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Articolo metodologico

Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

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DOI:

10.3791/60182

⸱

27 settembre 2019

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

In questo articolo

Sommario

Questo metodo descrive la preparazione del campione da cellule coltivate e tessuti animali, l'estrazione e la derivazione del coenzima A nei campioni, seguita dalla cromatografia liquida ad alta pressione per la purificazione e la quantificazione del coenzima derivato A da rilevamento dell'assorbimento o della fluorescenza.

Abstract

La ricerca emergente ha rivelato che l'offerta di coenzenzima cellulare A (CoA) può diventare limitante con un impatto negativo sulla crescita, il metabolismo e la sopravvivenza. La misurazione del CoA cellulare è una sfida per la sua relativamente bassa abbondanza e la conversione dinamica di CoA gratuita a CoA thioesters che, a sua volta, partecipano a numerose reazioni metaboliche. Viene descritto un metodo che naviga attraverso potenziali insidie durante la preparazione del campione per produrre un saggio con un'ampia gamma lineare di rilevamento che è adatto per l'uso in molti laboratori biomedici.

Introduzione

Il coenzima A (CoA) è un cofattore essenziale in tutti gli organismi viventi ed è sintetizzato dall'acido panttheico, chiamato anche panttheanato (il sale dell'acido pantonico) o vitamina B5. Il CoA è il principale vettore intracellulare di acidi organici, compresi gli acidi a catena corta come acetato e succinato, acidi a catena di rami come propionato e metilmalo, acidi grassi a catena lunga come palmitato e oleato, acidi grassi a catena molto lunga come acidi grassi polinsaturi e xenobiotici come l'acido valproico. L'acido organico forma un collegamento tioester enzimaticamente con CoA per consentire il suo uso come substrato in oltre 100 reazioni nel metabolismo intermedio1. I tioesteri coA sono anche regolatori allosterici e attivatori trascrizionali. Ora è apprezzato2 che la fornitura totale cellulare di CoA è regolata3,4; pertanto, la disponibilità di CoA può essere limitante e le carenze di CoA possono essere catastrofiche, come esemplificato da disturbi genetici ereditari che hanno un impatto sulla biosintesi coa5. Pantothenate chinaase catalizza il primo passo nella biosintesi coa (Figura 1) e Pantothenate Kinase Associated Neurodegeneration, chiamato PKAN, è causata da mutazioni nel gene PANK2 6. La sintesi della CoA, codificata dal gene COASYN, catalizza gli ultimi due passaggi nella biosintesi CoA (Figura 1) e nella Neurodegenerazione associata alle proteine COASY, chiamata CoPAN, è causata da una mutazione nel gene COASYN 7. Sia PKAN che CoPAN sono malattie neurodegenerative ereditarie associate all'accumulo di ferro nel cervello e alle carenze di CoA in modo inferiore alle patologie.

I livelli cellulari di CoA totale variano tra i tessuti8 e CoA totale può aumentare o diminuire sotto una varietà di stati fisiologici, patologici e farmacologici. Il CoA del fegato aumenta durante il passaggio del combustibile dallo stato di alimentazione allo stato digiunato9e i livelli di CoA epatica sono anormalmente elevati nei topi obesi carenti di leptina10. Fegato CoA diminuisce in risposta all'ingestione cronica di etanolo11. I livelli di CoA cerebrale nel modello di topo knockout Pank2 sono depressi durante il periodo perinatale, ma più tardi nella fase adulta il contenuto di CoA del cervello è equivalente ai livelli di tipo selvaggio, indicando una risposta CoA adattiva durante lo sviluppo12. Manipolazione del contenuto di CoA dei tessuti mediante transgenesi o metodi di somministrazione genica influisce sulle funzioni metaboliche e neurali13,14,15. Lo sviluppo preclinico di potenziali terapie per PKAN o CoPAN include misurazioni CoA cellulari o tissutali come indicatori di efficacia16,17,18,19,20 . La valutazione di tutte queste condizioni e delle loro conseguenze metaboliche o funzionali richiede un metodo quantitativo per la misurazione del CoA totale.

Un test accurato e affidabile per misurare CoA in campioni biologici è una sfida tecnica in molti laboratori. Purtroppo, non ci sono sonde disponibili per valutare o quantificare i tioesteri CoA o CoA in cellule intatte, anche se analoghi di tioesters CoA naturali sono stati ampiamente utilizzati come sonde meccanicistiche negli studi di CoA ester utilizzando enzimi21. La conversione di CoA, con un solfuro libero (-SH), in un tifoso di CoA (o viceversa) è rapida nelle cellule o nei tessuti animali durante il trasferimento in un ambiente diverso e durante la lisi cellulare. Numerosi sintetasi acyl-CoA e tioesterai di CoA nelle cellule mediano le interconversioni all'interno del pool di CoA, e ulteriori enzimi che utilizzano il tioestro coa come substrati rimangono attivi in campioni biologici fino a quando non vengono spenti da prodotti chimici o fisici mezzo. L'off-loading dei gruppi acili dal CoA alla carnitina da parte dei transferasi di acyl è un esempio all'interno della rete di reazioni che possono alterare la distribuzione di coA/CoA thioester. I traccianti radioattivi possono essere utilizzati per misurare i tassi di sintesi CoA nelle cellule. Gli attuali metodi per misurare i derivati di CoA e CoA in campioni biologici sono stati esaminati22 e includono saggi spettrofotometrici enzimatici accoppiati, cromatografia liquida ad alta pressione e procedure basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, questi metodi sono spesso focalizzati su particolari specie molecolari di CoA e sono ciechi alla variazione della piscina totale di CoA. I saggi enzimatici accoppiati generalmente richiedono grandi quantità di materiale di input a causa di basse sensibilità di rilevamento e hanno una gamma limitata di linearità.

Il nostro laboratorio ha sviluppato una procedura affidabile per la quantificazione del CoA totale nelle cellule coltivate e nei tessuti animali. La strategia include l'idrolisi di tutti i tioesteri CoA per produrre solo CoA gratuito durante la preparazione del campione, piuttosto che fare sforzi per mantenere e analizzare l'intero spettro delle specie CoA. La procedura è una compilazione di singoli metodi pubblicati per la preparazione dei campioni, la derivazione del CoA, la purificazione e l'identificazione a seguito della cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e la quantificazione della CoA derivata mediante assorbimento o rilevamento della fluorescenza23,24,25. Le determinazioni CoA ottenute utilizzando questa procedura hanno permesso la nostra comprensione della regolazione CoA e lo sviluppo di un approccio terapeutico per il trattamento delle carenze di CoA.

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Protocollo

La procedura animale di cui al presente protocollo è stata eseguita secondo i protocolli 323 e 556 e specificamente approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del St. Jude Children's Research Hospital.

1. Preparazione delle soluzioni

NOTA: Utilizzare acqua ultrapura per tutte le soluzioni e quando indicato nelle procedure.

  1. Preparare 1 mM di idrossido di potassio (KOH) in acqua.
  2. Preparare 0,25 M KOH in acqua.
  3. Preparare 1 M Trizma-HCl in acqua e regolare al pH 8.0.
  4. Preparare 100 mM monobromobimane (mBBr) in acetonitrile (Optima Grade). Le soluzioni stock di mBBr sono stabili a -20 gradi centigradi per molti mesi, a condizione che siano tenute al buio, poiché l'esposizione alla luce può fotolizzare il monobromobimane a bimane26.
  5. Preparare il buffer di lavaggio per l'estrazione di fase solida (SPE) colonna: 50% metanolo (Optima Grade) - 2% acido acetico.
  6. Preparare il buffer di elusione per la colonna SPE: 95% di etanolo (HPLC Grade) contenente 50 mM di formato di ammonio.

2. Preparazione dello standard CoA-bimane

  1. Acquistare uno standard CoA di alta qualità da una fonte affidabile (ad esempio, Polar Lipids, Inc.).
  2. Preparare una soluzione di stock ad alta concentrazione di CoA in 20 mM Tris, pH 8. La quantità di CoA nello stock ad alta concentrazione è determinata o confermata dall'assorbimento spettrofotometrico a 260 nm (16.800 M-1cm). Aggiungere un eccesso molare 4 volte superiore di mBBr; vortice in alto per 10 s. Ad esempio, per 10 mM CoA nel buffer, aggiungere 40 mM mBBr. L'mBBr viene aggiunto in eccesso per garantire che tutto il CoA sia derivato.
  3. Incubare a temperatura ambiente per 4 h al buio senza agitare per derivare il CoA con mBBr. mBBr reagisce con il gruppo thiol del CoA, ed è pH e temperatura dipendente27. L'aggiunta del mBBr converte CoA in un fluorescente solubile in acqua (o assorbitore ultravioletto) CoA-bimane (CoA-bimane; figura 2).
  4. Aggiungere 100 l'acido acetico e il vortice in alto per 10 s per fermare la reazione.
  5. Centrifuga a 2.000 x g per 15 minuti per rimuovere qualsiasi precipitante.
  6. Pulire il supernatante utilizzando una colonna SPE per rimuovere il mBBr non reagito (descritto di seguito). La filtrazione e la centrifugazione dell'eluato non sono necessarie dopo la pulizia della colonna SPE (Sezione 5.8).
  7. Raccogliere l'eluato dalla colonna SPE contenente la CoA-bimane in un tubo pre-pesato, asciugare sotto gas di azoto, pesare e costruire una curva di calibrazione standard con quantità note di CoA-bimane.
    1. Controllare lo standard CoA-bimane per la purezza da HPLC (vedi sotto) con rilevamento di assorbimento sia a 260 (moiety adenina) che a 393 (moiety bimane) e coincidenza di entrambi i picchi nel cromatogramma.
    2. Confermare la quantità dello standard CoA-bimane nello stock ad alta concentrazione utilizzando 260 nm (16.800 M-1cm-1).
  8. Registrare il tempo di conservazione HPLC per l'identificazione di CoA-bimane in campioni sperimentali utilizzando lo standard CoA-bimane.
  9. Conservare le aliquote dello stock ad alta concentrazione dello standard CoA-bimane protetto dalla luce e conservato a -20 gradi centigradi per un massimo di 2 anni. Evitare lo scongelamento ripetuto e il nuovo congelamento.

3. Estrazione e derivazione del CoA nelle cellule coltivate

  1. Raccogliere cellule aderenti nella coltura quando si avvicina nolate densità subconfluenti. Ad esempio, le cellule umane HepG2/C3A vengono cresciute fino a una densità di 6-8 x 106o le cellule HEK 293T vengono cresciute fino a una densità di 1,3 x 107 per 100 mm piatto.
    1. Utilizzare regolarmente colture duplicate o triplicate per le determinazioni CoA. Incubare piatti di coltura separati in parallelo con le colture di cellule campione per determinare il numero di cellule vitali. Calcolare la quantità di CoA per 106-107 cellule dopo la purificazione HPLC.
  2. Cultura aspirata mezzo fuori dal piatto. Lavare rapidamente le cellule sul piatto con la salina (PBS) con fosfato freddo ghiaccio per rimuovere qualsiasi mezzo residuo e aspirare il PBS dal piatto. Lavare rapidamente le cellule con acqua ghiacciata per rimuovere il PBS residuo e aspirare rapidamente l'acqua dal piatto. Evitare di disturbare le cellule aderenti quando si aggiunge il PBS o l'acqua.
  3. Aggiungere 1 mL di acqua ghiacciata al piatto di coltura. Raschiare le cellule nell'acqua fredda del piatto e trasferire la sospensione cellulare in una provetta di vetro contenente 400 -L di 0,25 M KOH e 1,5 mL di acqua.
    1. Mescolare vigorosamente la sospensione con vortice alto per 10 s. Quindi coprite con pellicola a paraffina e incubate a 55 gradi centigradi per 1 h senza agitare in un bagno d'acqua. Il pH del campione deve essere di 12. L'elevato pH è importante per idrolizzare i tioetri CoA e può essere regolato con aliquote aggiuntive di KOH se necessario.
  4. Raccogliere cellule coltivate che crescono in sospensione per centrifugazione a bassa velocità: 136 x g per 6 min a 4 gradi centigradi. Lavare una volta con PBS ghiacciato, quindi lavare brevemente di nuovo con acqua fredda, e infine risospendere in 2,5 mL di acqua fredda più 400 .L 0.25 M KOH. Mescolare vigorosamente e incubare a 55 gradi centigradi come descritto sopra.
  5. Aggiungete 160 luna di 1 M Trizma-HCl e 10-L di 100 mM mBBr e mescolate ad alta la piu' a vortice per 10 s. Questo porta il pH a circa 8 per sostenere la reazione mBBr con CoA gratuito. Coprire e incubare campioni a temperatura ambiente per 2 h al buio affinché il mBBr reagisca con il thiol di CoA.
  6. Aggiungere 100 l di acido acetico e mescolare con vortice in alto per 10 s per fermare la reazione
  7. Centrifuga a 2.000 x g per 15 min per rimuovere i detriti delle cellule precipitate.
  8. Rimuovere e salvare il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna SPE descritta di seguito.

4. Estrazione e derivazione del CoA nei tessuti

  1. Dissezionare pezzi di tessuto animale, di circa 0,5 cm di diametro o più piccoli, e macchiare brevemente (1-2 s) su carta assorbente e poi lampeggiare congelare in azoto liquido e conservare a -80 gradi centigradi fino alla lavorazione. Il CoA nei tessuti è idrolizzato o convertito in un tioestro se non flash congelato. Questo passaggio è importante per ottenere la resa massima di CoA nei tessuti.
  2. Pesare i pezzi di tessuto congelato (5 – 60 mg) rapidamente prima di iniziare l'analisi, e registrare il peso per ogni campione. Questa determinazione del peso umido viene utilizzata per il calcolo del contenuto di CoA dopo la purificazione di HPLC. Evitare lo scongelo completo dei pezzi di tessuto.
  3. Aggiungere 2 mL di 1 mM KOH a una provetta di vetro (ad esempio, 13 mm x 100 mm usa e getta) destinata all'inserimento di una sonda e un'interruzione dei tessuti con un omogeneizzatore dello statore. Tenere il tubo sul ghiaccio fino all'uso. Questo viene fatto per garantire che i campioni siano omogeneizzati a temperatura fredda e che il CoA non venga distrutto a causa del calore generato durante l'omogeneizzazione.
  4. Trasferire e omogeneizzare il tessuto (30 – 40 mg) nella provetta di vetro (contenente freddo 1 mM KOH) per 30 s. Evitare lo scongelamento completo del tessuto.
  5. Aggiungere 500 -L di 0,25 M KOH; vortice in alto per 10 s e tenere sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono omogeneizzati. Questo porterà il pH del campione sopra 12 per idrolizzare i tioetri CoA per produrre CoA totale (libero CoA - thioesters CoA idrolizzato).
  6. Incubare campioni a 55 gradi centigradi per 2 h in un bagno d'acqua senza agitare per sostenere l'idrolisi.
  7. Aggiungere 150 luna di 1 M Trizma-HCl e 10 -L di 100 mM mBBr; vortice in alto per 10 secondi. Questo porta il pH a circa 8 per sostenere la reazione mBBr con CoA libero.
  8. Incubare campioni a temperatura ambiente per 2 h al buio per garantire che tutto il CoA sia derivato da mBBr.
  9. Aggiungere 100 l di acido acetico e vortice in alto per 10 s per fermare la reazione.
  10. Centrifuga a 2.000 x g per 15 min a pellet precipitati detriti cellulari.
  11. Rimuovere e salvare il supernatante in una provetta di vetro per la pulizia della colonna SPE (descritta di seguito).

5. Esempio di pulizia con colonna di estrazione di fase solida (SPE)

  1. A temperatura ambiente, eclacazione ogni colonna di gel di silice etimali monouso 2-(2-pyridyl)-ethyl (1 mL di dimensione) con 1 mL di Wash Buffer per garantire che il gruppo funzionale pyridyl sia protonato e funzioni come scambiatore di anion. Il gel di silice in etilice 2-(2-pyridyl) è uno scambiatore di anion debole che è ideale per CoA-bimane in un pH di base. 2-(2-pyridyl)-ethyl silice gel ha un pKa di 6 e l'elusione è fatto pH 7.
  2. Aggiungere il supernatante campione (passaggio 4.11) alla colonna e raccogliere l'eluate.
  3. Lavare la colonna due volte con 1 mL di Wash Buffer per rimuovere eventuali specie non trattenute.
  4. Lavare la colonna una volta con 1 mL di acqua.
  5. Lavare la colonna due volte con 1 mL di Elution Buffer in una provetta di vetro separata (12 mm x 75 mm) per raccogliere la CoA-bimane.
  6. Campione di CoA-bimane a secco nel tubo sotto gas di azoto a secco. Il campione essiccato è stabile a temperatura ambiente fino all'ulteriore utilizzo. Sigillare e coprire completamente il tubo e conservare.
  7. Quando è pronto per l'analisi HPLC, risospendere il campione in 300 gradi di acqua e mescolare vigorosamente con vortice in alto per 10 s.
  8. Trasferire il campione risospeso in un filtro del tubo di centrifuga (acetato di cellulosa 0,22 m, 2 mL di dimensione) e centrifugare a 5.000 x g per 10 min per rimuovere eventuali precipitazioni.
  9. Trasferire il campione filtrato su una fiala di vetro adatta per l'iniezione HPLC.

6. Depurazione e misurazione HPLC di CoA-bimane

  1. Preparare i buffer. Buffer A: 50 mM KH2PO4, pH 4.6; Buffer B: Acetonitrile (Optima Grade).
  2. Alimentare il sistema HPLC.
    NOTA: Il sistema HPLC nel nostro laboratorio è un modulo di separazione Waters e2695 dotato di un rilevatore di assorbimento 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) e di un rilevatore di fluorescenza 2475 controllato con il software Empower 3. Il sistema ha anche un iniettore di campioni automatizzato.
  3. Iniettare ogni campione (ad es., 20 l) per la separazione su una colonna Gemini C18, 3 m 100, 4,6 mm x 150 mm utilizzando il programma nella tabella 1 con una portata di 0,5 mL/min. La temperatura della colonna è di 25 gradi centigradi. Misura l'assorbimento del rivelatore UV/Visibile a 393 nm, e il rilevamento fluorescente a 393 nm, ovvero 470 nm. Il tempo di ritenzione viene determinato eseguendo una curva standard CoA-bimane prima di ogni set di campioni.
  4. Registrare l'area sotto il picco di CoA-bimane per ogni campione e confrontarla con la curva standard per calcolare il pmol di CoA-bimane iniettato sulla colonna HPLC. La curva standard di assorbimento CoA-bimane viene utilizzata per i campioni di tessuto e la curva standard di fluorescenza CoA-bimane viene utilizzata per i campioni di coltura dei tessuti.
  5. Poiché i valori di CoA-bimane rappresentano coA totale per ogni campione, normalizzare al numero di cellule vitali per i campioni di coltura, o peso umido mg per i campioni di tessuto (Figura 6). In alternativa, calcolare i valori coa totali dopo la normalizzazione del DNA o del contenuto proteico per ogni campione. Il DNA o il contenuto proteico possono essere determinati separatamente utilizzando campioni che vengono rimossi durante la preparazione del campione prima dell'aggiunta dell'aliquota.

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Risultati

Un metodo relativamente veloce e affidabile per il rilevamento del CoA totale nelle cellule e nei tessuti coltivati è stato sviluppato derivando il thiol di CoA a un agente fluorescente utilizzando mBBr, e quindi purificando il CoA-bimane derivata utilizzando la fase inversa HPLC. Viene generata per la prima volta una curva standard, in cui quantità note e crescenti dello standard CoA-bimane vengono iniettate singolarmente e le aree sotto i picchi nei cromatogrammi CoA-bimane vengono tracciate in funzione dell'input CoA-...

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Discussione

Qui dimostriamo una procedura affidabile e graduale per quantificare il CoA totale nelle cellule e nei tessuti animali con un'ampia gamma di rilevamenti lineari accessibili in molti laboratori che hanno un HPLC con un rilevatore di uscita di assorbimento o fluorescenza. In alternativa, la spettrometria di massa è una tecnica comune per la valutazione dei tioesteri CoA e CoA, ma non è ampiamente disponibile a causa del costo della strumentazione e delle conoscenze specialistiche necessarie per lo sviluppo della metodologi...

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Dichiarazioni

MWF, CS e SJ hanno scritto il documento, MWF e CS hanno fornito i dati e le figure, COR ha progettato gli esperimenti e ha esaminato criticamente il manoscritto. SJ e COR sono inventori di una domanda di brevetto in sospeso (PCT/US17/39037) "Small molecule modulators of pantothenate kinases" detenuta dal St. Jude Children's Research Hospital che copre il composto di P-2891 a cui si fa riferimento in questo articolo.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono i finanziamenti per la ricerca sponsorizzata fornita da CoA Therapeutics, Inc., una filiale di BridgeBio LLC, la sovvenzione national Institutes of Health GM34496 e gli American Lebanese Syrian Associated Charities.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-(2-piridil)-gel di silice etilica colonna SPEMillipore-Sigma54127-U
coenzimaA Avanti Polar Lipids870700
Gemini C18 3 μ m 100 & Aring; Colonna HPLCPhenomenex00F-4439-E0
monobromobimaneThermoFisher ScientificM-1378
Disgregatore tissutale con sonda Omni-TipOmni International32750H
ParafilmFisherS37440
PowerGen 125 omogeneizzatore statore a rotore motorizzatoThermoFisher ScientificNC0530997
Spin-X filtro per tubo da centrifugaCoStar8161
Trizma-HClFisherT395-1
Waters 2475 rivelatore di fluorescenzaWaters2475
Waters 2489 rivelatore UV-VisWaters2489
Waters e2695 modulo di separazioneWaterse2695

Riferimenti

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