denne praksis er indførelsen af parasitter eller sygdomme i kulturen, men til vores viden, har vi aldrig stødt på dette problem. Selv om der har været få rapporter om parasitter af doliolids32, utvivlsomt, de findes. Interessant, i en nylig undersøgelse sammenligne kosten af dyrkede d. gegenbauri gonozooider udsat for naturlige farvande med Mark-fanget d. gegenbauri gonozooider, formodede apicomplexa parasitter blev påvist i den vilde population, der var fraværende i de dyrkede dyr6.
En eksisterende begrænsning af den beskrevne kultur teknologi er begrænsningen af ZooID produktionsvolumen. Især fordi de beskrevne teknikker involverer dyrkning i forseglede krukker ved lave tætheder på et roterende plankton hjul, er det uklart, om denne fremgangsmåde kan opskaleres, eller at arbejdsstrømmen vil være modtagelig for automatisering. Større dyrkningssystemer, dog for en anden delikat lille gelatinøs Marine zooplankton arter, den larvacean oikopleura dioica, er blevet beskrevet20,33,34, hvilket tyder på, at det kan være muligt at designe lignende systemer til doliolids i fremtiden. Men den komplekse liv historie D. gegenbauri i forhold til den enklere livshistorie O. dioica vil fortsat være en betydelig udfordring til stor skala dyrkning.
Afslutningsvis, efter de protokoller, der er beskrevet her, D. gegenbauri kan være pålideligt dyrket under kontrollerede laboratorieforhold i hele sin komplekse livshistorie. Denne kapacitet gør arterne modtagelig for en række kontrollerede eksperimentelle undersøgelser, og måske at udvikle doliolids som en ny dyremodel i udviklingsmæssige biologi og Evolution. Begrænsninger i produktions skalaen skal imidlertid overvindes, før dette mål kan nås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige over for de mange personer, der har bidraget med akkumuleret viden til dette projekt i årenes løb, herunder G.-A. Paffenhöfer og D. Deibel, som oprindeligt udviklede disse protokoller. M. Köster og L. Lamboley har også bidraget væsentligt til udviklingen af disse procedurer. N.B. López-Figueroa og Á.E. Rodríguez-Santiago har genereret de i tabel 1 fastsatte skøn over forekomsten af doliolid. Denne undersøgelse blev delvist støttet af US National Science Foundation Awards OCE 082599, 1031263 til MEF, samarbejdsprojekter OCE 1459293 og OCE 14595010 til MEF og DMG og, den nationale oceaniske og atmosfæriske administration Award NA16SEC4810007 til DMG. Vi er taknemmelige for den hårdtarbejdende og professionelle besætning af R/V Savannah. Lee Ann DeLeo udarbejdede tallene, Charles Y. Robertson korrekturlæser manuskriptet, og James (Jimmy) Williams fremstillede plankton hjulet
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Algal culture tubes (55 mL sterile disposable glass culture tubes) | Any | NA | For algal cultures |
| Autoclave | Any | NA | For sterilizing equipment and seawater for algal cultures |
| Beakers (2 L glass) | Any | NA | For sorting diluted plankton net tow contents |
| Buckets (5 gallon, ~20L) | Any | NA | For diluting contents of planton net tow - should be seawater conditioned before first use |
| Carboys (20 L) | Any | NA | For storing seawater |
| Doliolid glass culturing jar (1.9 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01882 | Container for culture |
| Doliolid glass culturing jar (3.8 L narrow mouth glass jar with cap) | Qorpak | GLC-01858 | Container for culture |
| Environmental Chamber (Temperature controlled enviromental chamber) | Any | NA | To accommodate plankton wheel and culture maintenance |
| Filtration apparatus for 47 mm filters | Any | NA | For filtering seawater for cultures |
| Glass microfiber filters, 47 mm | Whatman | 1825-047 | For filtering seawater for cultures |
| Glass pipette (borosillicate glass pipette (glass tubing), OD 10mm, ID 8 mm, wall thickness 1mm) | Science Company | NC-10894 | Custom cut and edges polished |
| Hose clamps, stainless steel, #104 (178 mm) | Any | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel |
| Isochrysis galbana strain CCMP1323 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1323 | For feeding doliolid cultures |
| L1 Media Kit, 50 L | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | MKL150L | For culturing algae |
| Lamp (Fluorescent table lamp with an adjustable arm) | Any | NA | For illuminating doliolids in the jars and beakers |
| Lighted temperature controlled incubator | Any | NA | For algal cultures |
| Micropipettes and sterile tips (0-20 µl, 20-200 µl, 200-1000 µl) | Any | NA | For algal cultures |
| Plankton Net (202 µm 0.5 m, 5:1 length) with cod end ring and 4 L aquarium cod-end | Sea-Gear Corporation | 90-50x5-200-4A/BB | For collecting living doliolids (see Figure 4) |
| Plankton Wheel | NA | NA | Custom built (see Figure 2) |
| Plastic wrap | Any | NA | To cover inside of lid of doliolid culture jars |
| Potassium Permanganate | Fisher Scientific | P279-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Rhodomonas sp. strain CCMP740 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP740 | For feeding doliolid cultures |
| Rubber Tubing | NA | NA | For holding culturing jars to the plankton wheel (can be made from tygon tubing) |
| Sodium Bisulfite | Fisher Scientific | S654-500 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | Reagent for cleaning jars and glassware |
| Sterile serological pipettes (1 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL) | Any | NA | For algal cultures |
| Thalassiosira weissflogii strain CCMP1051 | National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA) | strain CCMP1051 | For feeding doliolid cultures |
| Tissue culture flasks (250 mL) | Any | NA | For algal cultures |
References
- Banse, K. Zooplankton – Pivotal role in the control of ocean production. Ices Journal of Marine Science. 52 (3-4), 265-277 (1995).
- Wilson, S. E., Ruhl, H. A., Smith, K. L. Zooplankton fecal pellet flux in the abyssal northeast Pacific: A 15 year time-series study. Limnology and Oceanography. 58 (3), 881-892 (2013).
- Bode, A., Álvarez-Ossorio, M. T., Miranda, A., Ruiz-Villarreal, M. Shifts between gelatinous and crustacean plankton in a coastal upwelling region. Ices Journal of Marine Science. 70 (5), 934-942 (2013).
- Kiorboe, T.
- Holland, L. Z.
- Walters, T. L., et al. Diet and trophic interactions of a circumglobally significant gelatinous marine zooplankter, Dolioletta gegenbauri (Uljanin, 1884). Molecular Ecology. , Special Issue: Species Interactions, Ecological Networks and Community Dynamics (2018).
- Piette, J., Lemaire, P. Thaliaceans, the neglected pelagic relatives of ascidians: a developmental and evolutionay enigma. Quarterly Review of Biology. 90 (2), 117-145 (2015).
- Acuña, J. L.
- Alldredge, A. L., Madin, L. P. Pelagic tunicates – unique herivores in the marine plankton. Bioscience. 32 (8), 655-663 (1982).
- Wada, H. Evolutionary history of free-swimming and sessile lifestyles in urochordates as deduced from 18S rDNA molecular phylogeny. Molecular Biology and Evolution. 15 (9), 1189-1194 (1998).
- Zeng, L. Y., Jacobs, M. W., Swalla, B. J. Coloniality has evolved once in stolidobranch ascidians. Integrative and Comparative Biology. 46 (3), 255-268 (2006).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Garstang, W. The morphology of the Tunicata, and its bearing on the phylogeny of the chordata. Quarterly Journal of Microscopical Science. 72 (285), 51-187 (1929).
- Govindarajan, A. F., Bucklin, A., Madin, L. P.
- Godeaux, D., Bone, Q., Braconnot, J. C. The Biology of Pelagic Tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 1-24 (1998).
- Deibel, D., Lowen, B. A review of the life cycles and life-history adaptations of pelagic tunicates to environmental conditions). Ices Journal of Marine Science. 69 (3), 358369 (2012).
- Paffenhöfer, G., Köster, M. From one to many: on the life cycle of Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 33 (7), 1139-1145 (2011).
- Paffenhöfer, G. A., Gibson, D. M. Determination of generation time and asexual fecundity of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 21 (6), 1183-1189 (1999).
- Conley, K. R., Lombard, F., Sutherland, K. R. Mammoth grazers on the ocean's minuteness: a review of selective feeding using mucous meshes. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 285 (1878), (2018).
- Bouquet, J. M., et al. Culture optimization for the emergent zooplanktonic model organism Oikopleura dioica. Journal of Plankton Research. 31 (4), 359370 (2009).
- Denoeud, F., et al. Plasticity of Animal Genome Architecture Unmasked by Rapid Evolution of a Pelagic Tunicate. Science. 330 (6009), 1381-1385 (2010).
- Harrison, P. J., Waters, R. E., Taylor, F. J. R. A broad-spectrum artificial seawater medium for coastal and open ocean phytoplankton. Journal of Phycology. 16 (1), 2835 (1980).
- Ohman, M. D., et al. Zooglider: An autonomous vehicle for optical and acoustic sensing of zooplankton. Limnology and Oceanography-Methods. 17 (1), 69-86 (2019).
- Takahashi, K., et al. In situ observations of a doliolid bloom in a warm water filament using a video plankton recorder: Bloom development, fate, and effect on biogeochemical cycles and planktonic food webs. Limnology and Oceanography. 60 (5), 1763-1780 (2015).
- Deibel, D. The biology of pelagic tunicates. Bone, Q. , Oxford University Press. 171-186 (1998).
- Gibson, D. M., Paffenhöfer, G. A. Feeding and growth rates of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 22 (8), 1485-1500 (2000).
- Haskell, A., Hofmann, E., Paffenhöfer, G., Verity, P. Modeling the effects of doliolids on the plankton community structure of the southeastern US continental shelf. Journal of Plankton Research. 21 (9), 1725-1752 (1999).
- Gibson, D. M., Paffenhöffer, G. A. Asexual reproduction of the doliolid, Dolioletta gegenbauri Uljanin (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 24 (7), 703-712 (2002).
- Frischer, M. E., et al. Reliability of qPCR for quantitative gut content estimation in the circumglobally abundant pelagic tunicate Dolioletta gegenbauri (Tunicata, Thaliacea). Food Webs. 1, 7 (2014).
- Köster, M., Paffenhöfer, G., Baker, C., Williams, J. Oxygen consumption of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 32 (2), 171-180 (2010).
- Paffenhöfer, G. A hypothesis on the fate of blooms of doliolids (Tunicata, Thaliacea). Journal of Plankton Research. 35 (4), 919-924 (2013).
- Takahashi, K., et al. Sapphirinid copepods as predators of doliolids: Their role in doliolid mortality and sinking flux. Limnology and Oceanography. 58 (6), 1972-1984 (2013).
- Martí-Solans, J., et al. Oikopleura dioica Culturing Made Easy: A Low-Cost Facility for an Emerging Animal Model in EvoDevo. Genesis. 53 (1), 183-193 (2015).
- Nishida, H. Development of the appendicularian Oikopleura dioica: Culture, genome, and cell lineages. Development Growth & Differentiation. 50, S239-S256 (2008).
