Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Sommario

Descriviamo un metodo per la caratterizzazione dei trasportatori a membrana protonica in preparati a vescicolo a membrana prodotti dall'espressione etesologa in E. coli e lisi di cellule che utilizzano una pressa francese.

Abstract

Sono stati sviluppati diversi metodi per caratterizzare funzionalmente nuovi trasportatori a membrana. Le poliamine sono onnipresenti in tutti gli organismi, ma gli scambiatori di poliamina nelle piante non sono stati identificati. Qui, dedichiamo un metodo per caratterizzare gli antiportatori di poliammina utilizzando vesciche di membrana generate dalla lisi delle cellule di Escherichia coli eterologicamente esprimendo un antiportatore vegetale. In primo luogo, abbiamo espresso etelogusly AtBAT1 in un ceppo E. coli carente in poliamina e trasportatori di scambio di arginina. Le vesciche sono state prodotte utilizzando una pressa francese, purificata dall'ultracentrifugazione e utilizzata in un saggio di filtrazione a membrana di substrati etichettati per dimostrare la specificità del substrato del trasportatore. Questi saggi hanno dimostrato che AtBAT1 è un trasportatore mediato da protoni di arginina, acido z-aminobutyrico (GABA), putrescina e spermide. Il ceppo mutante sviluppato per il saggio di AtBAT1 può essere utile per l'analisi funzionale di altre famiglie di scambiatori di poliammina vegetale e animale. Ipotizziamo anche che questo approccio possa essere utilizzato per caratterizzare molti altri tipi di antiportatori, purché queste proteine possano essere espresse nella membrana cellulare batterica. E. coli è un buon sistema per la caratterizzazione di nuovi trasportatori, dal momento che ci sono diversi metodi che possono essere impiegati per mutagenizzare i trasportatori nativi.

Introduzione

Le proteine coinvolte nel traffico di metaboliti costituiscono un livello essenziale di regolazione fisiologica, ma la stragrande maggioranza dei trasportatori di membrana vegetale non è ancora stata caratterizzata funzionalmente. Sono state implementate diverse strategie per caratterizzare nuove proteine da trasporto. Espressione etetologa in organismi modello come E. coli e cellule eucariotiche come lievito, Enopus oocyte, cellule di mammiferi, cellule di insetti e cellule vegetali sono stati tutti utilizzati per determinare la loro attività di trasporto¹. Le cellule eucariotiche sono favorite per l'espressione di proteine e....

Protocollo

1. Generazione dell'E. coli Double Knock Out Mutant con Trasduzione P1

1. Ottenere i ceppi mutanti E. coli a singolo urlo , che sono stati eliminati con il centro di riservagenetica (http://cgsc.biology.yale.edu)e
   NOT: Il ceppo di zPotE è resistente alla kanamycin²⁶ e la deformazione di zCadB è resistente alla tetraciclina²⁷.
2. Costruire la ceppo PotE/CadB doppio knockout (DKO) utilizzando il protocollo di trasduzione P1²⁸.<....

Risultati

I passaggi principali in questo protocollo sono riepilogati in cifritàin Figura 1 . In breve, le cellule E. coli carenti in tutti gli scambiatori di poliammina ed esprimono AtBAT1 sono coltivate, centrifuse, lavate con un tampone e sottoposte a lisi cellulare utilizzando una pressa francese. La lisi tende a produrre vesciche che sono per lo più dentro e fuori e intrappolare il buffer al di fuori delle cellule. I detriti cellulari vengono rim.......

Discussione

Nel presente studio, illustreremo un metodo per la caratterizzazione di un antiportatore esprimendo prima la proteina in E. coli e poi generando vescicle a membrana, in modo che la proteina eterologamente espressa possa essere presentata in un sistema privo di cellule. Oltre alle attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare, questa strategia richiede l'uso di una stampa francese, un ultracentrifuga e l'accesso a una struttura per condurre saggi radioisotopi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M6250
3H-putrescina	PerkinElmer	NET185001MC
3H-spermidina	PerkinElmer	NET522001MC
4-cloro-1-naftolo	Sigma-Aldrich	C8890
14C arginina	Moravek Inc.	MC137
Arginina	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-term)-HRP anticorpo	ThermoFisher	R931-25	Rileva l'etichetta C-terminale di poliistidina (6xHis), richiede il gruppo carbossilico libero per il rilevamento
Arabinosio	Sigma-Aldrich	A3256
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	ThermoFisher	23227	Pierce BCA protein asay corredo.
Blu di bromofenolo	Bio-Rad	161-0404
Carbossipeptidasi B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrifuga	Sorvall		SS-34 rotore ad angolo fisso e rotore ad angolo fisso GA-6
Macinatore di tessuti Dounce	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 omogeneizzatore in pyrex con beccuccio per versare.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	cocktail di scintillazione
EDTA	Sigma-Aldrich
Collettore di filtrazione	Hoefer	FH225V
Cella a pressione francese	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutammato	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Perossido di idrogeno	KROGER
Cloruro di potassio	J.T. Baker	3040-01
Contatore a scintillazione liquida	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Filtri a membrana in nitrocellulosa	Merck Millipore	hawp02500	0.45 &; Kit
di pulizia M PCR	Genscript		QuickClean II
Fosfato di potassio bibasico	ThermoFisher	P290-500
putrescina	fluka	32810
Fosfato di potassio monobasico	J.T.Baker	4008
Spermidina	Sigma-aldrich	S2501
Ceppi: E. coli e Delta; potE740(del)::kan, Δ cadB2231::Tn10	Questo manoscritto	è disponibile su richiesta.	La deformazione è carente negli scambiatori di poliammine PotE e CadB.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultracentrifuga	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT rotore ad angolo fisso
Provette per ultracentrifuga	ThermoFisher	45237	Provette da centrifuga per rotore S150-AT
Vettore: pBAD-DEST49	ThermoFisher		Gateway vettore di espressione per E. coli