Summary
Het protocol Details een in vitro muriene carcinoom model van niet-genetische defecte transcriptie rek. Hier wordt chronische remming van CDK9 gebruikt voor het onderdrukken van productieve verlenging van RNA Pol II langs pro-inflammatoire respons genen om na te bootsen en bestuderen van de klinisch overgediend TEzeker fenomeen, aanwezig in ongeveer 20% van alle soorten kanker.
Abstract
We hebben eerder gemeld dat een subset van kankers wordt gedefinieerd door wereldwijde transcriptionele deregulaties met wijdverbreide tekortkomingen in mRNA transcriptie verlenging (TE) — we noemen dergelijke kankerszeker. Met name, TEzeker kankers worden gekenmerkt door valse transcriptie en defecte mRNA verwerking in een grote reeks van genen, zoals INTERFERON/Jak/stat en TNF/NF-κb trajecten, wat leidt tot hun onderdrukking. Het TEabsoluut subtype van tumoren in niercelcarcinoom en gemetastaseerde melanoom patiënten correleren significant met slechte respons en uitkomst in immunotherapie. Gezien het belang van het onderzoeken vanzeker kankers — omdat het een belangrijke belemmering tegen immunotherapie poreert — is het doel van dit protocol om een in vitro tebepalen muismodel voor het bestuderen van deze wijdverspreide, niet-genetische transcriptionele afwijkingen in kankers en nieuwe inzichten verwerven, nieuw gebruik voor bestaande geneesmiddelen, of nieuwe strategieën tegen dergelijke kankers vinden. We detail het gebruik van chronische flavopiridol gemedieerde CDK9 remming aan abrote fosforylering van serine 2 residu op de C-terminale herhalings domein (CTD) van RNA polymerase II (RNA Pol II), onderdrukken van de vrijlating van RNA Pol II in productieve transcriptie Rek. Gezien het feit dat TEzeker kankers zijn niet geclassificeerd onder een specifieke somatische mutatie, een farmacologisch model is voordelig, en het beste bootst de wijdverbreide transcriptionele en epigenetische gebreken waargenomen in hen. Het gebruik van een geoptimaliseerde subletale dosis flavopiridol is de enige effectieve strategie bij het creëren van een generaliseerbaar model van niet-genetische wijdverbreide verstoring in transcriptie verlenging en mRNA-verwerkingsfouten, waarbij de klinisch waargenomen TE zeker kenmerken. Daarom, dit model van TEzeker kan worden ingezet om te dissect, cel-autonome factoren waardoor ze in verzet tegen immuun-gemedieerde celaanval.
Introduction
Een belangrijke snelheids beperkende stap in de uitdrukking van bijna alle actieve genen is de overgang van RNA-polymerase II (RNA Pol II) van Promoter-proximale onderbreken naar productieve rek1,2. Gezien het feit dat epigenetische disregulatie van transcriptionele rek helpt bij de progressie van meervoudige menselijke maligniteiten gedefinieerd als TEzeker, wat leidt tot suboptimale signalering in de pro-inflammatoire respons trajecten ten bedrage van een slechte respons en uitkomst van immunotherapie3, is het overkoepelende doel van dit protocol om een nuttig in vitro model op te zetten om deze wijdverbreide niet-genetische transcriptionele afwijkingen in kankers te bestuderen. In dit licht, het gebruik van chronische farmacologische remming van CDK9 is een effectieve strategie voor het creëren van een generaliseerbaar model van niet-genetische wijdverbreide verstoring in transcriptie rek en mRNA verwerking gebreken. De logica achter het gebruik van chronische CDK9 remming is dat het de fosforylering van serine 2-residu in de C-terminale herhalings domein (CTD) van RNA Pol II abrogates, waardoor het vrijkomen van RNA Pol II wordt onderdrukt tot een productieve transcriptie verlenging. Ook, TEzeker kanker, eerder beschreven door onze groep3, zijn niet geclassificeerd onder een specifieke somatische mutatie. Daarom is een niet-genetisch (farmacologisch) model voordelig en wordt het best de wijdverbreide transcriptionele en epigenetische defecten die in hen zijn waargenomen, nagebootst. De methode hierin Details de generatie en de karakterisering van chronische flavopiridol behandelings model van Murine kankercellen. Deze methode verstoort aantoonbaar transcriptie verlenging langs genen die gekenmerkt worden door langere genomische lengtes, met geposeerde promotors en induceerbaar uitdrukkingen zoals TNF/NF-κB en interferon/STAT signalering, grondig gecontroleerd op het niveau van transcriptie verlenging3,4,5. Over het algemeen is dit geoptimaliseerde muriene cellijn model van transcriptionele rek defecten-het enige model voor onze kennis om de nieuw beschreven TEzeker tumoren te bestuderen-drijft de weerstand tegen anti-tumor immuun aanval, waardoor een nuttig systeem om te exploiteren en onderzoeken van de kwetsbaarheden van niet-genetische defecten in kern transcriptie machines in kankers ten opzichte van immuun-gemedieerde celaanval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het institutioneel Comité voor dierenverzorging en-gebruik en de institutionele Bioveiligheidscommissie van de Cincinnati Children's Research Foundation keurden alle dierexperimentele procedures (IACUC protocol #2017-0061 en IBC-protocol #IBC2016-0016) goed, en deze experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen zoals beschreven in de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. chronische remming van RNA Pol II door flavopiridol behandeling — basisstrategie
- Zaad B16/F10 muis melanoom cellen in lage dichtheid (0,2 x 106) in een 10 cm kweek plaat in hun corresponderende medium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium [DMEM], 10% foetaal runderserum [FBS], 1% penicileen en streptomycine [pen/STREP]) en incuberen 's nachts bij een 37 °C, 5% CO2 bevoficeerde incubator.
- Was de volgende dag de cellen met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg een nieuwe batch cultuur media toe met een subletale dosis (geschat op 25 nM) flavopiridol — een remmer van de RNA Pol II-rekfactor p-TEFb (cyclin T/CDK9) — gedurende één week zonder verdere subculturing.
- Na een week van flavopiridol behandeling, uitvoeren bevestigende testen om te evalueren van het model van de mogelijkheid om te recapituleren verschillende kenmerken van transcriptionele rek gebreken gezien in TEzeker kankers.
2. bevestigende immunoblotassay ter beoordeling van defecte RNA Pol II-functie en bijzondere waardeverminderingen van interferon (IFN) pathway en tumor necrose factor (TNF) pathway signalering van in de gegenereerde muis TEzeker model
- Cultuur gelijk aantal (105) van flavopiridol behandeld B16/F10 muis melanoom cellen en ouder B16/F10 muis melanoom cellen in twee verschillende sets van 12 put platen (een set voor RNA Pol II functionele karakterisering en de andere set voor cytokine stimulatie) bij 37 °C in een nacht met 5% CO2 bevoficeerde incubator.
- Behandel de volgende dag de cellen in de cytokine-stimulatie set met de muis IFN-γ, IFN-α (5 ng/mL) of TNF-α (5 ng/mL) voor 45 min bij 37 °C.
- Haal nu op de volgende manier eiwitten uit cellen in zowel cytokine als RNA Pol II functionele karakterisatie sets met behulp van een radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer:
- Was cellen met 1x PBS en lyse met 50 μL van de lysisbuffer per put. Scrape, en pellet de gelyseerd cellen bij 4 °C, 21.130 x g.
- Meet het eiwit in cel lysaat supernatanten met behulp van een standaard colorimetrische assay voor eiwitconcentratie na detergentia solubilisatie (Bradford of een vergelijkbare assay).
- Belasting gelijke hoeveelheid gemeten proteïne (15 μg) uit elk monster om in een 4% − 18% natriumdodecylsulfaat (SDS) polyacrylamidegel te worden uitgevoerd en over te brengen op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen.
- Blokkeer de PVDF-membranen in 5% droge melk in tris-gebufferde zoutoplossing − Polysorbaat 20 (TBST) gedurende 1 uur, gevolgd door een nachtelijke incubatie bij 4 °C met primaire antilichamen (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; totaal H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-actin 1:5000) in 5% boviene serumalbumine.
- Was de volgende dag de PVDF-membranen met 1x TBST gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) en inbroed ze met geschikte secundaire antilichamen (anti-rat [1:5000] voor RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II en p-SER5 RNA Pol II; anti konijn (1:5000) voor H3K36me3, totaal H3, STAT1, p-STAT1, NFκB en p-NFκB) voor 50 min bij RT. Detecteer de eiwit signalen met behulp van commercieel verkrijgbare mierikswortelperoxidase (HRP) substraat met verbeterde chemiluminescentie.
Opmerking: β-actin primaire gebruikt is HRP-geconjugeerd, daarom kan het worden ontwikkeld zonder een secundair.
3. bevestigende assay ter beoordeling van mRNA-verwerkingsfouten in de gegenereerde muis TEzeker model
- Zaad gelijk aantal (0,2 x 106) van flavopiridol behandeld B16/F10 muis melanoom cellen en ouder B16/F10 muis melanoom cellen in 6-well platen bij 37 °c in een 5% Co2 bevoficeerde incubator 's nachts.
- Extract totaal RNA uit de gekweekte cellen op 60% confluentie met behulp van een RNA-extractie-reagens of Kit (tabel van materialen).
- Afbrekende rRNA van het totale geëxtraheerde RNA op de volgende wijze:
Opmerking: een low-input protocol is gecoöpteerd uit een in de handel verkrijgbare Kit om rRNA te afbrekende- Stel een waterbad of warmte blok in op 70 − 75 °C, en een ander waterbad of warmte blok bij 37 °C.
- Voeg het totale RNA (100 − 500 ng in 2 μL Nuclease vrij water) toe met 1 μL selectieve rRNA depletie sonde en 30 μL hybridisatie buffer in een micro centrifugebuis, meng zachtjes door grondig en inincuberen ze gedurende 5 minuten bij 70 − 75 °c.
- Breng de buizen nu over naar een waterbad/warmte blok van 37 °C en laat het monster afkoelen tot 37 °C gedurende een periode van 30 minuten.
- Regeer de selectieve rRNA depletie-probe magnetische kralen door vortexing en aliquot 75 μL kralen in een 1,5 mL RNase-vrije microcentrifuge buis.
- Plaats de kraal suspensie op een magnetische separator gedurende 1 min. laat de parels zich vestigen. Zuig het supernatant zachtjes op en gooi het weg. Herhaal het wassen van de kralen opnieuw door 75 μL Nuclease vrij water toe te voegen en het supernatant na magnetische scheiding te verwijderen.
- Hervat de gewassen kralen in 75 μL hybridisatie buffer en aliquot 25 μL naar een andere buis en onderhoud deze bij 37 °C voor later gebruik.
- Plaats de resterende 50 μL kralen op een magnetische separator gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg. Hervat de kralen in 20 μL hybridisatie buffer en behoud deze bij 37 °C voor later gebruik.
- Na het koelen van het RNA/selectieve rRNA-depletie-sonde mengsel tot 37 °C gedurende 30 minuten, centrifugeer kort de buis om het monster naar de bodem van de buis te verzamelen.
- Breng 33 μL van het RNA/selectieve rRNA-depletie-sonde mengsel over in de voorbereide magnetische kralen uit stap 3.3.7. Meng door lage snelheid vortexing.
- Incuberen de buis bij 37 °C gedurende 15 minuten. Meng de inhoud tijdens de incubatie af en toe voorzichtig. Gevolgd door korte centrifugeren om het monster naar de bodem van de buis te halen.
- Plaats de buis op een magnetische separator voor 1 min naar pellet de rRNA-probe complex. Deze keer niet verwijderen van de supernatant. Het supernatant bevat rRNA-uitgeput RNA.
- Plaats de buis van 25 μL kralen van stap 3.3.6 op een magnetisch scheidingsteken gedurende 1 min. Aspirate en gooi het supernatant weg. Voeg de supernatant van stap 3.3.11 toe aan de nieuwe buis van kralen. Meng door lage snelheid vortexing.
- Incuberen de buis bij 37 °C gedurende 15 minuten. Meng de inhoud tijdens de incubatie af en toe voorzichtig. Centrifugeer de buis kort om het monster naar de bodem van de buis te halen.
- Plaats de buis op een magnetische separator voor 1 min naar pellet de rRNA-probe complex. Gooi het supernatant niet weg. Breng het supernatant (ongeveer 53 μL) met rRNA-uitgeputte RNA over naar een nieuwe buis.
- Meet de concentratie van de RNA-opbrengst door een spectrofotometer.
- Gebruik de ene helft van de rRNA-uitgeputte monsters als input voor magnetische kralen die oligo (dT) 25 bevatten om polyA+ RNA op de volgende manier te extraheren:
Opmerking: dit Protocol van het isoleren van polyA tail Messenger RNA met behulp van oligo dT sequenties gebonden aan het oppervlak van magnetische kralen is gecoöpteerd uit een commercieel verkrijgbare Kit (tabel van materialen).- Respendeer de oligo dT-parels in de injectieflacon door kort te vortexeren voor > 30 s en breng 200 μL oligo dT-kralen over naar een buis. Voeg hetzelfde volume (200 μL) van de bindings buffer toe en hervat de uitgaven.
- Plaats de buis gedurende 1 minuut in een magneet en gooi het supernatant weg. Verwijder nu de buis van de magneet en rebreng de gewassen oligo dT-parels in 100 μL bindings buffer.
- Pas het volume van het ingangs-rRNA-uitgeputte totaal RNA-monster aan tot 100 μL met 10 mM tris-HCl pH 7,5. Voeg nu 100 μL bindings buffer toe.
- Verwarm tot 65 °C gedurende 2 minuten om secundaire RNA-structuren te verstoren. Nu, onmiddellijk plaats op ijs.
- Voeg de 200 μL totaal RNA toe aan de 100 μL gewassen kralen. Meng grondig en laat de binding door continu draaien op een rotor gedurende 5 minuten bij RT.
- Plaats de buis op de magneet voor 1-2 min en verwijder voorzichtig alle supernatant en verwijder voorzichtig alle supernatant.
- Verwijder de buis van de magneet en voeg 200 μL Wasbuffer toe.
- Meet de zuiverheid en concentratie van het geëxtraheerde polyA+ RNA door een spectrofotometer.
Opmerking: een 260/280-ratio van 1,90 − 2.00 en een 260/230-ratio van 2.00 − 2.20 voor alle RNA-monsters worden als aanvaardbaar beschouwd. - Gebruik de resterende helft van de rRNA-uitgeputte monsters uit sectie 3,3 als input voor eiwit A-kolommen (verstrekt in de RNA-immunoprecipitatie [RIP]-Kit, tabel met materialen) aan immunoprecipitate vijf-Prime afgetopte rna's met behulp van monoklonaal 7-methylguanosine antilichaam op de volgende wijze:
Opmerking: dit Protocol van het isoleren van m7G afgetopte boodschapper RNA met behulp van een in de handel verkrijgbare RNA immunoprecipitatie Kit is gecoöpteerd en verder gewijzigd.- Was het eiwit een magnetische kralen verkregen uit de RIP Kit volgens het Protocol van de fabrikant om het antilichaam vooraf te binden aan de kralen.
- Overdracht 3 μg van 7-methylguanosine antilichaam (konijn IgG in de kit kan worden gebruikt de negatieve controle) aan de parels in een microcentrifuge buis opgehangen in 100 μL wasbuffer uit de kit.
- Inincuberen met lage toerental rotatie gedurende 30 minuten bij RT. Centrifugeer buizen kort en plaats de buisjes op een magnetisch scheidingsteken, verwijder het supernatant en gooi het weg.
- Verwijder buisjes en voeg 500 μL wasbuffer uit de kit toe en Vortex kort. Centrifugeer de buizen kort gevolgd door magnetische scheiding nogmaals, verwijder en gooi het supernatant weg.
- Herhaal stap 3.6.4 nogmaals.
- Voeg rond 120 ng van rRNA uitgeput (van sectie 3,3) naar de voorwas 7-methylguanosine antilichaam gebonden kralen. Voeg 1 μL RNase-remmer toe. Incuberen bij RT voor 1 − 1,5 uur met milde opwinding.
- Draai de parels af op 300 x g voor 10 sec. en verwijder het supernatant met niet-afgetopte (niet-7-methyl Guanosine) mRNA naar een nieuwe microcentrifuge buis.
- Voeg 100 μL wasbuffer toe en was het nog tweemaal zo. Zwembad de verzamelde supernatant in dezelfde microcentrifuge buis gelabeld zonder afgetopt (niet-7-methylguosine) mRNA. Opslaan op ijs.
- Elute de afgetopte (7-methylguanosine) mRNA uit de parels met 300 μL ureum lysisbuffer (ULB) met 7 M ureum, 2% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mM EDTA en 10 mM Tris, pH 7,5 door de parels te verwarmen bij 65 °C gedurende 2 − 3 min.
- Meng 300 μL van de geeleerde monsters (afgetopt en niet-afgetopte mRNA) met 300 μL fenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1; in de handel verkrijgbaar) (opgeslagen bij 4 °C). Meng goed door inverteren en laat ongeveer 10 min en meng weer zachtjes.
- Centrifugeer bij 18.928 x g gedurende 2 minuten en Pipetteer de toplaag voorzichtig op een frisse Tube en gooi de onderste laag weg.
- Voeg 300 μL fenol toe: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1; opgeslagen bij 4 °C) op de monsters. Meng goed door inverteren en centrifugeer vervolgens op 18.928 x g gedurende 1 min. Pipetteer de bovenste laag naar een frisse buis en gooi de onderste laag weg.
- Voeg 300 μL 2-porpanol en 30 μL van 3 M Natriumacetaat (pH 5,2) toe aan het afgetopte en niet-afgetopte RNA. Keer het monster een paar keer om en zet het bij-20 °C gedurende 20 uur.
- Centrifugeer nu de monsters bij 18.928 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 500 μL 70% ethanol toe.
- Centrifugeer nogmaals bij 18.928 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant voorzichtig weg en droog de pellet bij RT gedurende minder dan 5 min. regeer de pellet in Nuclease-vrij water.
- Meet de zuiverheid en concentratie van RNA-opbrengst door een spectrofotometer. De 260/280-verhouding moet in het bereik van 1,90 − 2.00 liggen en de 260/230-verhouding in het bereik van 2.00 − 2.20 voor alle RNA-monsters.
4. bevestigende assay om de reactie van de muis te beoordelenzeker model naar Fasl gemedieerde celdood
- Zaad gelijk aantal (30.000 cellen) van flavopiridol behandeld B16/F10 muis melanoom cellen en ouder B16/F10 muis melanoom cellen in een 96-well cultuur plaat in hun corresponderende medium (DMEM), en inincuberen 's nachts in een 37 °C, 5% CO2 bevoficeerd Incubator.
- Behandel de cellen in een kweek kapje met verschillende concentraties van hzijn6fasl (0,1 − 1000 ng/ml) in aanwezigheid van 10 μg/ml Anti-his-antilichaam en incuberen gedurende 24 uur bij 37 °c, 5% Co2 bevoficeerde incubator.
- Verwijder dode cellen door te wassen met 1x PBS-buffer. Bevestig de bijgevoegde cellen in 4% Paraformaldehyde gedurende 20 min bij RT. Gooi de 4% Paraformaldehyde weg (niet nodig om te wassen) en beits met een Kristalvioletoplossing (20% methanol, 0,5% kristalviolet in 1x PBS) gedurende 30 minuten.
- Verwijder overtollig vlek door de platen voorzichtig in kraanwater te spoelen. Houd de platen droog bij RT.
- Los het kristalviolet opnieuw op in 100 μL 1x nonionische oppervlakteactieve stof, opgelost in 1x PBS, en meet de celdichtheid door meting van de extinctie bij 570 nm in een microplaat lezer.
5. verkennende assay ter beoordeling van de reactie van muis TEzeker model voor antigeen specifieke cytotoxische T-cel aanval
- Isolatie en activering van OT-I CD8 + cytotoxische T-celaanval (CTL)
- Purify CD8 + cellen uit milt van OT-I TCR TG RAG-1 −/− muizen door magnetische celscheiding met behulp van een muis CD8 T cell isolation Kit als volgt:
- Oogst twee milt uit twee OT-I TCR TG RAG-1 −/− muizen in volledige RPMI-media.
- Pureer de milt in een filter van 70 μm op een buis van 50 mL, gevuld met 20 mL RPMI, met behulp van de achterkant van een injectiespuit totdat alleen vet in het filter is achtergebleven.
- Centrifugeer de stroom gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 220 x g . Gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 mL rode bloedcel (RBC) lysisbuffer toe aan de milt pellet van de vorige centrifugeren stap en Pipetteer het mengsel gedurende 1 minuut.
- Neutraliseer de oplossing door maximaal 10 mL RPMI toe te voegen.
- Centrifugeer bij 220 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi de supernatant weg en regeer in 10 mL RPMI.
- Neem een klein aliquot voor het tellen. Centrifugeer de resterende hoeveelheid bij 220 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Voor elke miljoen cellen geteld, respendeert de pellet in 1 mL in de handel verkrijgbare magnetische scheidingssysteem buffer (Mojo buffer of een vergelijkbare buffer).
- Bereid een cocktail van antilichamen van volume 100 μL voor elke 1 ml gepileerde cellen in stap 5.1.1.8. De cocktail van antilichamen omvat: Biotine anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ en CD44.
- Voeg deze cocktail toe aan de 1 ml gepileerde cellen en blijf 15 minuten op ijs.
- Voeg 100 μL magnetische (streptavidine) kralen toe aan elke 100 μL van de cocktail van het antilichaam toegevoegd aan de 1 mL resuspendeerde cellen van de milt. Blijf 15 minuten op ijs.
- Voeg 7 mL van de in de handel verkrijgbare magnetische separatie systeem buffer toe. Nu, aliquot ongeveer 3 − 4 mL van het mengsel naar een frisse buis. Meng goed en bevestig het aan de magneet voor 5 min.
- Decaner de vloeistof (bevat CD8 + cellen) naar een verse buis op ijs. Nu, aliquot de resterende 3 − 4 mL mengsel van stap 5.1.1.12 naar de buis en bevestig het aan de magneet voor 5 min. Decanteer de vloeistof (tweede partij van CD8 + cellen geïsoleerd) op dezelfde buis met de eerste partij van CD8 + cellen op ijs gehouden.
- Seed engineered aanhandig fibroblast APC-(MEC. B7. Sigova) lijn om een specifieke ovalbumine (OVA)-afgeleide, H-2kb-beperkt peptide epitoop OVA257-264 (siinfekl), samen met de co-stimulatory molecuul b 7.1, bij 75.000 cellen per goed in 24-Well platen, bij 37 ° c, 5% Co2 bevoficeerde incubator.
Let op: de aanhandige fibroblast die gebruikt wordt is een geschenk van Dr. Edith Janssen ' Lab bij CCHMC. De lijn werd oorspronkelijk gemaakt in Dr. Stephen P. Schoenberger Lab in La Jolla Institute voor allergie en immunologie6. - Was na 24 uur de monolaag van APC eenmaal met het gemodificeerde Dulbecco's medium (IMDM) van Iscove dat in de handel verkrijgbaar is met HEPES-buffer, natriumpyruvate, L-glutamine en hoge glucose) en Voeg 0,5 x 106 NAÏEVE OT-I CD8 + cellen toe (uit stap 5.1.1.13) in 2 ml imdm aangevuld met 50 mM β-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamine en HEPES en 10% FBS.
- Oogst na 20 uur zachtjes de niet-aanhangend OT-I cellen (door de media in de kweek schaal te verzamelen met zwevende OT-I cellen en de cellen gedurende 2 minuten op 191 x g te pelleteren; Tel de levensvatbare OT-i cellen) en breng ze over voor co-cultuur.
- Purify CD8 + cellen uit milt van OT-I TCR TG RAG-1 −/− muizen door magnetische celscheiding met behulp van een muis CD8 T cell isolation Kit als volgt:
- Co-cultuur van CD8 + cellen met B16/F10-eicellen
- Zaad OT-I-afgeleide CD8 + cellen in een verhouding van 1:1 (300.000 cellen elk) in een co-cultuur met B16/F10 (ontbreekt het antigeen ovalbumine), onbehandeld B16/F10-OVA, en B16/F10-OVA cellen voorbehandeld met flavopiridol (25 nM) voor 1 week, in 6-well gerechten met volledige DMEM medium voor 20 uur bij 37 °C in een 5% CO2 bevoficeerde incubator.
- Na 20 h, verwijder de OT-I-afgeleide CD8 + cellen (door het verzamelen van de media in de cultuur schotel met zwevende OT-I afgeleide CD8 + cellen). Was de aanhandige B16/F10-OVA-cellen in 1x PBS.
- Trypsinize de drie groepen van de bijgevoegde B16/F10-OVA cellen in 0,05% EDTA met trypsine voor 5 min. pellet de trypsinized cellen bij 191 x g gedurende 5 min.
- Vlek de geoogste B16/F10-OVA-cellen door ze in koude PBS (met 0,5% FBS en 0,05% natrium azide) met levensvatbaarheid kleurstof en relevante gelabelde antilichamen (fixable levensvatbaarheid kleuring Dye e780, AF647-geconjugeerde muis CD8 en BV421-geconjugeerde muis CD45 ).
- Analyseer de levensvatbaarheid van de drie groepen van B16/F10-OVA cellen doorstroming cytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier bieden we een gedetailleerd schema (Figuur 1) om een tezeker celmodel te vestigen dat wordt verkregen door chronische subletale (Figuur 2) behandeling met Flavopiridol bij 25 nm. In Figuur 3, op 3 dagen van behandeling met flavopiridol vertonen B16 eicellen cellen gedeeltelijke kenmerken van tezeker maar na een week van behandeling vertonen B16/F10 OVA-cellen een diepgaand verlies van fosforylering bij serine 2 positie op de CTD van RNA Pol II langs met een significante afname in H3K36me3 — een Histon-modificatie die betrokken is bij het definiëren van Exon-grenzen en een remmer van run-away cryptische transcripties. Als gevolg daarvan, TEzeker cel model toont kritische mRNA verwerking gebreken met duidelijk verhoogde ratio's van onjuist afgetopte en niet-poly-adenylated mrna's (figuur 4a, B). Ook wordt specifieke onderdrukking van belangrijke inflammatoire respons traject genen en FasL gemedieerde cel dood traject gezien in Figuur 5 en Figuur 6. De opgelegde weerstand tegen interferon (IFN-α, IFNγ) en TNF-α gestimuleerd fosforylering van STAT1 en NFκB, en resistentie tegen celdood door de doods receptor ligand FasL vermindert de cytotoxiciteit van een immuuncelaanval drastisch tegen TEzeker Tumoren. Deze bevestigende technieken zijn ontworpen om de mate van invloed te testen chronische perturbatie van transcriptie rek heeft op een breed scala van stimulus-responsieve genen, en of een dergelijke perturbatie in een bepaalde muis cellijn model voldoende genoeg is om prompt een acuut gebrek aan functionele mRNA in inflammatoire respons signalering van genen, nabootsen van de fundamentele essentialiteiten van TEzeker kankers klinisch. Op basis van onze studie van de behandeling met flavopiridol is de onderdrukking van fosforylering bij het tweede serine residu (pSER2) van RNA Pol II CTD van cruciaal belang, omdat het de transcriptie verlenging markeert. Een subletale dosis voor een bepaalde muis carcinoom cellijn moet een verlaging van de pSER2 niveaus te bereiken, naast het hebben van een onbelangrijk effect op de snelheid van de groei en de levensvatbaarheid van de cellijn. Hoewel we consequent een afname van pSER2 en H3K36me3 niveaus zien op 25 nM flavopiridol behandelingen, garandeert het geen onderdrukking van zowel pSTAT1-als pNFκB-niveaus (op respectievelijk IFN-α, IFNγ en TNF-α-stimulaties). Elke muis carcinoom cellijn is uniek (B16/F10 OVA of CT26 cellen gekweekt in verschillende laboratoria over een periode van tijd kan enigszins veranderde effecten) en ze kunnen ofwel JAK1 of CCNT1 gedeeltelijk het redden van de effecten van flavopiridol in het onderdrukken van de inflammatoire respons traject genen. In dergelijke gevallen moet de kinetiek van pSTAT1-en pNFκB-niveaus mogelijk op verschillende tijdstippen worden gecontroleerd (5 − 70 min) om de temporaliteit van flavopiridol gemedieerde effecten en de redding ervan door ofwel JAK1 of CCNT1 te begrijpen. Dienovereenkomstig moet JAK1 en/of CCNT1 mogelijk worden uitgeschakeld om dit model vast te stellen.
Zodra de flavopiridol model is opgericht en gekarakteriseerd met behulp van de bovengenoemde assays, we bieden een verkennende assay om te testen of de TEzeker cel model verleent weerstand tegen cytotoxische T-cel (CTL) aanval. Op basis van ons geoptimaliseerde protocol werd flavopiridol behandeld B16/F10 cellen die het OVA-gen (B16 OVA) stabiel overtrokken met de geactiveerde CD8 + Ctl's (specifiek voor de OVA257-264 epitope) met selectieve toxiciteit voor eicellen-uitdrukken van cellen (een geschenk van Dr. Stephen P. Schoenberger Lab6) waren niet vatbaar voor OT-I CTL-gemedieerde tumor lysis. B16/F10 OVA-cellen (niet voorbehandeld met flavopiridol) onderging een massale celdood in dit systeem, terwijl B16/F10 ouderlijke cellen overleefden, omdat ze geen EICEL antigeen uitdrukken (Figuur 7). Het is duidelijk uit de uitkomst van de voorgestelde verkennende assay dat chronische flavopiridol-geïnduceerde TEzeker een middel kan schenken om te ontsnappen aan anti-tumor immuun aanval zelfs in vivo. Dit kan verder worden getest in in vivo tumor modellen om te controleren van de neiging van TEzeker modellen om te ontsnappen van aangeboren en adaptieve anti-tumor immuunresponsen. Anti-asialo behandelingen kunnen worden gebruikt voor het reguleren van de activiteit van NK-cellen in vivo in tumor lager muizen. Ook, immuun Checkpoint therapie (anti-CTLA4 en anti-PD1) kan worden toegediend aan TEzeker tumor lager muizen.
In totaliteit, de TEzeker bevestigende assays samen met de voorgestelde verkennende assay demonstreren samen het nut van het opnemen van dit tezeker celmodel in een hele reeks andere tumor-immune testomstandigheden. Dit model kan helpen parseren van de moleculaire Details als gevolg van defecte transcriptionele rek in tumorcellen en hun reactie op immuuncelinteracties.
Figuur 1: schematische weergave van de werkstroom. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: celgroei kenmerken van B16 OVA cellen chronisch behandeld met lage dosis flavopiridol: levensvatbaarheid (gemeten door levensvatbaarheid reagens) van controle en flavopiridol behandelde cellen B16 OVA op aangegeven dagen na de behandeling. Dit cijfer is gewijzigd van Modur et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bevestigende assay om RNA Pol II en Histon-profiel te beoordelen: immunoblots van aangegeven Histon en RNA Pol II merken in B16 OVA cellen behandeld met flavopiridol voor 72 h of 1 week. Dit cijfer is gewijzigd van Modur et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: bevestigende assay om ernstige defecten in de mRNA-verwerking te beoordelen. Ratio's van 5 ′-ongetopt tot 5 ′-afgetopt (a) en 3 ′-niet-polyadenyleerd naar 3 ′-polyadenyated (B) mRNA-concentraties na uitputting van rRNA in de aangegeven cellijnen. Foutbalken staan voor standaarddeviatie op basis van drie technische replicaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: bevestigende assay om het cytokine-stimulatie profiel te beoordelen. Immunoblots van STAT1, pSTAT1, NFκB en p NFκB in Control en flavopiridol voorbehandelde B16 OVA cellen gestimuleerd met IFN-α, IFNγ of TNF-α gedurende 30 min bij (5 ng/mL). Dit cijfer is gewijzigd van Modur et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: bevestigende assay om de weerstand tegen FasL gemedieerde celdood in vitro te beoordelen. Control en flavopiridol voorbehandelde B16 OVA cellen behandeld met FasL voor 24 h uitlezen gemeten door de levensvatbaarheid assay. Dit cijfer is gewijzigd van Modur et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: verkennende assay om de weerstand van TEzeker model te beoordelen tot antigeen-beperkte cytotoxische T-cel gemedieerde aanval in vitro. Links: schematisch schema van de verkennende test. Rechts: relatieve levensvatbaarheid van B16/F10-eicellen samen met geactiveerde CD8 + Ctl's (1:1 ratio) geïsoleerd van de milt van OT-I muizen. P: Welch t-toets met twee steekproeven. Dit cijfer is gewijzigd van Modur et al.3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA Pol II rek controle is ontstaan als een beslissende hefboom voor het reguleren van stimulus-responsieve genexpressie ten gunste van kwaadaardige cellen5,7,8. Het overwinnen van Promoter-proximale pauze tot rek en daaropvolgende mRNA-productie vereist de kinase activiteit van P-tefb9,10,11. Ons model maakt gebruik van flavopiridol (25 nM), een remmer van de essentiële cyclin-afhankelijke kinase CDK9, om na te bootsen de gebreken waargenomen tijdens Pol II rek in TEzeker kankers-een eerder onbekend fenotype in kankers ontdekt door onze groep eerder3.
CDK9 kinase activiteit is al lang bekend als essentieel voor fosforylering van serine 2-residuen in de CTD van de grote subeenheid van Pol II. Kritisch, we zijn erin geslaagd om te optimaliseren flavopiridol behandeld chronische remming van CDK9 (25 nM voor 1 week) in B16/F10 eicellen zodanig dat, naast remming van CTD fosforylering, 25 nM flavopiridol behandeling voor 1 week voorkomt dat de juiste post-transcriptionele wijzigingen van mRNA op een onverwachte manier en effectief abrogates p-TEFb-afhankelijke productieve rek langs lange genen zoals pro-inflammatoire respons signalering van genen, significant wijzigen van hun patronen van expressie, zowel op de mRNA en eiwit niveaus. Naar het beste van onze kennis is er geen ander model beschreven in de literatuur die effectief hetzelfde bereikt.
Dit gemakkelijk vast te stellen, generaliseerbare model van TEzeker kan worden ingezet om te dissect, zowel transcriptionele en epigenetische modificaties waardoor tezeker kankers aan te passen aan immuun-gemedieerde celaanval. Bovendien behoudt dit muriene model zijn TEabsoluut-achtige reductie van het totaal en phospho-RNA Pol II-niveau 21 dagen na flavopiridol in in vivo groei assay3 (niet vermeld in het protocol hier), wat suggereert dat de mate van stabiliteit van deze niet-genetisch model voor verdere in vivo experimenten. Echter, zorg moet worden genomen om de exacte subletale dosis flavopiridol voor andere muriene lijnen te optimaliseren (bv, ongeveer 20 nm flavopiridol behandeling voor 1 week is de subletale dosis voor MC38 muriene carcinoom lijn; niet gebruikt in dit Protocol), de impact van variatie in cel plating dichtheid, cultuuromstandigheden en cytokine stimulatie omstandigheden kunnen variëren voor verschillende lymfklier lijnen. Het protocol beschreven hier geeft een basiskader om te minimaliseren van de variabelen waarvan bekend is dat ze kritisch zijn voor de generatie van TEabsoluut-achtige functies door chronische CDK9 remming. Bovendien, menselijke carcinoom cellijnen, zoals T47D en CAL51 zijn getest met korte termijn (3 dagen) flavopiridol behandelingen die aanleiding geven tot vergelijkbare TEabsoluut-achtige RNA Pol II profielen, wat aangeeft van het nut van flavopiridol gebaseerde chronische remming van CDK9 gemedieerde transcriptie rek in het creëren van zelfs model menselijke lijnen te studeren tezeker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels ondersteund door NCI (CA193549) en CCHMC Research Innovation pilot Awards aan Kakajan Komurov en Department of Defense (BC150484) Award aan Navneet Singh. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Cancer Institute of het ministerie van defensie. De financiers hadden geen rol in het studie ontwerp, het verzamelen en analyseren van gegevens, het besluit om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
