Summary
A causa della sovrapposizione spettrale delle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione degli analoghi NADH e fura-2, l'interferenza del segnale da entrambe le sostanze chimiche nelle cellule vive è inevitabile durante la misurazione quantitativa di [Ca2 ']. Così, è stato sviluppato un nuovo metodo di correzione online dell'interferenza del segnale NADH per misurare [Ca2 ].
Abstract
Per misurare quantitativamente [Ca2o] analoghi fura-2, che sono fluorostiche ratiometriche. Tuttavia, l'uso di tintura è intrinsecamente limitato nelle cellule vive a causa dell'interferenza dell'autofluorescenza, principalmente da nicotinamide dinucleotide (NADH). Più specificamente, questo è un ostacolo importante quando si misura il mitocondriale [Ca2]quantitativamente utilizzando fura-2 analoghi perché la maggior parte di NADH è nei mitocondri. Se la concentrazione di tinti fluorescenti è la stessa, una certa intensità di eccitazione dovrebbe produrre la stessa intensità di emissione. Pertanto, il rapporto di intensità di emissione di due diverse lunghezze d'onda di eccitazione dovrebbe essere costante. Sulla base di questo principio, è stato sviluppato un nuovo metodo di correzione online dell'interferenza del segnale NADH per misurare [Ca2]e si può ottenere la reale intensità del segnale di NADH e fura-2. Inoltre, è stata sviluppata una nuova equazione per il calcolo di [Ca2]con eccitazione o eccitazione isosbestica a 400 nm. Con questo metodo, i cambiamenti nel mitocondriale [Ca2]potrebbero essere misurati con successo. Inoltre, con un diverso insieme di lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, è possibile misurare simultaneamente più parametri, tra cui NADH, [Ca2]e pH o potenziale di membrana mitocondriale(m). I mitocondriali [Ca2]e/m o pH sono stati misurati utilizzando fura-2-FF e tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) o carboxy-seminaphtorhodafluor-1 (carboxy-SNARF-1).
Introduction
Il ruolo significativo di Ca2 intracellulare è ampiamente noto1. La quantificazione di [Ca2]è essenziale per comprendere i processi delle funzioni fisiologiche cellulari. Gli analoghi Fura-2 sono molto utili perché sono entusiasti nella gamma UV (<400 nm) e il metodo ratiometrico può essere applicato per la misurazione quantitativa. Pertanto, altri parametri fisiologici come il pH, il potenziale della membrana, ecc., possono essere misurati con altri coloranti fluorescenti. L'intervallo mitocondriale di Concentrazione di Ca2 o m ([Ca2]]è stato riferito che 0,08,20 M2,3,4,5. Tra gli analoghi fura-2, il fura-2-FF è adatto per misurare questa gamma di [Ca2s]. Tuttavia, le cellule vive contengono purtroppo NADH/NADPH per i loro processi metabolici, e NADH genera interferenze di segnale a causa della sovrapposizione degli spettri di eccitazione ed emissione con l'analogico fura-2. Questa interferenza limita notevolmente l'uso di analoghi fura-2. In particolare, se l'analogico viene applicato per misurare il mitocondriale [Ca2s], questa interferenza è l'ostacolo più grande perché la quantità più alta di NADH è nei mitocondri. Ciò è ulteriormente complicato dal fatto che i cambiamenti NADH sono correlati al potenziale della membrana mitocondriale(m) e al cambiamento dim colpisce [Ca2 ]m6,7,8 , 9.Inoltre, per studiare le dinamiche di [Ca2]m, è essenziale conoscere lo stato di altri parametri mitocondriali, come NADH,me pH.
Le emissioni a 450 nm e 500 nm con eccitazioni a 353 nm, 361 nm e 400 nm contengono i segnali da NADH e fura-2-FF e le equazioni sono le seguenti. Qui, 353 nm e 361 nm sono i punti isosbestici di fura-2-FF per le emissioni a 450 nm e a 500 nm, rispettivamente.
Equazione F361,450 - F361.450,NADH - F361.450,Fura 1
Equazione F353.500 x F353.500,NADH , F353.500,Fura
F400.500 - F400.500,NADH - F400.500,Fura Equazione 3
dove Fx,y è l'intensità di emissione misurata a y-nm per eccitazione x-nm, Fx,y,NADH rappresenta l'intensità di emissione pura dipendente da NADH e Fx,y,Fura rappresenta l'intensità di emissione pura dipendente da fura-2-FF. Sotto la stessa concentrazione del tinrito fluorescente, una certa intensità di eccitazione dovrebbe produrre la stessa intensità di emissione. Pertanto, il rapporto di intensità di emissione di due diverse lunghezze d'onda di eccitazione dovrebbe essere costante. La frequenza Ca2 e fura-2 non hanno influenzato le caratteristiche della fluorescenza NADH; pertanto, il rapporto tra le emissioni a 450 nm e a 500 nm di NADH era costante a qualsiasi lunghezza d'onda di eccitazione. La stessa regola può essere utilizzata per fura-2-FF sulla base del presupposto che NADH o [Ca2 )non influenzino gli spettri di emissione ed eccitazione di fura-2-FF. Tuttavia, Ca2o causò uno spostamento spettrale dell'emissione di fura-2-FF. Pertanto, per rimuovere l'effetto dell'eccitazione isoscanica ca2,che è indipendente da Ca2, deve essere utilizzata. Ogni lunghezza d'onda di emissione (vale a dire 450 nm e 500 nm) ha un punto isosbestico diverso e, dalla nostra configurazione sperimentale, 353 nm a 500 nm e 361 nm a 450 nm sono stati scelti. Da queste, le seguenti equazioni sono valide10.
Rf - F361.450,Fura/F353.500,Fura Equazione 4
RN1 - F400.500,NADH/F361,450,NADH Equazione 5
RN2 - F353.500,NADH/F361,450,NADH Equazione 6
Con queste costanti, le equazioni seguenti da (Equazione 1) (Equazione 2) e (Equazione 3) sono valide.
F361,450 - F361,450,NADH , Rf 353.500,Equazione Fura 7
F353,450 , RN2 , F361,450,NADH , F353.500,Equazione Fura 8
F400.500 , RN1 , F361,450,NADH , F400,500,Equazione 9
Da queste equazioni, se Rf, RN1e RN2 sono noti, i segnali puri di NADH e fura-2 possono essere ottenuti come segue.
Equazione 10 (F361,450) -(F 361,450 )
F353.500,Fura : (RN2 , F361,450 F353.500)/(Rf - RN2 - 1) Equazione 11
F400.500,Fura : F400.500 , RN1 , F361,450,NADH Equazione 12
RFura - F353.500,Fura/F400,500,Equazione Fura 13
La forma di fura-2-FF legata a Ca2oera praticamente non fluorescente alla lunghezza d'onda dell'eccitazione di 400 nm. In base a questa proprietà, è possibile derivare la nuova equazione di calibrazione seguente.
Equazione [Ca2,] : Kd . (F400.500,max/F353.500,max) - (RFura - Rmin) 14
dove Kd è una costante di dissociazione, F400.500,max e F353.500,max sono i valori massimi dei segnali emessi a 500 nm con eccitazioni rispettivamente a 400 nm e 353 nm e Rmin è il valore minimo RFura in Ca2 -condizione -free. Poiché sono state utilizzate le eccitazioni isosoriche, l'equazione può essere ulteriormente semplificata come segue.
Equazione15(1 / Rmin)
Pertanto, solo I valori Kd e Rmin sono necessari per calcolare [Ca2 '].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali.
1. Preparazione della soluzione
- Preparare un singolo miocito cardiaco appena isolato11.
NOTA: ogni laboratorio potrebbe avere una soluzione di memorizzazione cellulare diversa. Qui, i miociti sono memorizzati in mezzo di coltura (DMEM). - Preparare 100 mL di soluzione gratuita di Ca2o(tabella 1).
- Preparare 50 mL di mezzo di coltura in un becher 50 mL. Aliquota 5 mL e metterlo in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi. Mantenere la soluzione rimanente a temperatura ambiente.
- Preparare 50 mL della soluzione di saponina aggiungendo 5 mg di saponina a 50 mL di ca2 opiù soluzione gratuita.
NOTA: La saponina viene utilizzata per permeabilizzare i miociti cardiaci, per rimuovere i compartimenti citosolici e per visualizzare solo la fluorescenza mitocondriale. - Preparare 16 luna di 1 mM fura-2-FF-AM sciolti nel solfuro dimetilo (DMSO).
NOTA: Creare una soluzione di riserva di 1 mM di fura-2-FF-AM disciolta in DMSO aliquota e 16 -L in un tubo da 2 mL. Conservarli a -20 gradi centigradi fino all'uso. - Preparare 50 mL di soluzione senza NADH Ca2o- gratis (Tabella 1) e 50 mL di soluzione satura di NADH -2oquandoi punti isosbestici devono essere misurati. Regolare pH a 7.0 con KOH.
NOTA: la soluzione senza NADH Ca2o-free (Tabella 1) contiene 10 FCCP e 100 ADP senza substrati mitocondriali per ridurre al minimo l'NADH nei mitocondri. - Preparare 50 mL di soluzione gratuita per Ca2o,50 mL di soluzione malate, 50 mL di soluzione pyruvate, 50 mL di soluzione malate-pyruvate e 50 mL di soluzione rotenone da utilizzare per le misurazioni del fattore di correzione NADH (Tabella 1).
2. Procedura di caricamento Fluoroprobe nei mitocondri
- Preparare la soluzione di caricamento dei coloranti aggiungendo da 2 mL del mezzo di coltura a 16 -L di 1 mM fura-2-FF-AM.
NOTA: Il colore fluorescente è fragile sotto la luce. Preparare la soluzione appena prima dell'uso. Mantenere la soluzione contenente il coloranti fluorescente in un luogo buio. La concentrazione finale di fura-2-FF-AM è di 8 M. Se è stato utilizzato carboxy-SNARF-1, preparare la soluzione di carico dei coloranti con 2 carboxy-SNARF-1-AM. - Prendere 2 mL delle celle isolate e mettere in una provetta da 5 mL in posizione eretta.
- Attendere 15 min per i miociti affondare sul fondo e rimuovere il supernatante.
NOTA: il super-natopuò contenere detriti cellulari. Non centrifugare il tubo per evitare danni alle cellule. - Aggiungere 2 mL della soluzione di caricamento dei coloranti.
- Incubare la soluzione di carico dei coloranti con cellule per 60 min a 4 gradi centigradi.
- Quindi, mettere la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 30 min in posizione verticale.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 4 mL del mezzo di coltura preriscaldato di 37 gradi centigradi. Incubare le cellule per 60 min in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
- Infine, rimuovere il supernatante, aggiungere 4 mL di mezzo di coltura a temperatura ambiente e mantenere il tubo a temperatura ambiente.
3. Introduzione del sistema di misurazione multiparametrico
NOTA: la figura 1 mostra un diagramma dell'intero sistema.
- Per una sorgente di luce di eccitazione, utilizzare un monocromatore veloce (policromo II) che può cambiare la luce entro 3 ms.
- Utilizzare una lente ad immersione ad olio (40x, NA 1.3) con un microscopio invertito per aumentare l'intensità del segnale.
- Utilizzare un filtro vicino all'infrarosso e una telecamera a dispositivo accoppiato con carica (CCD) per monitorare il campo dell'oggetto senza interferenze del segnale fluorescente.
- Acquisire l'immagine del campo oggetto per ottenere l'area.
- Regolare il campo oggetto sullo schermo del monitor con un diaframma del campo solo per mostrare la cella per ridurre lo sfondo.
- Utilizzare quattro tubi fotomoltiplicatori con ogni filtro passa-banda (450, 500, 590 e 640 nm) per rilevare le lunghezze d'onda di emissione con il metodo di conteggio dei fotoni. Utilizzare gli specchi dicrotice appropriati per dividere e reindirizzare la luce di emissione.
NOTA: La luce di eccitazione è molto forte rispetto alla luce di emissione. Quindi, scegliere il filtro passa-banda con le più alte caratteristiche di blocco per ridurre lo sfondo. Un sistema di conteggio dei fotoni comprende una combinazione di PMT, unità contatore fotoni e un contatore ad alta velocità. Per controllare il sistema e campionare i dati, è stato utilizzato un software di guida su misura. È necessario trovare un modo per applicare questo metodo con altri sistemi.
4. Metodi di correzione NADH con un sistema di misurazione multiparametrico
- Identificazione dei punti isosorici di Fura-2-FF in situ.
NOTA: Molti rapporti hanno dichiarato che le caratteristiche fluorescenti vengono modificate nelle cellule. Pertanto, eseguire tutte le procedure per ottenere i parametri per correggere l'interferenza in situ.- Montare la cella carica di coloranti al microscopio e attendere 3 min per affondare le cellule sul fondo.
NOTA: regola i numeri di cella per vedere circa una cella per un campo obiettivo con obiettivo 40x. - Perfuso la soluzione senza NADH Ca2o-freea 37 gradi centigradi.
- Dopo la cella di destinazione, misurare lo sfondo senza cella e l'area della cella, come illustrato nella sezione 4.1. Calcolare lo sfondo della cella dall'area della cella.
NOTA: entrambi i segnali di fondo devono essere corretti in ogni esperimento. - Confondere la soluzione di saponina per 60 s e tornare alla soluzione senza NADH Ca2 ofree.
- Misurare i segnali Emessi Fura-2-FF a 450 nm e 500 nm contemporaneamente mediante l'analisi di eccitazione da 350 nm a 365 nm con il passaggio 0.1 nm.
- Perfondere la soluzione satura di NADH Ca2e ripetere il passaggio 4.2.5.
- Sottrarre i segnali nella soluzione Saturata Ca2dai segnali nelle condizioni libere di Ca2.
- Ripetere le procedure da 4.2.2 a 4.2.7 con altri singoli miociti cardiaci.
NOTA: Se l'intensità del segnale si indebolisce, ripetere da 4.2.1. Ripetere la procedura per almeno 5 celle diverse. - Da tutti i segnali ottenuti, calcolare le deviazioni standard dell'emissione ad ogni eccitazione e scegliere la lunghezza d'onda di eccitazione mostrando il valore minimo di deviazione standard (SD) come punto isosbestico.
NOTA: le cifre rappresentative sono riportate nella Figura 2.
- Montare la cella carica di coloranti al microscopio e attendere 3 min per affondare le cellule sul fondo.
- Il rilevamento del segnale di fondo e i metodi di correzione con l'area della cella
NOTA: Ci sono due tipi di sfondi. Uno proviene dalle celle e l'altro proviene dalla riflessione sullo slittamento di copertina (lo sfondo senza cellule). Entrambi gli sfondi devono essere corretti in ogni esperimento.- Montare le cellule prive di coloranti nel bagno al microscopio e attendere 3 min per affondare le cellule sul fondo. Soluzione gratuitaPerfuseNADH per circa 5 min.
NOTA: La velocità di perfusione di tutte le soluzioni è di 2-3 mL/min a 37 gradi centigradi.
NOTA: regola i numeri di cella per vedere circa una cella per un campo obiettivo con obiettivo 40x. - Impostare il campo dell'oggetto in modo che copra la cella di destinazione.
- Dopo aver spostato la cella all'esterno del campo, misurare i segnali di sfondo della finestra libera dalle celle e impostarli come offset.
NOTA: Il segnale indica il segnale luminoso da rilevare nel sistema di conteggio dei fotoni. - Riportare la cella alla posizione iniziale e misurare i segnali di sfondo della cella e l'area della cella.
NOTA: Anche se la luce di eccitazione viene filtrata con il filtro passabanda, contiene ancora una grande quantità di luce filtrata. Questa luce viene dispersa quando colpisce le cellule e provoca un notevole segnale di fondo perché il sistema di conteggio dei fotoni è altamente sensibile. Deve essere corretto.
NOTA: l'area della cella può essere calcolata con un'immagine della cella acquisita e un software di imaging disponibile. L'unità dell'area della cella può essere qualsiasi unità, incluso il numero di pixel. È necessaria solo la standardizzazione. - Ripetere da 4.1.1 a 4.1.4 per 10 volte per ottenere la relazione tra l'area della cella e i segnali di sfondo della cella.
NOTA: In seguito, i segnali di sfondo della cella possono essere calcolati dall'area della cella dalla relazione. Poiché la lampadina di eccitazione diventa invecchiamento, questa procedura deve essere ripetuta, almeno, ogni mese.
- Montare le cellule prive di coloranti nel bagno al microscopio e attendere 3 min per affondare le cellule sul fondo. Soluzione gratuitaPerfuseNADH per circa 5 min.
- Misurazione dei fattori R
- Calcolare Rf con l'equazione 4 dai segnali ottenuti nella sezione 4.2.
- Montare le cellule prive di coloranti al microscopio e perfondere la soluzione senza coloranti Ca2.
- Misurare i segnali quali F361, 450, NADH, F400, 500, NADH, F361, 450, NADHe F353, 500, NADH.
- Perfuso la soluzione malate e ripetere 4.3.3. e misurare i segnali.
- Confondere la soluzione pyruvate e ripetere 4.3.3. e misurare i segnali.
- Perfondere la soluzione malata-pyruvate e ripetere 4.3.3. e misurare i segnali.
- Perfuse la soluzione rotenone e ripeti 4.3.3. e misurare i segnali.
NOTA: l'esempio del segnale NADH registrato su piravate da 5 mM, 5 mM malate più 5 mM pirevate e 10 aggiunta di rotenone m è mostrato nella Figura 3. - Calcolare ogni pendenza di F361, 450, NADH vs F400, 500, NADH e F361, 450, NADH vs F353, 500, NADH. Come illustrato nella Figura 3. Ogni pendenza indica RN1 e RN2.
5. Selezione dell'eccitazione e della luce di emissione per TMRE o carboxy-SNARF-1
- Se è stato utilizzato anche TMRE per misurare il potenziale mitocondriale, utilizzare la lunghezza d'onda di eccitazione di 530 nm e la lunghezza d'onda di emissione di 590 nm.
- Se è stato utilizzato in aggiunta carboxy-SNARF-1 per misurare il potenziale mitocondriale, utilizzare la lunghezza d'onda di eccitazione di 540 nm e lunghezze d'onda di emissione di 590 nm e 640 nm12.
6. Selezione del valore Kd di fura-2-FF
- La modifica del pH può influire sui valori Kd per l'associazione Ca2 su fura-2-FF10. Utilizzare il valore Kd di 5,28 a pH 7,5 per i mitocondri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modifiche mitocondriali Ca2 a causa della correzione10
Figura 4 Mostra le modifiche in [Ca2 ]m prima e dopo la correzione. I risultati hanno mostrato chiaramente i cambiamenti sostanziali in [Ca2 ']m. La concentrazione di calcio a riposo mitocondriale senzacitosolica Ca2 , c , era di 1,03 x 0,13 M (vale la media (vale a dire S.E., n - 32), e il massimo [Ca2]m a 1-M [Ca2]c era 29,6 x 1,61 m ( (Figura5)(
Misurazione simultanea di NADH, [Ca 2]e
Un TMRE caricato positivamente può essere distribuito in modo potenziale dipendente dalla membrana. Il potenziale della membrana può essere calcolato utilizzando l'equazione del Nernst con la concentrazione in ogni compartimento. Il TMRA mitocondriale è stato monitorato con la perfusione di 2-nM TMRE. Si presumeva chel'indice iniziale fosse di 150 mV, e la variazione dim è stata calcolata in base a tale. L'applicazione di Ca2 è diminuita di NADH, ma hacolpito, trascurando solo i tasti(Figura 6).
Il pH mitocondriale cambia in base alla variazione di [Ca2]m10
Il pH mitocondriale con il carico aggiuntivo di carboxy-SNARF-1 è stato monitorato in seguito alle modifiche di Ca2 (Figura 7). Il pH mitocondriale non è stato influenzato dall'aumento di [Ca2 ]m. Il pH mitocondriale a riposo era di 7,504 x 0,047 (media : S.E., n - 13). Da questi risultati, il valore K d scelto di fura-2-FF a pH 7,5 è stato il valore Kd prescelto di fura-2-FF.
Figura 1: Un sistema di microfluometria per la misurazione multiparametrica
È stato mostrato il diagramma schematico del sistema di microfluometria. Le celle montate sono state visualizzate tramite una telecamera CCD. Sono state rilevate quattro diverse luci di emissione con quattro PMT tramite un sistema di conteggio dei fotoni. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso da The Korean Journal of Physiology & Pharmacology10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Identificazione dei punti isosbestici
(A) La freccia rossa indica il punto isosorico alla lunghezza d'onda di emissione di 450 nm. Fura-2 FF nello stato non associato viene visualizzato con una linea tratteggiata e nello stato rilegato Ca2 con una linea continua. (B) La freccia rossa è puntata sul punto isosortico alla lunghezza d'onda di emissione di 500 nm. (C) Vengono mostrati i dati sottratti del segnale a450 nm in condizioni di (D) Vengono mostrati i dati sottratti del segnale a500 nm in condizioni di (E) Vengono visualizzati i dati di deviazione standard dal grafico C. (F) Vengono visualizzati i dati di deviazione standard dal grafico D. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso da The Korean Journal of Physiology & Pharmacology10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazione dei fattori RN.
(A) Le modifiche del segnale NADH senza tinture fluorescenti mediante l'applicazione di vari substrati mitocondriali sono state misurate a 361 nm di eccitazione e 450 nm lunghezze d'onda di emissione. (B) L'interferenza NADH nei segnali fura-2-FF, F400.500 (z) e F353.500 (z), è stata monitorata contemporaneamente. (C) Vengono mostrate le relazioni tra F361,450,NADH e F400.500,NADH (- ) e tra F361,450,NADH e F353.500,NADH (n) Le pendenze ottenute sono rappresentate rispettivamente come RN1 e RN2. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso da The Korean Journal of Physiology & Pharmacology10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati della correzione delle interferenze NADH e fura-2-FF
Il cambiamento dei segnali da prima della correzione (mostrato nei pannelli di sinistra) a dopo la correzione (mostrato nei pannelli di destra). (A) NADH segnala alla lunghezza d'onda di emissione di 450 nm. (B) Segnali Fura-2-FF alla lunghezza d'onda di emissione di 500 nm. La cifra mostra F400.500 ('), F353.500 (----) e il rapporto tra fura-2-FF ('). (C) La concentrazione di calcio mitocondriale. La linea tratteggiata rossa indica lo zero. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso da The Korean Journal of Physiology & Pharmacology10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: A riposo [Ca2 ]m senza citosolica Ca2 e massimo stato stabile [Ca2 ']m a 1 M citosolico Ca2
I mitocondri sono stati eccitati con la perfusione della soluzione malata-pyruvate. Sono stati mostrati lo stato stazionario [Ca2o] m in condizioni di libertà di Ca2e in condizioni di 1 M Ca2. L'aggiunta di 5 mM Diz recupresse NADH e ridusse [Ca2o]m alla linea di base. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso da The Korean Journal of Physiology & Pharmacology10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Misurazione simultanea di NADH, [Ca2]me
I mitocondri sono stati eccitati con la perfusione della soluzione malata-pyruvate. Sono state mostrate le modifiche del NAHD, [Ca2']m e.m. L'aggiunta di 1 M Ca2 o m è diminuita e aumentato [Ca 2]m, manon è stato modificato in modo significativo. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso da The Korean Journal of Physiology & Pharmacology10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Misurazione simultanea di NADH, [Ca2]me pH
L'applicazione ripetuta di Ca2 o potrebbe indurre la diminuzione di NADH e l'aumento di [Ca2 )m, ma il pH mitocondriale non è stato influenzato dall'applicazione di Ca2. L'aggiunta di Naz potrebbe riportare il NADH e [Ca2 ]m alla linea di base. Questa cifra è stata riprodotta con il permesso da The Korean Journal of Physiology & Pharmacology10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome delle soluzioni | Concentrazione (mM) | |||||||||
| Kcl | HEPES | EGTA | CaCl2 | m | abbreviazione di "pence" o "penny" | R | FCCP | Adp | Saponina | |
| Ca2'-free | 150 | 10 | 1 | |||||||
| NADH-free | 150 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2'-free | ||||||||||
| NADH-free | 135 | 10 | 1 | 0.01 | 0.1 | |||||
| Ca2o-Saturto | ||||||||||
| Saponina | 150 | 10 | 1 | 0,1mg/ml | ||||||
| Malato | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Piruvato | 145 | 10 | 1 | 5 | ||||||
| Malatto-pyruvate | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | |||||
| Rotenone | 140 | 10 | 1 | 5 | 5 | 0.01 | ||||
| Cultura Medium | Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | |||||||||
| Caricamento della tinriera | Aggiungere un titolo Fura-2-FF-AM da 1 mM (16 mL) nel mezzo di coltura (2 mL) | |||||||||
Tabella 1: Soluzioni
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il metodo di correzione delle interferenze è stato sviluppato con successo per misurare i segnali degli analoghi NADH e fura-2. La misurazione esatta dei segnali è essenziale per la correzione esatta. Tuttavia, la natura intrinseca del dispositivo fluorescente produce un segnale di fondo non correlato a quello di NADH di fura-2. Il filtro a bande-passa-banda di altissima qualità può passare solo fino a 10euro delle lunghezze d'onda indesiderate della luce. Tuttavia, il segnale fluorescente da una singola cella è molto piccolo e il riflesso della luce di eccitazione dopo il filtro passa-banda è ancora abbastanza forte da contaminare i segnali fluorescenti effettivi. Pertanto, è necessaria un'attenta correzione del segnale di fondo.
Fura-2 ha un problema di carico per misurare il mitocondriale Ca2 . In primo luogo, non è facile caricare il tinrito specificamente nei mitocondri, e il caricamento non specifico in un altro organello potrebbe essere errato. La concentrazione mitocondriale di Ca2 è generalmente superiore a quella del citosol, e l'uso di fura-2-FF con un alto valore Kd potrebbe evitare la contaminazione dei cambiamenti citosolici Ca2. L'altro organello problematico è il reticolo sarccopamico (SR). Tuttavia, le differenze di volume di distribuzione (SR 3,5% vs mitocondri 34%-36% nei miociti ventricolari del ratto)13,14 e la rimozione dell'ATP negli esperimenti potrebbero compensare la contaminazione da SR.
La nostra equazione di calibrazione (Equazione 14 e 15) ha molte caratteristiche vantaggiose rispetto all'equazione15 di Grynkiewicz come segue:
1) Richiede solo tre parametri: Kd, F400,500,max/F353,500,maxe Rmin.
2) C'è linearità del valore del rapporto con la concentrazione di Ca2 a un pH costante.
3) C'è un parametro relativo senza errori in F400,500,max/F353.500,max rispetto a Sf2/Sb215.
4) Nell'equazione 15, solo Kd e Rmin sono necessari se viene utilizzata l'eccitazione isosbestica.
5) La procedura di calibrazione per ottenere il parametro è molto più semplice con l'equazione 15.
Tuttavia, c'è una limitazione perché il fura-2-FF saturo di Ca2genera un'emissione molto ridotta. Causa un errore. La nuova equazione può essere applicata a [Ca2]concentrazioni fino a 50x quella di Kd.
In conclusione, è stato sviluppato un protocollo per risolvere con successo il problema esistente di NADH e interferenza fura-2-FF. Questo metodo è in grado di misurare le dinamiche Ca2 o più con maggiore precisione. Il sistema di misurazione multiparametrico, in particolare nei mitocondri, aiuterà a comprendere la fisiologia mitocondriale in modo quantitativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione (2018R1A6A3A01011832), dal Ministero della Scienza, ICT & Future Planning (NRF-2016M3C1A6936606) e dal Ministero del Commercio, dell'Industria e dell'Energia (10068076).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL eppendorf tube | Axygen | MCT-200-C | 2 mL Tube |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | Equipment |
| ADP, Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma-aldrich | A5285 | Chemicals |
| Band pass filter | Ealing Electro-Optics, Inc | 35-3920 | Equipment, 640±11nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 690-9823 | Equipment, 590±15nm |
| Band pass filter | Omega Optical | 500DF20-9916 | Equipment, 500±20nm |
| Band pass filter | Chroma Technology Corp. | 60685 | Equipment, 450±30nm |
| Calcium chloride solution | Sigma-aldrich | 21114 | Chemicals |
| carboxy-SNARF-1(AM) | Invitrogen | C1272 | Chemicals |
| Charge-coupled device (CCD) camera | Philips | FTM1800NH/HGI | Equipment |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 86009 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <400nm, 490±10, 560±10, Transmission : 460±15, 510±20, >580nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 567DCXRU | Equipment, Reflection : <560nm, Transmission : > 580 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 480dclp | Equipment, Reflection : <470nm, Transmission : > 490 nm |
| Dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | 20728 | Equipment, Multiband dichroic mirror, Reflection : <405nm, 470±30, Transmission : 430nm~520nm, > 640 nm |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma-aldrich | 154938 | Chemicals |
| DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Sigma-aldrich | D5030 | Chemicals |
| EGTA, Egtazic acid, Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid, Glycol ether diamine tetraacetic acid | Sigma-aldrich | E4378 | Chemicals |
| FCCP, Mesoxalonitrile 4-trifluoromethoxyphenylhydrazone | Sigma-aldrich | 21857 | Chemicals |
| field diaphragm | Nikon | 86506 | Equipment |
| Fura-2-FF(AM) | TEFLABS | 137 | chemicals |
| Green tube | DWM | test tube | |
| HEPES, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma-aldrich | H3375 | Chemicals |
| High-speed counter | National Instruments | NI-6022 | Equipment |
| Hot mirror | Chroma Technology Corp. | 21002 | Equipment, 50:50 |
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | Equipment |
| Malate | Sigma-aldrich | 27606 | Chemicals |
| Near infrared filter | Chroma Technology Corp. | D750/100X | Equipment, 750±100nm |
| Oil immersion lens | Nikon | MRF01400 | 40x, NA 1.3; Equipment |
| Photon counter unit | Hamamatsu | C3866 | Equipment |
| Photon multiplier tube | Hamamatsu | R2949 | Equipment |
| Polychrome II | Till Photonics | SA3/MG04 | Equipment |
| Potassium chloride | Merck | 1.04936 | Chemicals |
| Potassium hydroxide solution | Sigma-aldrich | P4494 | Chemicals |
| Pyruvate | Sigma-aldrich | 107360 | Chemicals |
| Rotenone | Sigma-aldrich | R8875 | Chemicals |
| Saponin | Sigma-aldrich | S4521 | Chemicals |
| TMRE, Tetramethylrhodamine, ethyl ester | Molecular probes | T669 | Chemicals |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Miyata, H., et al. Measurement of mitochondrial free Ca2+ concentration in living single rat cardiac myocytes. American Journal of Physiology. 261 (4 Pt 2), H1123-H1134 (1991).
- Allen, S. P., Stone, D., McCormack, J. G. The loading of fura-2 into mitochondria in the intact perfused rat heart and its use to estimate matrix Ca2+ under various conditions. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 24 (7), 765-773 (1992).
- Griffiths, E. J., Halestrap, A. P. Pyrophosphate metabolism in the perfused heart and isolated heart mitochondria and its role in regulation of mitochondrial function by calcium. Biochemical Journal. 290 (Pt 2), 489-495 (1993).
- Crompton, M., Moser, R., Ludi, H., Carafoli, E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. European Journal of Biochemistry. 82 (1), 25-31 (1978).
- Chance, B., Schoener, B., Oshino, R., Itshak, F., Nakase, Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. The Journal of Biological Chemistry. 254 (11), 4764-4771 (1979).
- Eng, J., Lynch, R. M., Balaban, R. S. Nicotinamide adenine dinucleotide fluorescence spectroscopy and imaging of isolated cardiac myocytes. Biophysical Journal. 55 (4), 621-630 (1989).
- Brandes, R., Bers, D. M. Simultaneous measurements of mitochondrial NADH and Ca(2+) during increased work in intact rat heart trabeculae. Biophysical Journal. 83 (2), 587-604 (2002).
- Jo, H., Noma, A., Matsuoka, S. Calcium-mediated coupling between mitochondrial substrate dehydrogenation and cardiac workload in single guinea-pig ventricular myocytes. Journal of Molecular Cellular Cardiology. 40 (3), 394-404 (2006).
- Lee, J. H., Ha, J. M., Leem, C. H. A Novel Nicotinamide Adenine Dinucleotide Correction Method for Mitochondrial Ca2+ Measurement with FURA-2-FF in Single Permeabilized Ventricular Myocytes of Rat. Korean Journal of Physiology and Pharmacology. 19 (4), 373-382 (2015).
- Powell, T., Terrar, D. A., Twist, V. W. Electrical properties of individual cells isolated from adult rat ventricular myocardium. Journal of Physiology. 302, 131-153 (1980).
- Sun, B., Leem, C. H., Vaughan-Jones, R. D. Novel chloride-dependent acid loader in the guinea-pig ventricular myocyte: part of a dual acid-loading mechanism. Journal of Physiology. 495 (Pt 1), 65-82 (1996).
- Page, E. Quantitative ultrastructural analysis in cardiac membrane physiology. American Journal of Physiology. 235 (5), C147-C158 (1978).
- Page, E., McCallister, L. P., Power, B. Sterological measurements of cardiac ultrastructures implicated in excitation-contraction coupling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 68 (7), 1465-1466 (1971).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
