Summary
הטיות סלקטיבית של חומצת הסימפונות לריאה השמאלית בעכברים גורמת לפגיעה בריאה חד צדדית ועצמית מוגבלת, אשר מודלים תסמונת מצוקה נשימתית חריפה של האדם (ברווזים) הנגרמת על ידי שאיפה חומצת קיבה.
Abstract
ברונכיט סלקטיבית של חומצה הידרוכלורית (HCl) לברופון שמאל מורלין גורם לפגיעה ברקמה חריפה עם ממצאים יסטופתולוגיות דומה לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה של האדם (ברווזים). בצקת מכתשיים, מכתשי-נימי-מחסום, וחדירת לוקיציט משפיעות בעיקר על הריאה השמאלית, ושומרת על הריאה הימנית כשליטה בלתי נפגעת ומאפשרת לבעלי חיים לשרוד. מודל זה של פגיעה עצמית מוגבלת בריאות חריפה מאפשר חקירה של מנגנוני רזולוציית רקמות, כגון מקרופאג efferocytosis של נויטרופילים האפוטוטיים ופיצוי של מכתשי-נימי שלמות המחסום. מודל זה עזר לזהות תפקידים חשובים עבור אגוניסטים ברזולוציה, כולל מתווכים מיוחדים בפתרון מקצועי (SPMs), מתן בסיס לפיתוח גישות טיפוליות חדשות עבור חולים עם ברווזים.
Introduction
תסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ברווזים) היא גורם חשוב לכשל נשימתי חריף1. זוהי מחלה נפוצה, קטלני או השבתת המתרחשת ב 10% של כל החולים הודה יחידות טיפול נמרץ ברחבי העולם2. על פי הגדרת ברלין3, ברווזים מוגדר על ידי התפרצות חריפה של כשל נשימתי ההיפוקסימית (< 1 שבוע) ומחלחל ריאתי דו צדדי על צילומי חזה שאינם מוסברים על ידי אי ספיקת לב4. הפתיולוגיה המשמשת כבסיס מתאפיינת בתגובה דלקתית מוגזמת. ניתן לפצוע את הריאה ישירות, כגון דלקת ריאות או השאיפה לחומצת קיבה, או בעקיפין, כגון אלח דם או לאחר עירויי דמים מרובים4. בעקבות העלבון הראשוני, מתקדמת הפתוגנזה בשלושה שלבים: שלבים מתרבים, מפיצים ושלבי הפיברוטיק1. שלבים אלה מאופיינים מנגנונים מולקולריים וסלולריים נפרדים ומנגנוני תיקון הקובעים את הפרוגנוזה של חולי ברווזים. טיפול תומך נשאר התומך התווך של חולים ברווזים; כיום, אין טיפולים תרופתי יעילים עבור ברווזים, אז יש צורך דחוף מחקר חדש על המצב הזה הרסני4.
דיסרגולציה של התגובה החיסונית מולדת במהלך השלב האקסוטיבי תורמת לתחילתה החריפה של כמויות וכישלון נשימתי משויך1. עוצמה pro-דלקתיות מגשר איתות התזמולי התגובות החיסונית הראשונית, המוביל לשיבוש של מחסום מכתשי-נימי, לפזר בצקת מכתשי, ו נויטרופילים הסתננות לאתר של פציעה רקמת ריאה4. בתוך מניות, אותות בלימה יעיל עבור דלקת חריפה להיפטר מכישלון ריאות והוא יכול לעכב catabasis בזמן של רקמת הריאה הפצועה5. למטרה זו, חקירה מראש בניסויים קליניים בייזום ומנגנוני ברזולוציה pro של ברווזים עלול לחשוף אסטרטגיות טיפוליות הרומן. חקירה זו מחייבת מוגבלות עצמית במודלים vivo של פגיעה בריאה חריפה, הדומה לתכונות של בעלי החיים האנושיים, ומאפשר חקירה של מנגנונים המשמשים את שלבי החניכה והפענוח של פציעת רקמות.
מודל murine הציג כאן מייצרת פגיעה ישירה בריאות חריפה אשר ממחיש את התהליכים הפתוביולוגי הקרדינל של ברווזים, כלומר מכתשי-נימי מחסום הסתננות ו נויטרופילים. השיטה מסתמכת על ברונכיט סלקטיבית בסימפונות של HCl באמצעות צינורית של הסמפון השמאלי של הגבעול, לוקליזציה את הפציעה ואת התגובה הדלקתית לריאה השמאלית; הריאה הימנית הבלתי נפגעת יכולה לשמש כשליטה פנימית לדטרמינציות בחירה של פגיעה ברקמה ודלקת. בנוסף, פגיעה בריאה חד-צדדית היא לא קטלנית וחושפת תוכנית פתרון. זה מציע חלון נפרד לתוך הרזולוציה של דלקת ריאות כי יכול להיות ממונפת לזיהוי של המגשרים הפרו-פתרון מתווכים ומנגנונים סלולריים לפתוח שדרות טיפוליות חדשות עבור ברווזים המדגיש את הפיזיולוגיה ברזולוציה ו פרמקולוגיה.
Protocol
כל ההליכים בעלי החיים להלן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש בבית החולים לנשים (פרוטוקול #2016N000356).
הערה: הטכניקה הסטרילית הייתה בעקבותיו. עבור כל נוהלי ההישרדות שדה סטרילי הוקם עבור כל ניתוח באמצעות מגבת מנוקה וסטרילי, בעוד מנתחים לבשו כפפות כירורגי סטרילי, כובעים, מסכות, ומעילים נקיים מעבדה. כל כלי הניתוח היו מעוקרים באמצעות החיטוי, ואת העקרות נשמר באמצעות חרוז מחוטא.
1. הכנת 0.1 N HCl
- הוסף 11 מ ל של ddH2O לבקבוק זכוכית ענבר. לאט להוסיף 1 מ ל של 37% HCl (12 N) כדי ליצור 1 N HCl מלאי עבודה.
זהירות: ודא HCl נוסף לתוך המים. זוהי דאגה בטיחות כי הוספת מים ישירות חומצה יכול לגרום חומצה לרתיחה להתיז מתוך הבקבוק. כאשר הטיפול HCl מרוכז, לוודא את החומצה נשמר במכסה כימי של פרקו ואת ציוד המגן האישי המתאים הוא שחוק, כולל חלוק מעבדה, כפפות, ומשקפיים בטיחות. - לאט להוסיף 4 מ ל של מלאי מדולל בעבר HCl לתוך 35 mL של ddH2O ב-50 ml שפופרת חרוט ליצור 0.1 N HCl מלאי ניסיוני.
- למדוד את ה-pH של המניה ניסיוני באמצעות בדיקה pH אלקטרונית לאחר כיול שתי נקודות באמצעות פתרונות pH נמוך. Titrate ל- pH 1.1 באמצעות מניות Naoh או HCl פתרונות לפי הצורך, כך אמצעי האחסון הסופי הוא 40 mL.
הערה: מדידת ערכי ה-pH הנמוכים עלולה להיות קשה. כדי להבטיח מדידה מדויקת, ודא כי הבדיקה pH הוא מכויל כראוי באמצעות סטנדרטים pH נמוך כדי למנוע אומדן מעל של המדידה. - מיד לפני הניסוי, לסנן 1 – 2 מ ל של המניה הניסיונית HCl באמצעות מסנן סטרילי 0.22 יקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
2. סלקטיבי בסימפונות של הHCl
-
הכנת האזור הכירורגי
- לגרום הרדמה כללית על ידי אספקת קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) תערובת על ידי הזרקת הצפק. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על-ידי סחיטה עדינה של קצה הזנב או הרגל האחוריות. העדר תגובת גמילה נדרש לפני ביצוע חתך העור. אם יש צורך בבולבי הרדמה נוספים.
- לספק 0.1 mg/ק"ג של בופרנורפין תת-עורי תחת העורף של הצוואר. כאבים לפני הניתוח יחזק את ההשפעה של ההרדמה ויהיה שפר לפני ואחרי הניתוח כאב הנובע מההליך.
- השימוש קוצץ חשמלי כדי לגלח בעדינות את האזור כירורגי על המשטח הגחוני של העכבר, מתחת לסנטר באזור הצוואר הצווארי של הגרון, באמצעות משיכות איטית כלפי מטה. להסיר פרווה רופף כדי לחשוף באופן מלא את העור הבסיסי.
- להכין את האזור כירורגי ידי שאיפה את האתר מגולח עם 10% povidone-פתרון יוד. לאחר החלת הפתרון אספטי, לנקות את האתר באמצעות שימוש בספוגית אלכוהול איזופרופילי 70%. חזור על שלב 3 x.
-
בידוד קנה הנשימה
- מניחים את העכבר במצב פרקדן על לוח כירורגי נקי לכסות את העכבר בתוך כירורגית סטרילי ולשמור על חשיפה של האזור כירורגי. . אבטחו את המקום
- לעשות חיתוך האורך 0.5 ס מ בעור מעל קנה הנשימה ואת בלוטות הרוק. השתמש מלקחיים משונן מעט מעוקל כדי למשוך בזהירות את העור ולהפריד בעדינות את בלוטות הרוק כדי לחשוף את השרירים הקנה.
- באמצעות מלקחיים משונן לניתוח קהה, בעדינות לדחוף את השרירים paratracheal ולהקניט את הfascia כי הוא מסביב לקנה הנשימה עד טבעות הסחוס של קנה הנשימה חשופים לחלוטין.
- השתמש מלקחיים משונן מלאה מעוקל להרים את קנה הנשימה ולהפריד את רקמת החיבור בין קנה הנשימה הרטרו לבין רטרו-fascia. לאחר רקמת החיבור מנותקת, קצה המלקחיים צריך להחליק לחלוטין מאחורי קנה הנשימה.
- לשמור על מלקחיים מעוקל מאחורי קנה הנשימה ולתפוס 10 – 15 ס"מ פיסת 4-0 משי תפר קלוע עם קצות מלקחיים. משוך את התפר מאחורי קנה הנשימה כך שיהיה אורך אפילו משני צדדיו.
- ברגע שתפר נמצא במקומו, משוך בעדינות את צדי התפר לכיוון האחורי של העכבר והחזק את הצדדים במקומם.
-
באופן סלקטיבי ברונולאת הגזע השמאלי ברונזה והחדרת הHCl
- קח a 24 G x 3/4 "אנגיוצנתר והכנס את המחט, משופע למעלה, לתוך האזור הקדמי של קנה הנשימה בין טבעות הקנה הראשון והשני. לאחר ההכנסה הנכונה מאושר על ידי ויזואליזציה ישירה של קצה המחט בתוך לומן הקנה, לשחרר את התפר ולקדם את הצינורית מעל המחט לתוך קנה הנשימה עד ההתנגדות הוא הגיע, ואז לסגת את המחט. להטות את כיוון הכניסה לכיוון מחסום הגבעול השמאלי הראשי לצורך בניה סלקטיבית בריאה השמאלית.
- לאחר הצינורית היא במקום, לתפוס בחוזקה את יציאת ההזרקה כדי למנוע את הקטטר מן הסטה.
- באמצעות P200 P200 מעוקר וסטרילי טיפים, להחדיר 2.5 mL/ק ג (50 μL for 20 עכבר) של סטרילי מסוננים 0.1 N HCl לתוך הצנתר, ואחריו נפח זהה של האוויר.
- במהירות למשוך את הצנתר ולהרים את הלוח הכירורגי לזווית 60 ° עבור 30 s.
-
סגירת האזור הכירורגי
- הנח את הלוח הכירורגי והוצא. את התפר מאחורי קנה הנשימה
- השתמש 4-0 שעווה מצופה משי קלוע תפר לסגור את חתך העור באמצעות 2 – 3 תפרים.
3. טיפול שלאחר הניתוח
- לאחר החתך סגור, מניחים את העכבר בצד שמאל על משטח חימום חם עד העכבר מתאושש מן ההרדמה. בגין הפיקוח על העכבר על הכאב ורמת הפעילות לפני החזרתם אותו לדיור נורמלי.
הערה: בופראורפין צריך להיות מנוהל ב 0.1 מ"ג/ק"ג תת-עורי כל 6-12 h עבור הראשון 24 ה. אם כאב פריצת דרך מתמשך הוא נוכח, להאריך את משטר כאבים עד הכאב הצדדים.
4. ריאה מלאה ברונשיים ששטיפה (BAL) ו לוקיציט הקלדה
-
המתת חסד העכבר על ידי ניהול 3x את המינון של קטמין/xylazine בשימוש שלב 2.1.1.
- כדי להבדיל בין ביניים intravascular נויטרופילים, להזריק באופן מידי fluorophore שנבחרו התווית Ly6G נוגדן 5 דקות לפני המתת החסד. תווית זו צריכה להיות מתאימה לאיתור על-ידי cy, לנסות להבחין intravascular נויטרופילים מתוך ביניים של ריאה מכתשי נויטרופילים, אשר יהיה מתויג במהלך הכנת רקמות עם fluorophore שונים (ראה להלן).
- מניחים את העכבר על לוח כירורגי לחבר את החותכות הקדמי סביב לולאה של 2-0 משי תפר קלוע.
- בצע את השלבים 2.2.2 – 2.2.6. להכין את קנה הנשימה לצינורית.
הערה: ודאו שהסרעפת אינה נוקבת כדי למקסם את הלחץ מנפח טרנס-מכתשי בזמן ששטיפה הריאה; שמאל תאימות הריאה יורדת לאחר הפציעה, אשר עשוי לדרוש הלחץ הטרנס מכתשי גבוה הדרישה לשטיפה ריאות. - צינורית קנה הנשימה הבא בשלב 2.3.1, אבל לא לקדם את הקטטר מתחת לקרינה; להכניס את הצנתר במקביל לקנה הנשימה.
- עם הקטטר מוכנס, לקשור את תפר סביב קנה הנשימה כדי להחזיק את הקטטר במקום.
- להחדיר ולמשוך שני ברציפות 1 mL מתחת לקרח קר-/-(ללא מגנזיום או סידן) עם 0.6 mM EDTA באמצעות מזרק 1 cc. עבור immunophenotyping קלדה על ידי הזרמת cy, להסיר כל סדרת מחלקים ו לחזור 5 מ"ל פוליסטירן מוקצף הצינור על הקרח.
- על מנת להבטיח המתת חסד, בצע ניקור מותני באמצעות מספריים כירורגיים ואחריו ניקוב לב. ניתן לקצור את הריאות לצורך עיבוד נוסף.
- צנטריפוגה את BAL עבור 10 דקות ב 800 g ב 4 ° צ' כדי לצנפה את התאים.
- Decant סופרנטאנט לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL ו סדרת מחלקים לתוך 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות. חנות at-80 ° c עבור הניתוח הבא.
- השהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-PBS-/-עם 2% FBS עבור ניתוח דיפרנציאלי לוקיציט על ידי הזרמת cy, try.
- כדי להבדיל בין ביניים intravascular נויטרופילים, להסיר את הריאה השמאלית והימנית בנפרד ולעבד את הריאות לזרימה cy, לנסות כמו בתוך עבדול ואח '. 20146.
- כתם ההשעיה התא שנוצר באמצעות נוגדנים FACS שנבחרו, וודא כתם עבור Ly6G כי הוא מצועם עם fluorophore שונים מאשר הנוגדן Ly6G משלב 4.1.1.
5. הערכה של חדירות המכשול באמצעות צבען כחול של אוון (EBD)
- הכנס באופן פנימי את הצבע הכחול של אוון (40 מ"ג/ק"ג) 30 דקות לפני המתת חסד.
- המתת החסד העכבר באמצעות מנת יתר קטמין/xylazine (שלב 4.1).
- כדי למדוד מכתשיים שלמות המכשול, בצע את שלבים 4.2 – 4.9 עבור אוסף BAL.
- העבר 100 μL של BALF לתחתית ברורה 96-ובכן microplate, יחד עם 100 μL של תקני EBD כפולים. השתמש ב-PBS-כריק.
- השתמש בקורא מיקרופלייט כדי למדוד את ספיגת הבאלף ב620 nm ו740 ננומטר. השתמש בספיגה ב 740 ננומטר כדי לתקן את הזיהום מוגלובין בדגימות7.
- כדי למדוד את שלמות המחסום כלי הדם, מבשם הריאות על ידי הזרקת באיטיות 5 מ ל של הקרח קר PBS-/-דרך החדר הימני של הלב. . הסירו את הריאה השמאלית
- יבש את הריאה השמאלית עבור 72 h ב 58 ° צ' כדי להסיר את המים העודפים.
- לעבד את רקמת הריאה מיובש כמו ראדו ו Chernoff 20138, ולמדוד את ספיגת ב 620 nm ו 740 nm.
6. ריאה היסטולוגיה
- צינורית קנה הנשימה באמצעות צעדים 4.1 – 4.5.
- כדי הלחץ לתקן את הריאות ב 20 ס"מ H2O, השתמש במעמד טבעת ומלחציים כדי להעלות מזרק 60 mL מצויד אבובים שסתומים מבוקר ומילא פתרון בחירה קבע (למשל, קבע אבץ) כך מניסקוס הפתרון הקבע הוא 20 ס מ מעל ה ריאות.
- לחבר את אבובים לצנתר ולפתוח את הערך. ממלאים לאט את הריאות בתיקונים עד שהם מפסיקים לנפח.
- להסיר את הצנתר 3/4 של הדרך מתוך קנה הנשימה. לקשור את קנה הנשימה עם תפר לפני באופן מלא הסרת קטטר כדי למזער את אובדן של הfixative.
- . הסר את הריאות והלב בלוק
הערה: ודא כי הריאות לא מנוקב במהלך ההסרה כדי לשמור על הלחץ החדרת הספק. - תקן את הריאות עבור 24 שעות ב 25 מ ל של התיקון בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הריאות קבוע עבור רציפים 20 דקות מרווחי PBS-/-, 30% אתנול, ו 50% אתנול.
- לאחר השטיפה האחרונה, לאחסן את הריאות ב 70% אתנול עבור עיבוד היסטולוגיה כמו ב Eאיקרוס et al. 20139.
Representative Results
התוצאה הסלקטיבית של הסימפונות. גורמת לפציעה בריאה חריפה
השיטה של שיטת ברונכיט בלתי סלקטיבית של HCl לתוך הסמפון של הגזע השמאלי מומחש באיור 1A. פציעת הריאה החריפה כרוכה בריאה השמאלית כולה, ובעקבות המשך העירוי של EBD ומיזוג הריאה, ה-EBD נשארה רק בריאה השמאלית (איור 1B). בדיקת EBD בריאה השמאלית הייתה כמותית ונמצאה מוגברת באופן משמעותי יחסית לחוסר החלטיות בררני (איור 1C; מותאם מתוך עבדול ואח '. 20146). בתגובה לפגיעה בריאה, המחזור הלוקוציטים מתאים לרקמה הדלקתית. במודל זה, כלי דם נויטרופילים עוברים הגירה טראנס-אנדותל אל הריאה הפצועה interstitium. נויטרופילים ביניים המצטבר בריאה השמאלית 24 שעות לאחר HCl, בניגוד לריאה הימנית שבה כמה ביניים נויטרופילים הם נצפו (איור 1D). תוצאות אלו מעידות על כך ששיטת האנטי-ברונכיט המנובת המועלת בסימפונות הביאה לפגיעה בריאה חריפה, שהייתה מקומית ברובו לריאה השמאלית והפיקה שינויים פתולוגיים הנראים גם עם בעלי החיים האנושיים, כולל הגדלת מכתשיים-הפרת מחסום נימי וחדירת נויטרופילים.
פגיעה חדה בריאות חריפה מאפשרת חקירה של מנגנוני הפענוח
כדי ללמוד את השלב החלטה של הנגרמת חומצה חמורה פגיעה בריאות העכברים חייב להיות מסוגל לשרוד את העלבון הראשוני. ברור מתוך הHCl של intratracheal, הסטילציה לתוך רק מוביל שמאל ברונטה הגזע מובילה לפציעה עצמית מוגבלת עם הישרדות אחידה בעכברים בריאים אחרת. ניתן להשיג את הריאות מעכברים בזמנים מוקדמים או מאוחרים יותר כמו באיור 2A. היסטולוגיה ריאה מראה פגיעה ברקמה ודלקת על האיבר ברמה התאית עם דלקת האקסופית 24 שעות לאחר הפגיעה המאופיינת על ידי מסומן בצקת מכתשי ו נויטרופילים הסתננות בריאה השמאלית. שימו לב שאין פגיעה משמעותית או זרימה לאוקוציט לריאה הימנית שאינה נפגעת (איור 2 א). 72 h לאחר הפגיעה, בצקת ומחלחל הסלולר מופחתים באופן משמעותי, ומייצגים שלב מהווה פתרון. מכתשי נויטרופילים יכול להיות מפוקח על ידי הזרמת cy, CD45+/cd68-/F4/80-/ly6g+/cd11b+) המתקבל על ידי ששטיפה ריאות שלמה. הגידול נויטרופילים בריאה השמאלית 24 h בעקבות הפציעה הראשונית וירידה משמעותית ב 48 ו 72 h (איור 2B). אם נקודות זמן מאוחרות יותר נחקרים, מספרי נויטרופילים יחזרו לבסיס ומנגנונים בשלבים מאוחרים יותר של catabasis, כגון תגובות פיברומתרבים, ניתן ללמוד.
איור 1: האינסטילציה של HCl בסימפונות מייצרת פגיעה בריאה חד-צדדית המוגדרת על ידי הפרת מחסום מכתשי והסתננות נויטרופילים. (א) ייצוג של הצינורית של מורלין השמאלית הימנית של מורנה לצורך התסטיציה סלקטיבית של HCl אל הריאה השמאלית. (ב) הריאות הימנית (ב) והשמאל (LL) החשופים לחומצה סלקטיבית ולאחר העירוי של הצבע הכחול של אוון. (ג) קוונפיקציה של ביניים הצבע הכחול של אוון מן הומוגניים הריאה 24 שעות לאחר פגיעת חומצה או שליטה מזויף; שהוא מותאם מתוך עבדול ואח '. 20146. הערכים מייצגים את הממוצע ± SEM, כאשר n ≥ 5. *p < 0.05, מאן-ויטני U מבחן. (ד) זרם הנציג cyintravascular try של העירוי (האינפוזיה; fluorophore 1) ו ביניים (I.S.; fluorophore 2) נויטרופילים כמו אחוזשל CD45 הכולל ותאים בריאה מעובד 24 שעות לאחר פגיעת חומצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פגיעה בריאה חד צדדית היא בפתרון עצמי. (א) נציג H & E היסטולוגיה (10x) של ריאות שמאל שהתקבלו מעכברים תמימים (0 H) או עכברים 24, 48, 72 H לאחר הפציעה, יחד עם הריאה הימנית המשויכת מאותו עכבר (סרגל קנה מידה = 250 μm). (ב) זרם מייצג cy, מכתשי נויטרופילים (Ly6G+ CD11b+) שהתקבלו משטיפה שלמה של הריאה כאחוז הכולל CD45+ תאים ב נאיבי (0 h) עכברים או עכברים 24, 48, ו 72 h לאחר פגיעת חומצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
השיטה הפנימית בסימפונות המתוארת כאן משתמשת בצינורית סלקטיבית של מחסום הגזע השמאלי כדי להחדיר את HCl לתוך הריאה השמאלית, וכתוצאה מכך פגיעה חדה בריאה ומצומצמת ממורין. זה חומצה מורבית מודל פציעה מקרוב מייצג את התגובה דלקתית, histopathology, ותפקוד פיסיולוגי לראות בנות אדם, שבו השאיפה חומצת הקיבה הוא מאוד מצוי או גורם תורם4. חשיפה של נתיב האוויר murine לנמוך התוצאות pH נמוכה התוצאה חדירות מוגברת של מחסום מכתשי-נימי, מכתשי בצקת, והסתננות נויטרופילים עמוק באתר הפציעה. אירועים אלה אינם מצופים בריאה הימנית הבלתי נפגעת. בנוסף, מודל זה מייצר תגובות דלקתיות מהירה כי השיא בתוך 24 h בעקבות חומצות האיזולציה, ומניות שינויים בביטוי הגנים עם בעלי החיים האנושיים, כגון הביטוי הדיפרנציאלי של phospholipase D איזופורמים10.
למרות המודל הקדם-קליני המורכי הזה מתרבה רבות מהתכונות של כרטיסי הבית ברמות המולקולריות, הסלולר והרקמה, הוא אינו מסכם באופן מלא את בגדי האדם. ההגדרה של בגדי הגוף כוללת מעורבות דו-צדדית של הריאה3, ואילו השיטה הביזילסטית המתוארת כאן גורמת לעיצוב במחלת ריאות חד-צדדית. כמו-כן, בעלי החיים אינם מחייבים אוורור מכני רציף, חוסר ניידות, או הרדמה בלתי פוסקת. התוצאות המוצגות כאן (הארץ) ובמקומות אחרים6,9, 11,12,13 להדגים כי פציעה חד צדדית המושרה חומצה מתרבה את רוב הסימנים הפתולוגיים של בגדי הים תוך מתן הזדמנות ייחודית להשתמש בריאה הימנית כשליטה פנימית ללמוד את שלב הפתרון של מחלה זו. ככזה, המודל שדנו כאן מודלים בעלי ביולוגיה פתולוגית, אבל גם מאפשר חקירת מנגנונים של תגובות בסיסיות של רקמת הריאה מנגנוני הפגיעה והפתרון העשויים להיות רלוונטיים לטיפול במחלה חשובה זו.
הסטיזיללציה של HCl מייצגת פציעה בריאה חריפה, כך שהוא מידול היבטים של הפתופסולוגיה הקשורים השאיפה דלקת ריאות. בנוסף, הפגיעה הראשונית הימנית הראשונה במודל זה נוצרת באמצעות HCl סטרילי ולא חיידקים לפני הקיבה לאדן לראות כמה אירועים שאיפה אנושית שיכולים גם לגרום לדלקת ריאות14. אצל בני אדם, השאיפה של חיידקים פתוגניים יכול לגרום לדלקת ריאות משנית בקטריאלי המגדיל את התגובה הדלקתית חריפה, הארכת פציעת הריאה הראשונית והגדלת הרגישות החולה לפתח ברווזים14. זו מגבלה פוטנציאלית טופלה על ידי החוקרים בכוונה החדרת חיידקים פתוגניים Esהמאנכיה קולי (E. coli)15 אחרי HCl סטרילי. בנוסף, שיטה זו שימש לחקירת הפתוגן-תיווך דלקת דלקת ריאות בקטריאלי חד צדדית יכול להיגרם על ידי שמאל סלקטיבי הריאה השמאלית של חיידקים, כגון E. coli16,17, הפסאודומונס aeruginosa16, ודלקת ריאות סטרפטוקוקוס18 . המודל העצמי לפגיעה בריאות חריפה המתואר כאן עשוי לשמש גם כדי ללמוד פגיעה בריאה הנגרמת מהנשמה (שווילי), גורם חשוב של תמותה מוגברת האדם19. מודלים בעלי חיים ניסיוניים של שווילי בדרך כלל כוללים אוורור מכני בעכברים תמימים עם כרכים גאות, כי הם הרבה יותר גבוה ממה שמשמש קלינית לגרום לפציעה בריאה (> 15 מ ל/ק"ג; ראה עבודה קודמת20,21). לקראת המודל הרלוונטי יותר קליני של שווילי, ברונכיט-חומצה בסימפונות כמתואר כאן עשוי לשמש תחילה כדי לגרום נזק לריאות לא קטלני ואחריו אוורור מכני באמצעי הגאות בתוך טווח קליני (6-12 mL/ק"ג). מודל זה לבעלי חיים היפותטי עשוי לאפשר לחוקרים לחקור את שווילי בצורה הרלוונטית קלינית לאחר שפותחה ואומתה. יחד, אלה מודלים murine להדגיש את צדדיות של שיטת החוסר החלטיות סלקטיבי כדי ליצור עלבונות הריאות חד צדדית הדומה הפתווגיות הקשורים מחלות ריאה האדם.
בנוסף להתרת התערבות סלקטיבית של סוכני רעילים שונים אל הריאה השמאלית, טכניקת הסימפונות הפנימית לאחר הטיפול במעי הגס אינה דורשת הכשרה מורחבת, זמן הליך ארוך, או ציוד מורכב, ובידיים מנוסים גורם למצוקה מינימלית לבעלי החיים. למרות זאת, בעיות מסוימות עלולות להתרחש במהלך ההליך הסלקטיבי של HCl שיכול להשפיע על תוצאות נסיוניות. צינורית לא נכונה של ברופון הגבעול השמאלי הראשי עלולה לגרום לפגיעה בריאה הדו הפוחתת ההישרדות של עכברים ניסיוניים ומבלבלת את השימוש בריאה הימנית כשליטה פנימית שלא נפגעה. זה יכול להיות נמנע על ידי לדוג את הקטטר מספיק לכיוון הריאה השמאלית בזמן הצינורית עד ההתנגדות הוא הגיע. לאחר ההזרקה של HCl, מנת אוויר צריך להיות מוזרק, הקטטר הוסר במהירות, ואת לוח כירורגי הביא זקוף לזווית 60 °. שלבים אלה הם חיוניים להבטיח כי החומצה מגיע המרוחק של הריאה השמאלית ומונע ריפלוקס של חומצה לתוך הריאה הימנית וקנה הנשימה, אשר עלול לגרום לפציעה האבובה. תוך 24 שעות לאחר הפגיעה, הפציעה בריאה השמאלית מפוזרת עם בצקת ריאות נרחבת, המשפיעה על הריאה הארוכה והשמאלית ביותר.
במהלך פיתוח שיטה בוגרים 8-12 בשבוע עכברים ישנים, 2.5 mL/ק ג של ברונכיט ו-HCl הפיק נזק משמעותי עדיין לריאות חריפה; מינונים נמוכים יותר של HCl לא היתה פגיעה בריאה והומוגנית. למרות שאנחנו לא ביצעו את המודל הזה צעיר (למשל, 3-6 בן שבועות) או עכברים מבוגרים יותר (למשל, 10-14 חודשים בן), אנו צופים כי מינון מבוסס משקל של HCl יביא לפגיעה בריאה פנוטיפ דומה למה שצוין ב 8-12 שבוע העכברים הישנים. אנו ממליצים כי החוקרים נכייל מינונים HCl כדי להשיג את המידה הרצויה של פגיעה בריאות לפני ביצוע ניסויים עם עכברים בקיצוניות של משקל.
זה הליך בררני חומצה סלקטיבית מציע מודל מורטין לא קטלני של דלקת רקמה סטרילית המפחית את הצורך בטיפול תומך, כגון אוורור מכני. עם הישרדות מורחבת של עכברים פצועים, הדלקת הנגרמת חומצה יש מספיק זמן כדי לפתור את עצמו. שלב הרזולוציה של מודל זה נעשה שימוש כדי לזהות מוסדר באופן זמני מתווכים אקטיביים השומנים, כינה המקצועית pro-פתרון מתווכים (spms), כגון ליפושין A4 (lxa4), maresin 1 (MaR1), ו-resolvins6 ,11,12,16. ניהול SPMs האקסוגני לעכברים פצועים מהירות הרזולוציה של חומצה הנגרמת על ידי פגיעה מנגנונים דלקתיים וקידום catabasis של רקמת הריאה הפצועה. SPMs אלה לקדם את הסיווג של מכתשי בצקת12, להגדיל את efferocytosis של האפוטוטיק נויטרופילים על ידי מגויס מקרופאגים16, ולהאיץ את האפיתל מחדש של נתיבי הנשימה ומכתשי12 כדי להפחית את כלי הדם דליפת שומן ברקמה. במודל של פגיעת הפתוגן המושרה, 15-אפי-resolvin D1 גם הציגו פעולות מיקרוביאלית באמצעות phagocyציטוזה מוגבר על ידי מקרופאגים והסיווג חיידקי משופר מן הריאה הנגועה16. חקירת מנגנוני החלטה אנדוגניים אלה מספק תובנה אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות לחולים עם ברווזים5.
לחקר הטוב ביותר את הרגולציה הטמפורלית של מנגנוני הפענוח, במודלים ניסיוניים vivo נחוצים. מודלים של פגיעה בריאה חריפה חייבים לכלול תגובות דלקתיות חריפה ותפקוד איברים עם התחייבות של החלטה מארח קידום תהליכים מולקולריים וסלולריים. ניתן לכמת מנגנונים אלה באמצעות מדדי הרזולוציה הקבועים22. השיטה הסלקטיבית של הסימפונות ליצירת פגיעה בריאה חד צדדית הוכיחה שימושי בהקשר זה כדי לחקור מגשרים ומסלולים ברזולוציה אנדוגניים. מחקרים עתידיים להעמיק את הבנתנו את התהליכים הללו ברזולוציה האקטיבית יש את ההבטחה של מוביל אגוניסטים טיפולית כי לחקות את bioactions של המגשרים השומנים אנדוגניים כדי לשפר את הרזולוציה של דלקת ומקלים את התחלואה והתמותה של ברווזים ומחלות ריאות חשובות אחרות.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לד ר יוסף מיזגרד על תרומתו לפיתוח השיטה הסלקטיבית של הסימפונות ולהערות העזרה והסקירה של כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי P01GM095467 (B.D.L.) ו K08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D.
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S.
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
