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Summary

Descriviamo un metodo per la caratterizzazione dei trasportatori a membrana protonica in preparati a vescicolo a membrana prodotti dall’espressione etesologa in E. coli e lisi di cellule che utilizzano una pressa francese.

Abstract

Sono stati sviluppati diversi metodi per caratterizzare funzionalmente nuovi trasportatori a membrana. Le poliamine sono onnipresenti in tutti gli organismi, ma gli scambiatori di poliamina nelle piante non sono stati identificati. Qui, dedichiamo un metodo per caratterizzare gli antiportatori di poliammina utilizzando vesciche di membrana generate dalla lisi delle cellule di Escherichia coli eterologicamente esprimendo un antiportatore vegetale. In primo luogo, abbiamo espresso etelogusly AtBAT1 in un ceppo E. coli carente in poliamina e trasportatori di scambio di arginina. Le vesciche sono state prodotte utilizzando una pressa francese, purificata dall’ultracentrifugazione e utilizzata in un saggio di filtrazione a membrana di substrati etichettati per dimostrare la specificità del substrato del trasportatore. Questi saggi hanno dimostrato che AtBAT1 è un trasportatore mediato da protoni di arginina, acido z-aminobutyrico (GABA), putrescina e spermide. Il ceppo mutante sviluppato per il saggio di AtBAT1 può essere utile per l’analisi funzionale di altre famiglie di scambiatori di poliammina vegetale e animale. Ipotizziamo anche che questo approccio possa essere utilizzato per caratterizzare molti altri tipi di antiportatori, purché queste proteine possano essere espresse nella membrana cellulare batterica. E. coli è un buon sistema per la caratterizzazione di nuovi trasportatori, dal momento che ci sono diversi metodi che possono essere impiegati per mutagenizzare i trasportatori nativi.

Introduction

Le proteine coinvolte nel traffico di metaboliti costituiscono un livello essenziale di regolazione fisiologica, ma la stragrande maggioranza dei trasportatori di membrana vegetale non è ancora stata caratterizzata funzionalmente. Sono state implementate diverse strategie per caratterizzare nuove proteine da trasporto. Espressione etetologa in organismi modello come E. coli e cellule eucariotiche come lievito, Enopus oocyte, cellule di mammiferi, cellule di insetti e cellule vegetali sono stati tutti utilizzati per determinare la loro attività di trasporto¹. Le cellule eucariotiche sono favorite per l’espressione di proteine eucariotiche, perché la composizione cellulare di base, i percorsi transducivi del segnale, la trascrizione e la traduzione di macchine automatiche sono compatibili con le condizioni native.

Il lievito è stato un importante organismo modello per la caratterizzazione di nuove proteine di trasporto nelle piante. La prima proteina per il trasporto vegetale che è stata espressa con successo nel lievito (Saccharomyces pombe) è stata il trasportatore esososo HUP1 da Chlorella². Da allora, molte proteine del trasporto vegetale sono state caratterizzate funzionalmente utilizzando un sistema di espressione del lievito. Questi includono, trasportatori di zucchero vegetale (SUC1 e SUC2³, VfSUT1 e VfSTP1⁴) e i trasportatori di auxina (AUX1 e PIN⁵). Svantaggi di utilizzare il lievito per esprimere le proteine vegetali possono includere l’attività alterata delle proteine plastidi-localizzate perché il lievito manca di questo organello, mistargeting⁶, e la formazione di aggregati piegati male e l’attivazione delle risposte allo stress nel lievito a causa della sovraespressione delle proteine della membrana^7,8,9.

L’espressione etetologa delle proteine da trasporto negli evociti Xenopus è stata ampiamente utilizzata per la caratterizzazione elettrofisiologica dei trasportatori¹⁰. Le prime proteine del trasporto vegetale caratterizzate dall’espressione eteologa negli ovociti di Xenopus sono state il canale di potassio arabidopsis KAT1¹⁰ e il trasportatore esaso dell’Arabidopsis STP1¹¹. Da allora, gli evociti Xenopus sono stati impiegati per caratterizzare molte proteine del trasporto vegetale come trasportatori di membrana plasmatica¹², trasportatore di saccarosio vacuolare SUT4¹³ e trasportatore vacuolar malate ALMT9¹⁴. Un’importante limitazione degli evociti Xenopus per i saggi di trasporto è che la concentrazione di metaboliti intracellulari non può essere manipolata¹. Inoltre, le conoscenze professionali sono necessarie per preparare gli evociti Xenopus e la variabilità dei lotti di ovociti è difficile da controllare.

L’espressione eterologa nell’organismo modello E. coli è un sistema ideale in termini di caratterizzazione di nuove proteine di trasporto vegetale. Con un genoma completamente sequenziato¹⁵, le caratteristiche molecolari e fisiologiche di E. coli sono ben note. Gli strumenti e le tecniche molecolari sono ben definiti¹⁶. Inoltre, diversi vettori di espressione, ceppi non patogeni e mutanti sono disponibili^17,18,19. Inoltre, E. coli ha un alto tasso di crescita e può essere facilmente coltivato in condizioni di laboratorio. Molte proteine possono essere facilmente espresse e purificate a elevate quantità in E. coli⁹. Quando le proteine non possono essere analisi direttamente nei sistemi cellulari, la ricostituzione delle proteine in liposomi è stata anche un’innovazione di successo, anche se impegnativa, per la caratterizzazione delle proteine della membrana purificate. Caratterizzazione funzionale delle proteine di trasporto mitocondriali vegetali tra cui trasportatori soluti come trasportatori di fosfati in soia, mais, riso e arabidopsis, vettore dicarboxylate-tricarboxylate in Arabidopsis sono stati realizzati utilizzando questo sistema modello^20,21. Tuttavia, le proteine ricombinanti della proteina pomodoro SICAT9 sono risultate non funzionali negli esperimenti di ricostituzione, e altri membri della famiglia dei trasportatori CAT sono stati trovati non funzionali nei saggi di Xenopus oocyte²². Pertanto, sono necessari ulteriori strumenti molecolari per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana.

Cinque sistemi di trasporto della poliammina si trovano in E. coli²³. Essi comprendono due trasportatori ABC che mediano l’assorbimento di spermidina e putrescina, uno scambiatore putrescina/ornitina, uno scambiatore di cadaverina/lisina, un esportatore di spermidine e un importatore di putrescina. Lo scambiatore putrescine PotE è stato originariamente caratterizzato utilizzando un saggio vescino, dove vescicoli all’interno verso l’esterno sono stati preparati da cellule liscicon con una pressa francese e misurando l’assorbimento di putrescina radioetichettata nelle vesciche in cambio di ornina²⁴. I saggi vescicoli sono stati utilizzati anche per caratterizzare un trasportatore di calcio, che mediava il trasporto di calcio in risposta a un gradiente protonico²⁵. Questi esperimenti ci hanno spinto a sviluppare una strategia per la caratterizzazione di altri scambiatori di poliamina. Per prima cosa abbiamo creato un ceppo di Scambiatori Di E. coli carenti in Scambiatori PotE e CadB. Qui, dimostriamo la caratterizzazione funzionale di un antiportatore di poliammina vegetale per espressione eteloga nel ceppo E. coli modificato, generazione di vesciche a membrana utilizzando una pressa francese e saggi radioetichettati.

Protocol

1. Generazione dell’E. coli Double Knock Out Mutant con Trasduzione P1

1. Ottenere i ceppi mutanti E. coli a singolo urlo , che sono stati eliminati con il centro di riservagenetica (http://cgsc.biology.yale.edu)e
   NOT:</ Il ceppo di zPotE è resistente alla kanamycin²⁶ e la deformazione di zCadB è resistente alla tetraciclina²⁷.
2. Costruire la ceppo PotE/CadB doppio knockout (DKO) utilizzando il protocollo di trasduzione P1²⁸.
   1. Preparazione del lisato
      1. Diluire una coltura notturna di zPotE in LB fresco (1:100) integrato con 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂e 0,1-0,2% di glucosio.
      2. Coltivare a 37 gradi centigradi per 1-2 h.
      3. Aggiungete 40 lunisi di fago P1 alla coltura e continuate a crescere a 37 gradi centigradi. Monitorare per 1-3 h fino a quando la coltura ha lised
         NOTA: Quando la coltura è lised, detriti cellulari saranno visibili nel tubo e la coltura avrà una perdita significativa di torbidità.
      4. Aggiungere diverse gocce di cloroformio (50-100 ) al lisa e al vortice. Centrifuga a 12.000 x g per 2 min per rimuovere i detriti cellulari e trasferire il supernatante in un tubo fresco.
   2. Trasduzione del
      1. Crescere con deformazione CadB durante la notte nel mezzo LB.
      2. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 4.000 x g per 2 min e rispendere in 1/5-1/3 il volume di coltura raccolto in LB fresco integrato con 100 mM MgSO₄ e 5 mM CaCl₂.
      3. Aggiungete la sospensione della cella al tubo con il fago dal punto 1.2.1.4 e mescolate rapidamente.
      4. Aggiungete 200 -L di 1 M Na-Citrate (pH5.5), quindi aggiungete 1 mL di LB. Incubare a 37 gradi per 1 h per consentire l’espressione del marcatore resistente agli antibiotici.
      5. Girare le celle a 4000 x g per 5 min.
      6. Risospendere in 100 LB con 100 mM Na-Citrate (pH 5,5) e vortice bene per disperdere le cellule.
      7. Selezionare i ceppi ricombinanti su piastre di agar LB con 50 g/mL di kanamycin e 10 tetraciclina di g/mL, quindi confermare con Polymerase Chain Reaction (PCR) con primer appropriati^26,27.
      8. Verificare i frammenti PCR mediante sequenza.

2. Espressione del gene bersaglio (AtBAT1) in E. coli Mutant

1. Amplificala sequenza completa del gene bersaglio da PCR e inseriscila nel vettore di ingresso gateway pENTR/D-TOPO²⁹.
   NOT:</ In questo caso ATBAT1.1 è stato amplificato utilizzando primer in avanti 5’CGGCGATCAATCCTTGTT e primer inverso 5’GCTAGAGAGTTGGAGGGG, una denaturazione iniziale a 98 gradi centigradi per 2 min e poi 30 cicli di denaturazione a 98 gradi centigradi per 0,1 min, annealanda a 59 gradi centigradi per 0,3 min, estensione a 72 gradi centigradi per 0,40 min e estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 min. Il prodotto PCR è stato purificato utilizzando un kit di pulizia PCR, quantificato utilizzando uno spettrometro. L’inserimento del prodotto PCR nel vettore Gateway è stato effettuato seguendo le indicazioni dei manufactrurers.
   1. Trasforma il vettore di ingresso in competenti cellule Top10 E. coli per scosse di calore e selezionalo per ricombinanti di successo su supporti LB con 50 kanamycin che seguono i protocolli standard di clonazione molecolare³⁰.
   2. Estrarre il DNA del plasmide utilizzando un kit di estrazione plasmide, seguendo le indicazioni del produttore, e la sequenza per confermare il corretto inserimento.
2. Trasferire il gene bersaglio nel vettore di destinazione E. coli, pBAD-DEST49 dal gateway LR clonazione per creare un vettore di espressione²⁹.
   1. Trasforma il vettore di espressione in celle Top10 E. coli competenti per scossa di calore per 30 s e seleziona ricombinanti riusciti su supporti LB con 100 ampicillin a g/mL³⁰.
   2. Estrarre il plasmide DEL DNA³⁰ e la sequenza per confermare il corretto inserimento.
3. Trasformare il vettore di espressione in E. coli -potE740(del)::kan, scadB2231::Tn10 e selezionare su piastre LB con ampicillina, kanamycin e tetraciclina³⁰.
4. Al fine di determinare la concentrazione ottimale di arabinose per l’induzione, esprimere il gene bersaglio sotto il controllo del promotore araBAD nei media LB con concentrazioni di gradiente di arabono come descritto²⁹.
5. Raccogliere i pellet cellulari e valutare l’espressione proteica da SDS-PAGE e la visualizzazione delle bande proteiche come descritto nel manuale del prodotto²⁹.
   NOT:</ L’E. coli -potE740(del)::kan, scadB2231::Tn10 è stato utilizzato come campione di controllo senza espressione BAT1. E.coli doppio knock out cellule mutanti con il vettore vuoto pBAD-DEST49 non è stato utilizzato come un controllo a causa della presenza del gene ccdB nel vettore.

3. Generazione di vescicoli membrana all’interno dell’esterno

1. Coltura le cellule mutanti E. coli che esprimono la proteina bersaglio coltivando una singola colonia durante la notte in 5 mL di supporti senza poliammina (2% glicerolo, 6 g di K₂HPO₄, 3 g di KH₂PO₄, 0,5 g di NaCl, NH₄Cl, 50 mg di tiamina, 0,79 g lievito completo supporto sintetico amisulfato (10 mg/L), L-Arginina (50 mg/L), acido L-aspartico (80 mg/L), L-Histi cloridrato cloridrato di dine (20 mg/L), L-Leucina (100 mg/L), L-Lysine cloridrato (50 mg/L), L-Mesionina (20 mg/L), L-Phenylalanine (50 mg/L), L-Threonine (100 mg/L), L-Tryptophan (50 mg/L), L-Tyrosine (50 mg/L), L-Valine (140 mg/L), Uracil (20 mg/L)). Trasferire questa coltura a 500 mL di media senza poliammina integrati con 0.0002% arabino e crescere fino a quando la coltura cellulare raggiunge un OD₆₀₀ di 0,6-0,8 (di solito 5 h).
2. Raccogliere il pellet cellulare con centricazione a 2.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Risospendere il pellet e lavare tre volte con buffer di fosfato di potassio da 0,1 M, pH 6,6, contenente 10 mM EDTA (Buffer 1). Il volume finale delle celle nel buffer 1 dopo la terza rotazione deve essere 10 mL.
3. Generare vesciche a membrana all’interno e fuori dal trattamento della French Press (10,000 p.s.i.) delle cellule intatte utilizzando una cella a pressione francese da 35 mL.
4. Prima di caricare il campione nella cella di pressione francese standard, lubrificare il pistone e gli anelli O per renderlo più facile da inserire nella cella.
   Nota:Queste istruzioni sono specifiche per l’uso della cella di pressione standard³¹.
   1. Avvitare con attenzione il tappo di chiusura all’estremità inferiore della cella. Assicurarsi che la cella sia a destra verso l’alto in base ai caratteri sul lato della cella. Inserire il pistone nella cella e spostarlo nella cella, fino a quando la linea di riempimento massima sul pistone raggiunge la parte superiore del pistone. Capovolgere l’unità sopra e posizionare sul supporto fornito tra i tre posti.
   2. Versare la sospensione cellulare nel corpo della cella.
      NOT:</ Abbiamo usato solo 10 mL, quindi ci sarà molto spazio nella camera cellulare a pressione francese, che ha una capacità di 35 mL.
   3. Montare la cella di pressione standard sull’unità cellulare a pressione francese.
      1. Verificare innanzitutto che l’alimentazione sia disattivata. Sul lato sinistro del pannello c’è l’interruttore Selettore rapporto. Ha tre posizioni: Giù alla fine della corsa, Basso per l’utilizzo di una cella di pressione più piccola e Alta per l’uso con la cella di pressione francese standard. Se la stampa francese è stata utilizzata in precedenza con la cella più piccola, il pistone potrebbe non essere completamente ritrattato. Impostare questa opzione su Giù.
   4. Accendere la macchina con l’interruttore del RHS sul retro dell’unità e attivare l’interruttore Pause-Run nella posizione Di corsa. Ciò comporterà che il pistone venga completamente ritratto. Riportare l’interruttore su Pausae spegnere la macchina.
   5. Allenta le viti del pollice e sposta il morsetto di sicurezza che si estende su due colonne in acciaio inox di lato. Si snoda a destra. Con una mano che tiene la base del tappo di chiusura in posizione, scegliere la cella di pressione francese con entrambe le mani, e ruotarla di 180 gradi, quindi il pistone è ora in posizione verticale. Impostarlo sulla piattaforma, e spostare il morsetto di sicurezza in posizione in modo che questo morsetto tiene la cella di pressione francese in posizione.
   6. Si noti che l’assieme della valvola di flusso sulla spina di chiusura deve essere accessibile all’azionatore e posizionato in modo che la valvola possa essere ruotata liberamente. Aprire l’assieme della valvola di flusso con alcune curve in senso antiorario. Posizionare le braccia del pistone in modo che siano orientate in una posizione a ore due e otto. Stringere le viti dei pollici in modo che la cella di pressione standard sia tenuta in posizione.
   7. Inserire il tubo di uscita del campione nel tappo di chiusura e collegare un breve pezzo di tubo flessibile in modo che i detriti delle cellule rotte possano essere raccolti in un tubo falco. Di solito usiamo un becher pieno di ghiaccio da 300 mL per tenere il tubo del falco in posizione verticale e per mantenere i detriti cellulari refrigerati.
   8. Assicurarsi che l’opzione Pausa-Esegui sia impostata su Pausae che l’assieme della valvola sia nella posizione aperta. Riaccendere la macchina, adust l’interruttore Selettore rapporto su Alta, e girare la valvola di aumento di pressione sul pannello anteriore a destra circa mezzo giro.
   9. Il pistone inizierà a salire dalla base per passare l’aria in camera. Dirigere l’aria che esce dal tubo Tygon attaccato al tubo di uscita del campione al tubo nel becher.
   10. Quando escono le prime gocce di liquido, chiudere l’assieme della valvola di flusso ruotandolo in senso orario. Questo crea un metallo alla guarnigiorazione metallica, con la cella di pressione, in modo da non stringere eccessivamente.
   11. La parte anteriore della stampa francese ha un grafico sul pannello anteriore per generare la giusta pressione sulle cellule biologiche all’interno della cella di pressione. In questo caso, aumentare la pressione ruotando la valvola di aumento della pressione in senso orario, fino a quando il misuratore raggiunge 640 psi. Questo creerà una pressione interna di 10.000 psi.
   12. Una volta che la cella ha raggiunto la pressione di destinazione aprire leggermente l’assieme valvola di flusso ruotandolo in senso antiorario. Regolare l’apertura della valvola per consentire una portata di sole 10 gocce al min.
   13. Quando la linea di arresto sul corpo del pistone raggiunge la parte superiore della cella di flusso. Impostare l’opzione Pausa-Corsa su Pausa. Questo è fondamentale perché avere il pistone inserito più lontano nella cella danneggerà l’unità. Aprire l’assieme della valvola di flusso e raccogliere le gocce rimanenti.
   14. Impostare l’opzione Cambia Selettore rapporto su Giù, quindi impostare l’opzione Pausa esecuzione su Esegui. Quando la piastra inferiore è completamente ritratta, impostare l’interruttore Esegui su Pausae spegnere la macchina.
   15. Rimuovere la cella di pressione francese dalla pressa francese e smontare per la pulizia. Conservare tutte le parti a secco con un leggero rivestimento di glicerolo. Rimuovere e sostituire eventuali guarnizioni o guarnizioni con segni di usura.
5. Rimuovere le cellule ininterrotte e i detriti cellulari della stampa francese eluente con la centrifugazione a 10.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi. Scartare il pellet e trasferire il supernatante ai tubi di ultracentrifuga.
6. Le vesciche della membrana di pellet dal soldante risultante da ultracentrifugation a 150.000 g per 1 h a 4 gradi centigradi.
7. Lavare le vesciche a membrana una volta, senza resuspension, in 1 mM Tris-maleate, pH 5.2 contenente 0,14 M KCl, 2 mM 2-mercaptoetanolo e 10% glicerolo e resodare nello stesso buffer (Buffer 2)²³ utilizzando un grinder di tessuto Dounce. Tipicamente la frazione di membrana da 500 mL di coltura sarebbe sospesa in 5 mL di tampone, e una concentrazione di 5-10 mg di proteina/mL della membrana utilizzando il saggio di acido biochinico³².
8. In tubi di microcentrifuga da 1,5 ml di spazio, conservare 100 aliquote di preparazione della membrana a -80 gradi centigradi.

4. Western Blot e orientamento del Trasporto di Saggio

1. Lavare e risospendere le vesciche del passaggio 3.7 in 30 mM Tris pH 7.8 – 0,1 mM CoCl₂.
2. Aggiungere i campioni di 100 l, aggiungere 1 L di 2 mg/mL carboxypeptidase A in 0,1 M NaCl, 30 mM Tris, 0,2 mM CoCl₂ pH 7,8.
3. Intenere per 20 min a 20 gradi centigradi. Interrompere la digestione aggiungendo 5 , 5 M NaEDTA, 0,5 M 2-mercaptoetanolo pH 7,5.
4. Per disattivare completamente l’enzima, incubare la soluzione per 1 h a temperatura ambiente.
   NOT:</ Vescicolas senza il catboxypeptidase A trattamento sono stati utilizzati come un controllo.
5. Analizzare i campioni per elettroforesi in presenza di solfato di dodecyl al litio. Aggiungere 5-10 luna di 150 mg/mL di solfato di litio dodecyl, 450 mg/mL glicerolo, 0,1 mg/mL di blu bromofenolo, 0,4 M Tris pH 7,5 a 100 – L di campione.
6. Eseguire l’immunoblomentazione posando un filtro di nitrocellulosa inumidito con 25 mM di sodio-idrogeno fosfato pH 7.5 sul gel di poliacrilammide. Posizionarli tra due filtri di cellulosa inumidita e infine tra due cuscinetti di plastica inumiditi. Posizionare questo assemblaggio tra gli elettrodi di una camera contenente 25 mM di sodio-idrogeno fosfato pH 7,5 a 2-4 gradi centigradi.
7. Consentire all’elettrotrasferimento delle proteine di procedere per 3 h a 20 V e 2-3 A.
8. Bloccare la membrana di nitrocellulosa durante la notte a 2 gradi centigradi in un buffer di blocco di 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 e 0,5 mg/mL Tween 20³³.
9. Incubare il filtro di nitrocellulosa per 2 h con una diluizione di 1:5000 anti-glian (terminale C)-HRP nel buffer di bloccante (20 mL) e lavare due volte con 50 mL di tampone per un totale di 60 min.
10. Per visualizzare l’immunoblot, sciogliere 6 mg di 4-cloro-1-naftolo in 20 mL di alcol denaturato e aggiungere 80 mL di 15 mM Tris pH 7,5 e 50 -L del 30% H₂O₂. Bagnare la carta da filtro nella soluzione di substrato per 20 min. Il reagente reagirà con l’anticorpo per formare un precipitato blu sulla membrana di nitrocellulosa. Quando si è sviluppato un colore sufficiente, sciacquare la membrana con acqua e lasciare asciugare.

5. Saggio dei trasporti

1. Incubare 100 aliquote di vescicle di membrana a 12 gradi centigradi per 5 min.
2. Avviare il trasporto aggiungendo poliamine radioetichettate alle vesciche della membrana ad una concentrazione finale di 50 M (se non diversamente specificato). Fare ³soluzioni H-substrate (spermide o putrescine) in un buffer di aspirato costituito da 10 mM Tris-HCl, 10 mM fosfato di potassio, pH 8.0 e 0.14 M KCl²³ (Buffer 3) con modifiche a seconda del saggio.
3. Condurre i saggi di trasporto per 1 min a 12 s in tubi di microfuge da 1,5 ml.
4. Dopo 1 min, trasferire le miscele di reazione al collettore filtrazione e filtrare attraverso un filtro a membrana di nitrocellulosa 0,45 m.
   1. Aggiungere 3 mL di buffer di assaggio ghiacciato contenente una concentrazione superiore di 10 volte di poliammine senza etichetta seguita da 3 mL di tampone di analisi senza i poliamine per ridurre l’attacco non specifico.
   2. Trasferire i filtri lavati a 20 mL di scintillio usa e getta contenenti 10 mL di liquido scintillio e determinare la radioattività utilizzando un contatore di scintillazione liquida. Il contatore di scintillazione misura la radioattività nel campione e la segnala come disintegrazione per min (dpm).
5. Calcolare l’assorbimento netto della poliamina come differenza tra l’assorbimento a 1 min da vescicoli incubati a 12 gradi centigradi e l’assorbimento a 0 min da vescicoli incubati sul ghiaccio.
   NOT:</ La massa del substrato importata nelle vesciche viene calcolata come segue. Se il volume del campione nel tubo di microfuge è di 0,2 l e la concentrazione iniziale del substrato è di 100 M, la massa totale del substrato nel tubo di microfuge è 20 x 10^-12 M. A causa dell’altissima attività specifica dei substrati etichettati commercialmente (spesso 2,22 x 10⁹ dpm/mM) la massa dell’isotopo aggiunto può essere ignorata nel calcolo. Quindi, se la quantità totale di isotopo che è stato aggiunto al tubo di microfuge era 100 x 10⁶ dpm e le vesciche avevano un assorbimento netto di 1.000 dpm, allora la massa totale di substrato assorbita dalle vescicoli era l’1% del numero totale di talpe di substrato o 2 x 10^-13 M.
   1. Determinare K_m per il substrato misurando l’assorbimento di 10, 25, 50, 250 e 500 m di substrato radioetichettato in vescicoli che esprimono la proteina bersaglio. Calcolare la cinetica Michaelis-Menten utilizzando un metodo di regressione non lineare utilizzando il modello Michaelis Menton del pacchetto software statistico³⁴.
6. Per gli esperimenti di competizione, aggiungere il substrato agonistico non etichettato di 100 ml, 500 m, 1 mM, 1,5 mM o 2 mM nel buffer di analisi, al tubo di microcentrifuga da 1,5 mL contenente 100 l’l di vesciccoli a 12 m.
   1. Aggiungere contemporaneamente la poliammina radioetichettata (50 m) al tubo di microcentrifuga.
   2. Misurare la radioattività intrappolata all’interno delle vesciche come accennato in precedenza ripetendo i passaggi da 5 a 5.4.2.
   3. Determinare l’apparente K_m (K_m,app) per i substrati competitivi misurando l’assorbimento di 10, 25, 50, 250 e 500 m di poliammina radioetichettata in presenza di 100 sottostrato non etichettato m o superiore e utilizzando un metodo di regressione non lineare per tracciare la curva.

Representative Results

Discussion

Nel presente studio, illustreremo un metodo per la caratterizzazione di un antiportatore esprimendo prima la proteina in E. coli e poi generando vescicle a membrana, in modo che la proteina eterologamente espressa possa essere presentata in un sistema privo di cellule. Oltre alle attrezzature presenti nella maggior parte dei laboratori di biologia molecolare, questa strategia richiede l’uso di una stampa francese, un ultracentrifuga e l’accesso a una struttura per condurre saggi radioisotopi.

Un requisito fondamentale di questa tecnica è che la proteina eterologa sia correttamente mirata alla membrana plasmatica di E. coli. Questa strategia può anche essere utile per l’analisi funzionale dei trasportatori di organitari poiché il trasportatore di glucosio ADP plastid è stato localizzato con successo nella membrana cellulare E. coli e funzionalmente caratterizzato³⁵. Il vettore (pBAD-DEST49) utilizzato in questi esperimenti contiene una proteina di tioredossina N-terminale per aumentare la solubilità del prodotto tradotto. Sono state trovate fusioni a N terminali di una piccola proteina B. subtilus, che consentono un targeting più efficiente dei trasportatori a membrana alla membrana citoplasmatica³⁶. Tuttavia, gli eventi di piegatura errata e il fallimento delle proteine per essere correttamente integrati nella membrana citoplasmatica sono potenziali problemi che impediscono l’uso di sistemi di espressione batterica per molti tipi di trasportatori¹.

Vesciche membrana sono stati utilizzati anche per caratterizzare i trasportatori di piante^37,38. Poiché le vesciche non hanno le fonti energetiche essenziali come ATP ed enzimi, l’interferenza dei trasportatori attivi e di altre attività metaboliche è minima. Pertanto, questo sistema è ideale per l’analisi di traslocazioni passive come gli scambiatori di metaboliti. Le vesciche della membrana everse, in particolare, possono essere applicate alla caratterizzazione di esportatori e antiportatori poiché la composizione della soluzione interna può essere manipolata modificando la composizione del tampone 1. Inoltre, l’utilizzo della stampa francese o della sonicazione a ultrasuoni è abbastanza efficiente nel generare vesciboli della membrana dentro e fuori da cellule E. coli intatte. 95% delle vesciche generate dalla sonicazione a ultrasuoni o stampa francese hanno eversi membrane^39,40. PotE, l’antiportatore E. coli di putrescina e ornithina, è stato il primo antiportatore di poliamina che è stato caratterizzato utilizzando vescicle di membrana dentro-fuori²³. Abbiamo usato la trasduzione P1 per creare un ceppo mutante specifico per la caratterizzazione di un antiportatore di poliamina, e questo ceppo può essere utile per la caratterizzazione di altri scambiatori di poliamina animale, fungino o vegetale. Immaginiamo anche che altri ceppi di E. coli con due o più delezioni geniche potrebbero essere utili per la caratterizzazione di altri trasportatori di scambio di piante e animali utilizzando vesciche di membrana.

Il passo più critico in questo protocollo è l’espressione della proteina nel sistema mutante E. coli. Un vettore di espressione E. coli con un promotore inducibile viene utilizzato per promuovere una regolazione stretta e dipendente dalla dose dell’espressione genica eterologa. La presenza di tag terminali N e terminali C come His-patch Thioredoxin, V5 epitopo o 6xHis nel vettore è utile per il rilevamento e la purificazione della proteina. Inoltre, la presenza di una proteina di fusione di tioredossina che è un componente del vettore pBAD49, può aumentare l’efficienza di traduzione e, in alcuni casi, la solubilità delle proteine eucariotiche espresse in E. coli⁴¹. Le diverse scelte di codone nell’Arabidopsis e nell’E. coli potrebbero sfidare l’espressione proteica in E. coli. È noto che l’ottimizzazione del codone può aumentare in modo impressionante l’espressione delle proteine eterozie in E. coli⁴². Nell’analisi vescicante, il codone ottimizzato AtBAT1.2 ha mostrato un’attività di scambio più elevata rispetto a AtBAT1.1 ottimizzata non-codon nelle cellule E. coli (dati non mostrati), dimostrando che l’ottimizzazione del codone è stata utile per migliorare l’espressione e la funzione delle proteine espresse eterolologamente nelle cellule batteriche. La produzione di vesciche a membrana mediante un’attenta regolazione della valvola per mantenere una goccia lenta e uniforme delle cellule lised è anche un passo fondamentale nella procedura. Dopo l’ultracentrifuga, abbiamo scoperto che la sospensione delle vesciche della membrana in un omogeneizzatore Dounce riduce al minimo la variazione del campione per campionare la variazione tra le variazioni delle vesciche della membrana che vengono preparate e successivamente conservate a -80 gradi centigradi.

Una limitazione dei sistemi di espressione E. coli è che non sono in grado di apportare modifiche post-traduzionali come N-glicosilation o acetilazione. L’assenza di queste modifiche proteiche potrebbe avere un impatto sull’attività proteica¹. Tuttavia, sono stati identificati mutanti in grado di eseguire queste modifiche e possono essere utilizzati come strumento per esprimere proteine che richiedono tali modifiche⁴³. La generazione di quantità sufficienti di proteine espresse potrebbe essere una sfida a causa dello sviluppo e dell’aggregazione come corpi di inclusione, del fallimento della proteina per essere correttamente integrata nella membrana citoplasmica, del mistargeting e della cattiva regolazione a causa della mancanza di modifiche post-traduzionali.

Una piccola limitazione di questa tecnica è che non fornisce prove per l’orientamento naturale del trasportatore. Questo può essere fatto sfruttando i tag terminali N o C e i metodi immunologici. L’accessibilità di un particolare capolinea della proteina nelle vesciche può essere ottenuta con la digestione di tutti i termini accessibili, e quindi presumibilmente esterni del vettore, l’elettroforesi della proteina in presenza di solfato di dodecyl di sodio, il trasferimento ai filtri di nitrocellulosa e il rilevamento dei restanti termini interni con anticorpi⁴⁰.

Materials

2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
<sup>3</sup>H-putrescine	PerkinElmer	NET185001MC
<sup>3</sup>H-spermidine	PerkinElmer	NET522001MC
4-chloro-1-naphthol	Sigma-Aldrich	C8890
<sup>14</sup>C arginine	Moravek Inc.	MC137
Arginine	Sigma-Aldrich	A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody	ThermoFisher	R931-25	Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl<br/> group for detection
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
BCA protein assay kit	ThermoFisher	23227	Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue	Bio-Rad	161-0404
Carboxypeptidase B	Sigma-Aldrich	C9584-1mg
Centrifuge	Sorvall		SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder	LabGenome	7777-7	Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H	National Diagnostics	LS275	scintillation cocktail
EDTA	Sigma-Aldrich
Filtration manifold	Hoefer	FH225V
French Pressure Cell	Glen Mills	FA-080A120
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Glutamate	Sigma-Aldrich	G6904
Glycerol
GraphPad Prism software			<a href="http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm" target="_blank">http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm</a>
Hydrogen peroxide	KROGER
Potassium Chloride	J.T. Baker	3040-01
Liquid scintillation counter	Beckman	LS-6500
Maleate	Sigma-Aldrich	M0375
Nanodrop	ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters	Merck Millipore	hawp02500	0.45 &micro;M
PCR clean up kit	Genscript		QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic	ThermoFisher	P290-500
putrescine	fluka	32810
Potassium Phosphate monobasic	J.T.Baker	4008
Spermidine	Sigma-aldrich	S2501
Strains :E. coli &Delta;potE740(del)::kan, &Delta;cadB2231::Tn10	This manuscript	Available upon request.	Strain is deficient in the <em>PotE</em> and <em>CadB</em> polyamine exchangers.
Tris-base	Research Products	T60040-1000
Ultracentrifuge	Sorvall MTX 150	46960	Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes	ThermoFisher	45237	Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49	ThermoFisher		Gateway expression vector for <em>E. coli</em>