Summary
Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc's met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.
Abstract
Als cellulaire metabolisme is een belangrijke regulator van hematopoietische stamcel (HSC) zelf vernieuwing, de verschillende rollen gespeeld door de mitochondriën in hematopoietische homeostase zijn uitgebreid bestudeerd door HSC onderzoekers. Mitochondriale activiteit niveaus worden weerspiegeld in hun membraan mogelijkheden (ΔΨm), die kan worden gemeten door cel-perbetekende kationische kleurstoffen zoals tmrm (tetramethylrhodamine, methyl ester). Het vermogen van effluxpompen om deze kleurstoffen uit cellen te extrumaken, kan echter hun bruikbaarheid beperken. De resulterende meet bias is met name van cruciaal belang bij de beoordeling van HSCs, omdat xenobiotische transporters hogere niveaus van expressie en activiteit vertonen in HSCs dan in gedifferentieerde cellen. Hier beschrijven we een protocol met behulp van verapamil, een effluxpomp remmer, om nauwkeurig ΔΨm te meten over meerdere beenmerg populaties. De resulterende remming van de activiteit van de pomp is aangetoond dat de intensiteit van de TMRM in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) te verhogen, terwijl het verlaten van het relatief onveranderd in rijpe fracties. Dit benadrukt de nauwe aandacht voor kleurstof-Efflux activiteit die nodig is wanneer ΔΨm-afhankelijke kleurstoffen worden gebruikt, en zoals geschreven en gevisualiseerd, dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurig te vergelijken ofwel verschillende populaties binnen het beenmerg, of dezelfde populatie over verschillende experimentele modellen.
Introduction
Hematopoietische stamcellen (hscs) zijn zelfvernieuwend, multi-potent, en kunnen aanleiding geven tot alle cellen van het bloed1,2. Cellulaire metabolisme is een belangrijke regulator van HSC-onderhoud, samen met transcriptionele factoren, intrinsieke signalen en de micro-omgeving3,4,5. De juiste controle van de mitochondriale functie en kwaliteit is daarom van cruciaal belang voor HSC-onderhoud6,7.
Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) is een belangrijke parameter in de beoordeling van mitochondriën als het direct weerspiegelt hun functionaliteit, die voortvloeit uit het evenwicht van proton pomp activiteit in de elektronentransport keten en de Proton stroom door F 1/FO ATP-synthase. Deze zijn beide nodig (afhankelijk van de genexpressie en beschikbaarheid van het substraat) voor de zuurstof afhankelijke fosforylering van ADP naar ATP8,9. Door gebruik te maken van de electronegativiteit van het mitochondriale compartiment zijn verschillende potentiometrische kleurstoffen ontwikkeld om ΔΨm te meten. Een van hen is tetramethylrhodamine methyl ester perchloraat (TMRM), die uitgebreid is gebruikt voor het meten van ΔΨm doorstroming cytometrie in een verscheidenheid van cellen10, met inbegrip van hematopoietische stam en voorlopercellen11.
Mitochondriale kleurstoffen moeten worden gebruikt met enige voorzichtigheid in HSCs, echter, omdat de hoge activiteit van de xenobiotische Efflux pompen van deze cellen kan resulteren in kleurstof extrusie12. Inderdaad, de extrusie van mitochondriale kleurstoffen zoals Rhodamine 123 heeft onderzoekers toegestaan HSCs13 te isoleren of te identificeren HSC "side populaties" door het benutten van de differentiële extrusie van de kleurstoffen Hoechst blauw en Hoechst rood14, 15. ook is aangetoond dat Fumitremorgin C, een specifieke blokkade van de ATP-bindende cassette subgroep G member 2 (ABCG2), geen invloed heeft op het kleurings patroon van MitoTracker in HSPCs16. Na de publicatie van deze resultaten, meerdere studies werden uitgevoerd met behulp van mitochondriale kleurstoffen in de afwezigheid van xenobiotische Efflux pomp remmers, wat leidt tot de wijdverbreide indruk dat HSCs slechts een klein aantal mitochondriën met lage ΔΨm hebben16 , 17 , 18.
Onlangs werd echter aangetoond dat verapamil, een breed spectrum remmer van effluxpompen, het kleurings patroon van de mitochondriale kleurstof MitoTracker Green19aanzienlijk wijzigt. Dit verschil is waarschijnlijk te wijten aan het feit dat Fumitremorgin C zeer selectief is voor Abcg2, terwijl HSCs ook andere transporters uitdrukken, zoals Abcb1a (die slechts zwak gevoelig is voor Fumitremorgin C)19. We hebben ook gemeld dat andere mitochondriale kleurstoffen, zoals TMRM, nonyl acridine Orange en Mitotracker Orange (MTO) dezelfde patronen vertonen als Mitotracker Green. Wat nog belangrijker is, we hebben geconstateerd dat de Flow cytometrische patronen van HSPCs weerspiegelen hun ΔΨm in aanvulling op mitochondriale massa11.
De inname van TMRM kleurstof is strikt afhankelijk van de negatieve lading van de mitochondriën, maar de resulterende accumulatie van kleurstof is in constante balans tussen de inname en de klaring door Efflux pompen20. Het verschil in xenobiotische effluxpomp expressie tussen HSCs en volwassen celpopulaties beïnvloedt dit evenwicht en kan leiden tot bevooroordeelde resultaten. Het gebruik van speciale remmers zoals verapamil moet worden overwogen bij de analyse van ΔΨm door potentiometrische kleurstoffen. Hier beschrijven we een gewijzigd protocol voor nauwkeurige ΔΨm meting door TMRM gebaseerde flow cytometrie die corrigeert voor xenobiotische Transporter activiteit door het gebruik van speciale remmers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Albert Einstein College of Medicine.
1. voorbereiding van de oplossingen
- Kleurings buffer (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% foetaal runderserum (FBS)): Voeg 10 mL FBS toe in 500 mL van een steriele PBS-oplossing.
Opmerking: Deze oplossing kan gedurende ten minste één maand in steriele toestand bij 4 °C worden bewaard. Voordat u met de volgende procedures begint, plaatst u een aliquot van deze oplossing (50 mL) op ijs. - ACK (ammonium-chloride-kalium) lyseren buffer: plaats een aliquot van ACK lyseren buffer (1 ml) op ijs voordat u de procedure start.
Opmerking: Om dezelfde niet-commerciële buffer voor te bereiden, Los 8,02 g van NH4cl, 1 g khco3 en 37,2 mg na2EDTA op in 1 L van H2O. Stel de pH in op 7,2-7.4. Bewaar tot 6 maanden bij kamertemperatuur. - Kweekmedium: Voeg 50 ng/mL stamcel factor (SCF) en 50 ng/mL trombopoëtine (TPO) toe aan serumvrij medium voor cultuur en uitbreiding van hematopoietische cellen (Zie tabel van het materiaal voor commercieel medium aanbevolen).
- TMRM stamoplossing: TMRM (1 μM) oplossing bereiden door 5 μg TMRM poeder op te lossen in 10 mL ethanol. Bewaar deze oplossing bij-20 °C beschermd tegen het licht.
- Verapamil Stock Solution: bereid verapamil (50 mM) oplossing door het verdunen van 24 mg verapamil in 1 mL ethanol. Bewaar deze oplossing bij-20 °C.
- FCCP Stock Solution: bereiding carbonilcyanide p-triflouromethoxyphenylhydrazone (FCCP) (1 M) oplossing door het oplossen van 254 mg in 1 mL ethanol. Bewaar deze oplossing bij-20 °C beschermd tegen het licht.
2. beenmerg isolatie
- Euthaniseer de muis door CO2 inademing na institutionele richtlijnen en spray de muizen met 70% ethanol.
Opmerking: Deze stap voorkomt besmetting van de cellen van belang zonder afbreuk te doen aan experimentele resultaten. - Gebruik een paar tang en een scherpe schaar, maak een kleine knipsel in de ventrale huid van de muis en strek de huid.
- Extract het dijbeen en de Tibia terwijl het verzorgen van de hoofden van het dijbeen niet te ontzetten als ze een grote hoeveelheid beenmergcellen bevatten. Plaats de verwijderde botten in een 6-put-plaat gevuld met 1,5 mL kleurings buffer.
Opmerking: Deze procedure vereist geen steriel gebied. - Verwijder de spieren uit de botten en snijd de uiteinden van de botten waardoor de uitgang van het beenmerg (Figuur 1a). Plaats de gereinigde botten in nieuwe putjes met 1,5 mL kleurings buffer.
Opmerking: Spieren en andere weefsels moeten zorgvuldig worden verwijderd om te voorkomen dat de spuit verstopt in de volgende stap. - Spoel het beenmerg uit met een 3 mL spuit met een 25 G naald.
Opmerking: Blijf het beenmerg spoelen totdat het bot wit wordt (Figuur 1b). - Verzamel alle cellen in een tube van 1,5 mL, Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 180 x g en gooi de supernatant weg (figuur 1c).
- Rebreng de pellet in 300 μL ijskoude ACK lyseren buffer zeer zorgvuldig, zet het ijs gedurende 1 minuut en onmiddellijk inactieve lysis door 1 ml kleurings buffer toe te voegen. Centrifugeer 5 min bij 180 x g.
Opmerking: De cellen pellet verschijnt wit (figuur 1d). Het totale aantal geïsoleerde cellen is ongeveer 2-4 x 107. - Respendeer de pellets in 1 mL kleurings buffer en filtreer met behulp van een celstrainer dop (12 x 75 mm2,5ml capaciteit) met een 35 μm nylon gaas dat is ingebouwd om mononucleaire cellen te verkrijgen. Houd het monster na het blokkeren op ijs.
3. immunokleuring voor detectie van HSC
- Bereid Lineage (Lin) cocktail. Voeg in 400 μL kleurings buffer 4 μL van de volgende biotinilated antilichamen toe tegen CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, GR1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM en Il7Ra om een uiteindelijke verdunning 1:100 te verkrijgen.
- Bereid fluoroforen geconjugeerd-antilichamen (ABS). Voeg in 400 μL kleurings buffer 4 μL van de volgende ABS toe om een uiteindelijke verdunning 1:100 te verkrijgen. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-Kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/CY 5.5 en CD34-FITC. Bewaren in ijs, beschermd tegen licht.
- Centrifugeer het monster 5 min bij 180 x gen gooi het supernatant weg.
- Voeg 400 μL Lin cocktail oplossing toe aan de cellen pellet. Voeg 4 μL CD135-biotinilated AB. Vortex snel toe om 30 minuten in ijs te mengen en te inbroed.
- Was het monster met 3 mL kleurings buffer, draai gedurende 5 minuten op 180 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 400 μL ABS-oplossing toe. Vortex snel te mengen en inbroed voor 30 min op ijs.
- Was de monsters met 3 mL kleurings buffer, draai gedurende 5 minuten op 180 x g en gooi het supernatant weg.
4. TMRM-kleuring
- Bereid TMRM-kleurings oplossing voor. Voeg 2,2 μL TMRM-stamoplossing en 1,1 μL verapamil (respectievelijk 2 nM en 50 μM als eindconcentratie) toe in 1,1 mL serumvrij medium voor cultuur en uitbreiding van hematopoietische cellen (Zie tabel van het materiaal voor commercieel medium aanbevolen) met TPO en SCF.
Opmerking: Dit is de belangrijkste stap van het protocol. Verapamil toevoeging is noodzakelijk voor het blokkeren van de Efflux pompen die sterk worden uitgedrukt in de HSCs en kan extruderen tmrm. - Hervat het beenmerg in 1 mL TMRM-kleurings oplossing, Vortex snel en inincuberen voor 1 uur bij 37 °C.
Opmerking: TMRM-kleuring mag niet worden weggespoeld. PE-specifieke compensatie controle wordt ook gehersuspendeerd in 100 μL TMRM-kleurings oplossing en wordt gedurende 1 uur bij 37 °C na een snelle Vortex geincubatie. - Filtreer het monster met behulp van een celstrainer dop (12 x 75 mm2,5ml capaciteit) met een 35 μm nylon gaas ingebouwd om verstopping van de flow cytometer te voorkomen.
Opmerking: TMRM-kleuring verhoogt de mogelijkheid van verstoppen van de vorming in het monster. Filtratie van het monster vlak voor stroming testen wordt aanbevolen. - Voeg 1 μL 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) toe om dode cellen uit te sluiten doorstroming cytometrie.
5. overname door flow cytometer
- Voer beenmerg monster uit en verkrijg ten minste 1 x 106 gebeurtenissen.
-
Stel de gating-strategie in om de verschillende hematopoietische populaties te identificeren (Figuur 2).
- Laat levend beenmerg mono-nucleaire cellen (BM-MNCs), DAPI− Fractie, in plot voor Pacific Blue zien om CD135−Lin− (Lin−) en Lin+ fracties te identificeren.
- Plot Lin− fractie voor APC/Cy7 (c-Kit) versus PE/Cy7 (SCA-1) voor het identificeren van multipotente voorlopercellen (MPP) Fractie, als c-Kit+ en SCA-1+.
- Plot MPP-fractie voor APC (CD48) versus PerCP/CY 5.5 (CD150) om HSC-breuk te identificeren, zoals CD150+ en CD48−.
- Display HSC-fractie voor FITC (CD34) om CD34−-HSC en CD34+-HSC te verdelen.
- Verkrijg de TMRM-intensiteit (PE-kanaal) in elke populatie.
- Voeg na de overname toe aan het monster 1 μL FCCP om de uiteindelijke concentratie van 1 mM te verkrijgen en inbroed bij 37 °C gedurende 5 minuten en verkrijg vervolgens 1 x 106 gebeurtenissen.
Opmerking: FCCP is een mitochondriale ontkoppelaar die wordt gebruikt om de ΔΨm te verdrijven. Het wordt gebruikt als experimentele controle om te bevestigen dat TMRM kleuring correct werkt. Na de toediening van FCCP moet de intensiteit van de TMRM drastisch worden verlaagd (Figuur 3a). - Gegevens analyseren normaliseren van de gemiddelde intensiteit van de PE van elke populatie door de intensiteit van de PE van alle BM-Mnc's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hierboven beschreven protocol maakt het eenvoudig isoleren van BM-Mnc's van een muismodel mogelijk. Figuur 1 vat de belangrijkste stappen van het protocol samen: botisolatie, blozen uit het beenmerg, rode bloedcel lysis, en antilichaam kleuring gevolgd door tmrm kleuring om Mitochondriale membraanpotentiaal in een specifieke hematopoietische populatie te meten .
BM-Mnc's bevatten verschillende celpopulaties, waaronder HSCs. De cocktails van antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, zijn goed verankerd in de zuivering van HSCs (CD34− en CD34+), multipotente voorlopercellen (mpp's), Lin− evenals Lin+ cellen, respectievelijk 21. De gating-strategie voor het isoleren van deze fracties wordt weergegeven in Figuur 2.
Na de identificatie van de populaties van belang, TMRM intensiteit, die moet worden weergegeven als een helder signaal, werd beoordeeld. TMRM-kleuring in serumvrij expansie medium (SFEM) wordt ten zeerste aanbevolen, aangezien TMRM-profielen in Hspc's kunnen worden gefixeerd wanneer kleuring wordt uitgevoerd in PBS + 2% FBS (Figuur 3a).
Figuur 3c toont de gemiddelde intensiteit van elke populatie, die wordt genormaliseerd door de intensiteit van BM-MNCs. hscs Express hoge activiteitsniveaus van xenobiotische effluxpompen die tmrm Dye20kunnen extruderen, en inderdaad, we vonden tmrm profielen in hspcs werden veranderd in de aanwezigheid van verapamil (Figuur 3b, C). Vergelijkbare resultaten werden verkregen door andere remmers zoals Cyclosporin H (figuur 3c). Zo kan de nauwkeurige hoeveelheid TMRM geladen in de mitochondriën door ΔΨm worden gemeten na remming van de Efflux pompen door verapamil of Cyclosporin H (figuur 3c).
Ten slotte kan FCCP worden gebruikt om de nauwkeurigheid van TMRM-kleuring te controleren. FCCP depolariseert mitochondriën, resulterend in een afname van de TMRM-intensiteit (figuur 3D). Deze benadering kan ook worden gebruikt om de achtergrond intensiteit van de kleuring en/of als een negatieve controle te bepalen.
Figuur 1: protocol stroomdiagram. Grafische samenvatting van de procedure voor het isoleren en beits van BM-MNCs om te bepalen ΔΨm. Kritieke stappen worden gemarkeerd door afbeeldingen (A-D). Femurs en scheen van volwassen C57BL/6 muizen waren geïsoleerd en hun uiteinden worden verwijderd (a). Lange botten zoals in A na spoelen (B). Geïsoleerd BM-MNCs vóór (C) en na (D) ACK lysis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2: installatie instellen. Schematische weergave van de gating-strategie om de verschillende hematopoietische populaties te identificeren, waaronder CD34−-HSC en CD34+-HSC, MPP, Lin− en Lin+ cellen. De panelen werden gewijzigd van Bonora, M. et al.11. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Flowcytometrie analyse van het Mitochondriale membraanpotentiaal. A) representatieve verdeling van ΔΨm in hscs, gekleurd met TMRM in PBS + 2% FBS (groen) of in serumvrij expansie medium (sfem) (rood). (B, C) Representatieve verdeling van ΔΨm in CD34−-HSC en Lin− cellen (B) en kwantificering van ΔΨm in CD34−-HSC, CD34+-HSC, MPP, Lin− en Lin+ cellen (C) gekleurd met tmrm in aanwezigheid of afwezigheid van effluxpomp remmers. De TMRM-intensiteit van elke populatie werd genormaliseerd door de TMRM-intensiteit van eigen BM-Mnc's (gewijzigd van Bonora, M. et al.11). D) representatief histogram van de TMRM-intensiteits verdeling in hscs vóór (roze) en na (licht blauwe) FCCP-toevoeging. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitochondriale membraan potentiële meting is een hoeksteen van de analyse en de beoordeling van de mitochondriën, die essentieel zijn voor de metabole toestand van de cel. Hier beschrijven we een protocol voor de analyse van ΔΨm door TMRM-kleuring. TMRM is een cel-perbetekende fluorescerende kleurstof die accuiteert in actieve mitochondriën als gevolg van ΔΨm, en de respectieve niveaus blijven in evenwicht tussen de extracellulaire, cytoplasmische en mitochondriale compartimenten10. Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende kleurstoffen, waaronder tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) en JC-1. Geschikte kleurings condities zijn essentieel om nauwkeurige resultaten te behalen. Deze omvatten: bescherming tegen blootstelling aan licht, goede incubatietijd, behoud van constante temperatuur (37 ° c) en extracellulaire concentratie. Wanneer TMRM-kleurstof niveaus nog geen perfect evenwicht hebben bereikt, kunnen onverwachte veranderingen in de intensiteit van de kleuring worden gedetecteerd tijdens het verzamelen van gegevens in het proces van de stroom cytometrie. Daarom is de aanbevolen kleurings periode voor TMRM 1 uur in plaats van 30 min (zoals vermeld in het Protocol van een TMRM-fabrikant). Er wordt ook gesuggereerd dat het monster ten minste tweemaal binnen 5 minuten moet worden verworven om de stabiliteit van de kleurstof te vergelijken.
Een andere kritieke stap van het protocol is het opzetten van een efficiënte kleur match tussen antilichamen en kleurstof. Hematopoietische populaties kunnen worden gedetecteerd door flow flowcytometrieonderzoeken met behulp van goed gevestigde oppervlak markers21. De gating-strategie die hier wordt beschreven (Figuur 2) is compatibel met TMRM-kleuring en maakt het mogelijk om de intensiteit ervan in verschillende differentiatie stadia tegelijk te meten. TMRM komt overeen met het PE-kanaal, maar de intensiteit is meestal veel zwakker dan die van antilichamen die zijn geconjugeerd met PE (gegevens worden niet weergegeven). Aangezien dit invloed kan hebben op de kleur compensatie, waardoor onverwachte verschuivingen in de spectra van sommige populaties ontstaan, moet het monster met TMRM-kleuring worden gebruikt als compensatieregeling voor het PE-kanaal.
Het grote voordeel van het huidige protocol is dat het de verwijdering mogelijk maakt van het effect van xenobiotische effluxpompen, waarvan de efficiënte extrusie van TMRM-kleurstof zowel het evenwicht tussen het plasma membraan als de mitochondriale accumulatie ervan wijzigt. Dit is een kritieke stap in de nauwkeurige beoordeling van de mitochondriale functie van HSC door kleurstof absorptie. Aangezien hscs Express meer actieve effluxpompen dan gecommitteerd cellen19, verapamil of soortgelijke drugs, zoals cyclosporine H, een CA2 +-onafhankelijke multi drug resistentie inhibitor22 (Figuur 3b-C), moet worden gebruikt in de kleurings procedure voor HSCs om de niveaus van mitochondriale activiteit nauwkeuriger te beoordelen. Omdat deze kritieke kwestie pas onlangs is gewezen op11,19 en nog steeds onder discussie23staat, is het belangrijkste doel van dit verslag om een eenvoudig en gedetailleerd protocol te bieden dat de procedure voor het verkrijgen van reproduceerbare gegevens en het verminderen van de schijnbare discrepanties tussen de resultaten van verschillende onderzoeksgroepen. Het protocol hier beschreven toont in detail elke stap, met inbegrip van doses, timing en specifieke media. TMRM-profielen in Hspc's kunnen bijvoorbeeld verschillen afhankelijk van hun medium (Figuur 3a). Een gedetailleerde analyse van de betrokken mechanismen vereist verdere verkenning, maar aangezien serumvrij expansie medium (SFEM) een gevestigde methode is voor HSC-cultuur, wordt SFEM in plaats van PBS sterk aanbevolen bij het uitvoeren van TMRM-kleuring voor HSCs. Verder benadrukt de nauwkeurige beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel dat hier wordt gedemonstreerd door de remming van Efflux-pompen mogelijke toekomstige toepassingen van verapamil, evenals andere kleurstoffen (bijv. MitoTracker, MitoSOX), bij het onderzoek van HSCs.
Belangrijker, TMRM intensiteit zoals blijkt uit de Flowcytometrie kan niet precies reflecteren mitochondriale volume. Flow cytometrie meet de totale intensiteit van de fluorescentie per cel, maar de verdeling van mitochondriale kleurstoffen naar mitochondriën hangt af van ΔΨm. Het is daarom moeilijk te onderscheiden of de kritische bijdrage aan een TMRM-lezing voortvloeit uit ΔΨm of mitochondriale volume11. We hebben bevestigd dat MTD, een van de meest gebruikte kleurstoffen voor het meten van de mitochondriale massa, wordt beïnvloed door zowel ΔΨm als effluxpomp activiteit. We hebben ook geconstateerd dat verapamil het intensiteits Profiel van mtd in HSPC-populaties verandert, maar geen correlatie heeft gevonden tussen de intensiteit van de MTO en het mitochondriale volume11. Gecombineerde meting van mitochondriale volume en ΔΨm moet worden gebruikt om gegevens te normaliseren en de effecten van membraanpotentiaal te elimineren, en verdere verkenning van mitochondriale inhoud moet worden uitgevoerd met behulp van ΔΨm-onafhankelijke technieken.
Dergelijke technieken omvatten 3D-volume analyse op basis van fluorescerende markers (bijv. immunokleuring van mitochondriale eiwitten), elektronenmicroscopie11, en kwantatie van mitochondriale/nucleaire DNA-verhoudingen. Het gebruik van mitochondriale kleurstoffen (d.w.z. TMRM) in combinatie met Efflux-systeem remmers zal ongetwijfeld een groot voordeel blijken te zijn in de verheldering van de mitochondriale biologie door middel van Flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken alle leden van het ITO laboratorium, in het bijzonder K Ito en H Sato, en het Einstein stamcel instituut voor commentaren en de Einstein flow Cytometry en analytische Imaging Core facilities (gefinancierd door National Cancer Institute Grant P30 CA013330) voor helpen bij het uitvoeren van de experimenten. K.I. wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01DK98263, R01DK115577 en R01DK100689) en het New York State Department of Health als kern directeur van Einstein single-cell Genomics/Epigenomics (C029154). K.I. ito is een onderzoeker van de leukemie en de lymfoom Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysing buffer | Life Technologies | A1049201 | |
| B220-biotin | BD Bioscience | 553086 | |
| CD3e-biotin | Life Technologies | 13-0031-85 | |
| CD4-biotin | Fischer Scientific | BDB553782 | |
| CD8-biotin | Life Technologies | 13-0081-85 | |
| CD11b-biotin | BD Bioscience | 553309 | |
| CD19-biotin | BD Bioscience | 553784 | |
| CD34-FITC | eBioscience | 11-0341-85 | |
| CD48-APC | eBioscience | 17-0481-82 | |
| CD135-biotin | eBioscience | 13-1351-82 | |
| CD150-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 115922 | |
| c-kit-APC/Cy7 | Biolegend | 105826 | |
| Cyclosporin H | Millipore Sigma | SML1575-1MG | |
| DAPI solution (1 mg/mL) | Life Technologies | 62248 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Denville | FB5001-H | |
| FCCP | Millipore Sigma | C2920-10MG | |
| Gr1-biotin | Biolegend | 108404 | |
| IgM-biotin | Life Technologies | 13-5790-85 | |
| Il7Rα-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | |
| Nk1.1-biotin | Fischer Scientific | BDB553163 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010023 | |
| Sca-1-PE/Cy7 | eBioscience | 25-5981-81 | |
| SCF murine | PEPROTECH | 250-03-10UG | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL technologies | 9605 | |
| Streptavidin-Pacific Blue | eBioscience | 48-4317-82 | |
| Ter119-biotin | Fischer Scientific | BDB553672 | |
| TMRM | Millipore Sigma | T5428-25MG | |
| TPO | PEPROTECH | 315-14-10UG | |
| Verapamil hydrochloride | Millipore Sigma | V4629-1G |
References
- Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
- Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
- Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
- Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
- Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
- Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
- Bonora, M., et al.
- Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
- Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
- Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
- Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
- Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
- Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125 (2016).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
- de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
- Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
- Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
- Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
- Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
