Articolo metodologico
Questo metodo descrive la preparazione del campione da cellule coltivate e tessuti animali, l'estrazione e la derivazione del coenzima A nei campioni, seguita dalla cromatografia liquida ad alta pressione per la purificazione e la quantificazione del coenzima derivato A da rilevamento dell'assorbimento o della fluorescenza.
La ricerca emergente ha rivelato che l'offerta di coenzenzima cellulare A (CoA) può diventare limitante con un impatto negativo sulla crescita, il metabolismo e la sopravvivenza. La misurazione del CoA cellulare è una sfida per la sua relativamente bassa abbondanza e la conversione dinamica di CoA gratuita a CoA thioesters che, a sua volta, partecipano a numerose reazioni metaboliche. Viene descritto un metodo che naviga attraverso potenziali insidie durante la preparazione del campione per produrre un saggio con un'ampia gamma lineare di rilevamento che è adatto per l'uso in molti laboratori biomedici.
Il coenzima A (CoA) è un cofattore essenziale in tutti gli organismi viventi ed è sintetizzato dall'acido panttheico, chiamato anche panttheanato (il sale dell'acido pantonico) o vitamina B5. Il CoA è il principale vettore intracellulare di acidi organici, compresi gli acidi a catena corta come acetato e succinato, acidi a catena di rami come propionato e metilmalo, acidi grassi a catena lunga come palmitato e oleato, acidi grassi a catena molto lunga come acidi grassi polinsaturi e xenobiotici come l'acido valproico. L'acido organico forma un collegamento tioester enzimaticamente con CoA per consentire il suo uso come substrato in oltre 100 reazioni nel metabolismo i....
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La procedura animale di cui al presente protocollo è stata eseguita secondo i protocolli 323 e 556 e specificamente approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del St. Jude Children's Research Hospital.
1. Preparazione delle soluzioni
NOTA: Utilizzare acqua ultrapura per tutte le soluzioni e quando indicato nelle procedure.
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Un metodo relativamente veloce e affidabile per il rilevamento del CoA totale nelle cellule e nei tessuti coltivati è stato sviluppato derivando il thiol di CoA a un agente fluorescente utilizzando mBBr, e quindi purificando il CoA-bimane derivata utilizzando la fase inversa HPLC. Viene generata per la prima volta una curva standard, in cui quantità note e crescenti dello standard CoA-bimane vengono iniettate singolarmente e le aree sotto i picchi nei cromatogrammi CoA-bimane vengono tracciate in funzione dell'input CoA-.......
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Qui dimostriamo una procedura affidabile e graduale per quantificare il CoA totale nelle cellule e nei tessuti animali con un'ampia gamma di rilevamenti lineari accessibili in molti laboratori che hanno un HPLC con un rilevatore di uscita di assorbimento o fluorescenza. In alternativa, la spettrometria di massa è una tecnica comune per la valutazione dei tioesteri CoA e CoA, ma non è ampiamente disponibile a causa del costo della strumentazione e delle conoscenze specialistiche necessarie per lo sviluppo della metodologi.......
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MWF, CS e SJ hanno scritto il documento, MWF e CS hanno fornito i dati e le figure, COR ha progettato gli esperimenti e ha esaminato criticamente il manoscritto. SJ e COR sono inventori di una domanda di brevetto in sospeso (PCT/US17/39037) "Small molecule modulators of pantothenate kinases" detenuta dal St. Jude Children's Research Hospital che copre il composto di P-2891 a cui si fa riferimento in questo articolo.
Gli autori riconoscono i finanziamenti per la ricerca sponsorizzata fornita da CoA Therapeutics, Inc., una filiale di BridgeBio LLC, la sovvenzione national Institutes of Health GM34496 e gli American Lebanese Syrian Associated Charities.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-(2-piridil)-gel di silice etilica colonna SPE | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzima | A Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μ m 100 & Aring; Colonna HPLC | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimane | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Disgregatore tissutale con sonda Omni-Tip | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 omogeneizzatore statore a rotore motorizzato | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X filtro per tubo da centrifuga | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 rivelatore di fluorescenza | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 rivelatore UV-Vis | Waters | 2489 | |
| Waters e2695 modulo di separazione | Waters | e2695 |
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