Articolo metodologico

Monitoraggio delle interazioni GPCR-arresto 1/2 nei sistemi di vita in tempo reale per accelerare la scoperta di farmaci

6.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/59994

⸱

28 giugno 2019

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine, Korea University

In questo articolo

Sommario

Le interazioni di GPCR-z-arrestin sono un campo emergente nella scoperta di farmaci GPCR. Metodi accurati, precisi e facili da impostare sono necessari per monitorare tali interazioni nei sistemi viventi. Mostriamo un saggio di complemento strutturale per monitorare le interazioni di GPCR-arresto-arresto in celle viventi in tempo reale, e può essere esteso a qualsiasi GPCR.

Abstract

Le interazioni tra i recettori accoppiati alle proteine G (GLR) e gli arresti z sono processi vitali con implicazioni fisiologiche di grande importanza. Attualmente, la caratterizzazione di nuovi farmaci verso le loro interazioni con gli arresti z e altre proteine citosoliche è estremamente preziosa nel campo della scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo studio dell'agonismo di parte della GPCR. Qui, mostriamo l'applicazione di un nuovo saggio di complemento strutturale per monitorare con precisione le interazioni recettore-arresto in sistemi viventi in tempo reale. Questo metodo è semplice, preciso e può essere facilmente esteso a qualsiasi GPCR di interesse e ha anche il vantaggio di superare interazioni non specifiche a causa della presenza di un promotore di bassa espressione presente in ogni sistema vettoriale. Questa analisi di complemento strutturale fornisce caratteristiche chiave che consentono un monitoraggio accurato e preciso delle interazioni recettore-z-arrestin, rendendolo adatto nello studio dell'agonismo distorto di qualsiasi sistema GPCR e del GPCR c-terminus 'phosphorylation diversi codici 'scritti da diverse chinasi GPCR (GRK) e modifiche post-traduzionali di arrestini che stabilizzano o destabilizzano il complesso recettore-arresto.

Introduzione

I GPD rappresentano l'obiettivo di quasi il 35% dei farmaci attuali sul mercato1,2 e una chiara comprensione della loro farmacologia è cruciale nello sviluppo di nuovi farmaci terapeutici3. Uno degli aspetti chiave nella scoperta di farmaci GPCR, in particolare durante lo sviluppo di agonisti di parte è la caratterizzazione di nuovi ligandi verso le interazioni recettore-arresto4 e le interazioni di arresto-arresto con altre proteine citosoliche come come clathrin5.

È stato documentato che la segnalazione dipendente da z-arrestin svolge un ruolo chiave nei disturbi neurologici come il disturbo bipolare, la depressione maggiore e la schizofrenia6 e anche gravi effetti collaterali in alcuni farmaci come la morfina7.

I metodi attuali utilizzati per monitorare queste interazioni di solito non rappresentano livelli endogeni effettivi delle proteine in studio, in alcuni casi mostrano segnale debole, fotosbiancamento e a seconda del GPCR potrebbe essere tecnicamente difficile da impostare8. Questa nuova analisi di complemento strutturale utilizza vettori promotori di bassa espressione per simulare livelli fisiologici endogeni e fornisce un'elevata sensibilità rispetto ai metodi attuali9. Utilizzando questo approccio, è stato possibile caratterizzare facilmente le interazioni di Galanin receptor-z-arrestin11/2 e anche di z-arrestin2-clathrin10. Questa metodologia può essere ampiamente utilizzata per qualsiasi GPCR di particolare interesse in cui gli arresti z svolgono una funzione fisiologica chiave o la loro segnalazione è rilevante in alcune malattie.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Strategia di progettazione dei primer

  1. Progettare i primi geni di interesse nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT].
  2. Selezionare almeno uno di questi tre siti come uno dei due enzimi di restrizione univoci necessari per la clonazione direzionale a causa della presenza di un codon di stop in-frame che divide il sito di multicloning come illustrato nella Figura 111.
  3. Incorporare la sequenza dei nucleotidi nei primer come illustrato nella Tabella 1 per codificare i residui del linker visualizzati in rosso nella tabella 211.
  4. Per i vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT2.1-C [TK/SmBiT], assicurarsi che il numero a 5 contenga un codone ATG e una potente sequenza di consenso Kozak (GCCGCCACC).
  5. Per i vettori pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT], assicurarsi che il 3 - primer contenga un codone di arresto.
    NOTA: Ogni vettore contiene il promotore HSV-TK per ridurre al minimo l'associazione non specifica e ridurre gli artefatti sperimentali, inoltre ogni vettore ha una cassetta di espressione per la resistenza all'antipicillina nei batteri.

2. PCR

  1. Impostare ed eseguire le reazioni PCR per amplificare il DNA inserto del gene di interesse utilizzando i primer progettati dal punto 1. È importante usare una polimerasi del DNA ad alta fedeltà per ridurre al minimo le mutazioni.
  2. Utilizzare esattamente il seguente ordine per preparare 50 l-L di reazione PCR. Aggiungere 35,5 l di acqua distillata, 5 lofani da 10 x il tampone di polimerasi, 5 di miscela dNTP (2,5 mM ciascuno), 1 l l di modello plasmide (200 ng/LL), 1,25 l di intornatori avanti e primo (10 M) e 1 l of high-polymerase (5 U/LL).
  3. Utilizzando un termociclore impostare il seguente programma di amplificazione del DNA.
    1. Denaturare a 95 gradi centigradi per 5 min.
    2. Ripetere 25 volte il seguente ciclo termico: 95 gradi centigradi per 30 s, 60 gradi centigradi per 1 min, 72 s per 2 min per 1 kbp da amplificare.
    3. Eseguire un'estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min.
    4. Tenere i campioni a 4 gradi centigradi all'interno del termociclore.
      NOTA: Si consiglia vivamente di utilizzare una polimerasi ad alta fedeltà per ridurre al minimo le mutazioni puntiformi in particolare quelle che si verificano durante l'amplificazione di sequenze lunghe. Man mano che l'amplificatore diventa più lungo, il grado di precisione nella replicazione del DNA diminuisce. Per la reazione PCR, scegliere la temperatura di annessione in base alla temperatura di fusione della regione in cui le oligosisidirettamente si ibridano con il modello di DNA e non con tutta la sequenza del primer.
  4. Purificazione del prodotto PCR
    1. Isolare il prodotto PCR dal resto della reazione PCR utilizzando un kit da un produttore di preferenza12. Il prodotto PCR è ora pronto per la digestione delle restrizioni.

3. digestione del DNA

  1. Per la digestione del prodotto PCR preparare 50 : L di reazione di digestione come segue.
    1. Utilizzando un tubo da 1,5 mL, aggiungere 12 l di acqua distillata.
    2. Aggiungere 5 - L di 10x buffer con la migliore compatibilità con entrambi gli enzimi di restrizione.
    3. A partire dalla 2.4 aggiungere 30 ll di prodotto PCR
    4. Infine, aggiungere 1,5 l di ogni enzima di restrizione.
    5. Mescolare brevemente per vortice e incubare a 37,5 gradi durante la notte.
  2. Per la digestione del plasmide ricevente preparare 50 L di reazione di digestione come segue:
    1. Utilizzando un tubo da 1,5 mL, aggiungere 23 l di acqua distillata.
    2. Aggiungere 5 - L di 10x buffer con la migliore compatibilità con entrambi gli enzimi di restrizione.
    3. Aggiungere 15 l di plasmide del recipiente (200 ng/L).
    4. Aggiungere 1,5 l di ogni enzima di restrizione.
    5. Mescolare brevemente per vortice e incubare a 37,5 gradi durante la notte.
      NOTA: È importante utilizzare 3 g di plasmide ricevente per ottenere materiale sufficiente dopo la purificazione del gel di agarose DNA. È anche rilevante lasciare le digestione del DNA durante la notte utilizzando entrambi gli enzimi per ottenere un'elevata efficienza di clonazione.

4. Purificazione e clonazione del gel di agarose DNA

  1. Preparare un gel di agarose dell'1% per eseguire il plasmide di DNA digerito e gli inserti e procedere a tagliare le bande corrispondenti. Una volta che le bande vettoriali e inserto corrispondenti sono state purificate12, determinare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro.
  2. Eseguire la legatura del DNA per fondere l'inserto al plasmide del destinatario.
  3. Preparare le reazioni di legatura di circa 100 ng di DNA totale tra cui 50 ng di vettore plasmide.
  4. Impostare il rapporto di inserimento plasmid del destinatario di circa 1:3; può essere calcolato utilizzando una calcolatrice di inserimento vettoriale13.
  5. Impostare i controlli negativi in parallelo. Ad esempio, una legatura del DNA plasmide del destinatario senza alcun inserto fornirà informazioni sulla quantità di background del plasmide del destinatario non digerito o auto-ligante.

5. Trasformazione dei cloni

  1. Collocare un tubo di celle competenti del DH5 dal congelatore a -80 gradi centigradi e trasferirlo immediatamente sul ghiaccio per 20 min.
  2. Dopo di che, prendere 55 L di cellule competenti DH5 e aggiungere 4 L di reazione di legatura e mescolare facendo scorrere il tubo e conservare sul ghiaccio per 45 min.
  3. Mettere il tubo in un bagno d'acqua precedentemente riscaldato a 42 gradi centigradi per esattamente 48 s e ottenere immediatamente i tubi di nuovo sul ghiaccio per altri 3 min.
  4. Aggiungere 600 l- di Luria Broth (LB) in precedenza riscaldato a 37,5 gradi centigradi e incubare con agitazione per 1 ora a 200 giri/min.
  5. Trasferire 200 l in una piastra di agar contenente ampicillina 100 g/mL e spalmati delicatamente sulla superficie con il liquido viene per lo più assorbito.
  6. Incubare le piastre durante la notte per vedere le colonie mattina successiva. Il plasmide ricevente sulla piastra di inserimento dovrebbe avere un numero significativamente maggiore di colonie rispetto alla sola piastra del plasmide ricevente.

6. Isolamento del plasmide finito

  1. Scegli 3-10 colonie batteriche individuali e trasferiscili in 1 mL di lB media contenente ampicillina (100 g/mL) e incuba per 6 h.
  2. Prendere 200 litri di sospensione batterica e trasferirli a 5 mL di lB media contenente la stessa concentrazione di ampicillina del punto 6.1 e incubare pernottamento a 37,5 gradi centigradi con agitazione a 200 giri/m.
  3. Utilizzando una purificazione del kit di DNA miniprep, eseguire miniprep dna purifications utilizzando 5 mL di LB coltivato durante la notte seguendo le istruzioni del produttore14.
  4. Per identificare i ligazioni riuscite, impostare le reazioni PCR allo stesso modo della sezione 2 utilizzando il DNA ottenuto dal passaggio 6.3 come modello con gli stessi primer della sezione 2 durante la prima PCR. Cloni positivi produrranno prodotti PCR con le dimensioni corrispondenti.
  5. Dopo una grande purificazione del DNA di preparazione dei cloni positivi, condurre una digestione diagnostica restrizione di 500 ng di DNA purificato con gli enzimi utilizzati durante la fase di clonazione ed eseguire i prodotti digeriti su un 1% gel di agarose. Dovrebbero essere presenti due bande: una delle dimensioni del vettore e una la dimensione del nuovo inserto.
  6. Verificare la sequenza di costruzione sequenziando utilizzando i seguenti numeri primi: Avanti 5'- aaggtgagcgtgtgggcctcgaac-3' e inverso 5'-gcatttttttcactgctagttt-3'.
    NOTA: Quando il DNA viene replicato utilizzando la PCR, c'è sempre la possibilità di errori durante l'amplificazione anche quando si utilizza una polimerasi ad alta fedeltà, quindi è molto importante per sequenziare i costrutti finali.

7. La trasfezione e l'espressione proteica

  1. In una piastra bianca precedentemente rivestita in poli-L-lisina 96, eseguire la semina cellulare un giorno prima della trasfezione a 2,5 x 104 celle per pozzo utilizzando il mezzo di Alano modificato di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale, 100 U/mL penicillinA G e 100 g/ mL streptomicina.
  2. Utilizzare solo i 60 pozzi interni per ridurre al minimo il potenziale di gradienti termici attraverso la piastra e gli effetti del bordo dall'evaporazione. Aggiungete 200 l di acqua distillata sterile ai 36 pozzi esterni e 150 l negli spazi tra i pozze e incubate durante la notte a 37,5 gradi centigradi e il 5% di CO2.
  3. La mattina seguente esegue la trasfezione utilizzando 100 ng di DNA totale (50 ng ogni costrutto).
  4. Impostare quattro diverse combinazioni di plasmide (recettore:z-arrestin) secondo la figura 2b.
  5. Per ogni combinazione di plasmide utilizzare 20 -L del Minimum Essential Media dell'Aquila modificato memorizzato nel buffer con HEPES utilizzando 0,3 dollari di reagente di trasfezione lipidico per pozzo.
  6. Aggiungere 20 - L di miscela reagente-DNA di trasfeone lipidica ad ogni pozzo e mescolare la piastra in cerchi per 10 s.
  7. Cambiare il mezzo fresco dopo 6 ore di incubazione a 37,5 sC e 5% CO2.
  8. Incubare la piastra per 24 h a 37,5 gradi centigradi e il 5% di CO2.

8. Monitoraggio delle interazioni recettore-arresto-z-arresto1/2 nelle cellule HEK293

  1. Aspirare il mezzo e aggiungere 100 l di Eagle's Minimum Essential Media modificato memorizzato nel buffer con HEPES in ogni pozzo e lasciare che la piastra si stabilizzi a RT per 10 min.
  2. Preparare il substrato di furimazine combinando 1 volume di 100x substrato con 19 volumi di LCS Dilution Buffer (una diluizione di 20 volte)11, creando un stock 5x da mescolare con il mezzo di coltura cellulare.
  3. Aggiungere 25 luna di 5x furimazine ad ogni pozzo e mescolare delicatamente a cerchi per 10 s.
  4. Misurare la luminescenza per 10 min per la stabilizzazione del segnale a RT.
    NOTA: Utilizzando questo segnale di base per normalizzare la risposta di ogni pozzo contribuirà a ridurre la variabilità causata dalle differenze nel numero di cellule placcate per bene, anche differenze nell'efficienza della trasfezione, ecc. Una volta calcolato, calcolare la media della risposta normalizzata da pozzi replicati per un determinato trattamento farmacologico.
  5. Prepara una soluzione di ligando 13.5x nel Minimum Essential Media di Eagle modificato con HEPES.
  6. Per esperimenti a temperatura ambiente con 10 .
  7. Per gli esperimenti a 37,5 gradi centigradi con 10 luna di 13,5 volte l'aggiunta di ligando, utilizzare iniettori per erogare composti e mescolare utilizzando lo shaker orbitale dello strumento. In caso di non utilizzo di iniettori, rimuovere la piastra dal luminometro, aggiungere i ligandanti e mescolare la piastra a mano o utilizzando uno shaker orbitale (20 s a 200 rpm).
    NOTA: Utilizzare iniettori e uno shaker all'interno dello strumento di rilevamento per ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura associate alla rimozione della piastra dal luminometro. Per questo saggio è possibile utilizzare i luminometri standard della panca. Utilizzare un tempo di integrazione di 0,25–2 s.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Utilizzando la procedura qui presentata, sono state monitorate le interazioni tra un prototipo di GPCR e due isoformi di arresto z. Glucagon come il recettore peptide (GLP-1r) sono stati realizzati utilizzando primer contenenti siti di restrizione enzimatica NheI ed EcoRI e clonati nei vettori pBiT1.1-C [TK/LgBiT] e pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mentre, nel caso degli arresti zin, due vettori aggiuntivi sono stati, due vettori aggiuntivi sono stati ha usato pBiT1.1-N [TK/LgBiT] e pBiT2.1-N [TK/SmBiT] utilizzando siti di restrizio...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Utilizzando il metodo qui presentato, le interazioni tra qualsiasi GPCR e .-arrestin1 1/2 possono essere monitorate in sistemi viventi in tempo reale utilizzando questo saggio di complemento strutturale GPCR-arresto-arresto. A questo proposito, siamo stati in grado di osservare il reclutamento differenziale di z-arrestin tra le due isoformi z-arrestin dal GLP-1r (Un prototipo di GPCR di classe B), abbiamo anche osservato una dissociazione del complesso recettore-z-arrestin pochi minuti dopo aver raggiunto il massimo segn...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma di Ricerca (NRF- 2015M3A9E7029172) della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal Ministero della Scienza, iCT e Pianificazione Futura.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Antibiotici: penicillina, streptomicinaWelgeneLS202-02Penicillina/streptomicina
incubatore battericoJEIO TechIB-05GIncubatore (camicia d'aria),
base Terreno di coltura cellulareWelgeneLM 001-05DMEM Terreno di coltura cellulare
Terreno di trasfezione per colture cellulariGibco31985-070Optimem 1X terreno
Incubatore a CO2NUAIRENU5720Incubatore a CO2 a calore diretto
Bagno d'acqua digitaleLab TechLWB-122Dd'acqua digitale da laboratorio tech
Lettura di prova della DNA polimerasiELPIS BiotechEBT-1011Kit
purificazione del DNAdella CMP0112CosmogenetechminiprepLaboPass Kit di purificazione del plasmide Mini
DNA Taq polimerasiEnzimiP750nTaq DNA polimerasi
Restrizione enzimatica BglIINew England BiolabsR0144LBglII
Tampone di restrizione enzimaticaNew England BiolabsB72045CutSmart 10X Tampone
Restrizione enzimatica EcoRINew England BiolabsR3101LEcoRI-HF
Restrizione enzimatica NheINew England BiolabsR01315NheI
Restrizione enzimatica XhoINew England BiolabsR0146LXhoI
Siero fetale bovinoGibco Canada12483020Siero fetale bovino
Gel/PCR DNA MiniKitReal Biotech CorporationKH23108HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
LigasiELPIS BiotechEBT-1025T4 DNA Ligasi
Microscopio otticoOlympusCKX53SFCKX53 Microscopio Reagente
trasfezione lipidicaInvitrogen11668-019Lipofectamine 2000
LuminometroBiotek/Fisher Scientific12504386Synergy 2 Lettori di micropiastre multimodali
Sistema NanoBiT PromegaN2014NanoBiT PPI MCS Sistema iniziale
Substrato nanoluciferasiPromegaN2012Nano-Glo Sistema di analisi di cellule vive
PCR TermociclatoreEppendorf6336000015Master cycler Nexus SX1
Poli-L-lisinaSigma AldrichP4707-50MLSoluzione di poli-L-lisina
Tripsina EDTAGibco25200-056Trysin EDTA 10X
Coltura di cellule bianche Piastre a 96 pozzettiCorning3917Piastra di analisi Piastra a 96 pozzetti
, , , di coltura cellulare Bagno di della DNA di Olympus

Riferimenti

  1. Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  2. Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).
  3. Langmead, C. J., Summers, R. J. Molecular pharmacology of GPCRs. British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).
  4. Lohse, M. J., Hoffmann, C. Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors. Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).
  5. Kang, D. S., et al. Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking. Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).
  6. Park, S. M., et al. Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice. Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).
  7. Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).
  8. Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).
  9. Dixon, A. S. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  10. Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor. Communications Biology. 3, 1-128 (2018).
  11. Promega. Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).
  12. Life Biomedical. HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).
  13. New England BioLabs. Ligation Calculator. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).
  14. Cosmo Genetech. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS= (2019).
  15. Baggio, L. L., Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).
  16. ProMega. NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).
  17. Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences. FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Interazioni GPCR Beta ArrestinaSaggio di Complementazione StrutturaleScoperta di Farmaci per GPCRStudio dell Agonismo ParzialeIsoforme della Beta ArrestinaProtocollo di Costruzione di PlasmidiTecnica di Misurazione della LuminescenzaEsperimenti di Aggiunta di LigandiCurve Dose Risposta

Articoli correlati