Patient-härledda Organoid kulturer av bukspottskörteln duktal adenocarcinom är en snabbt etablerad 3-dimensionell modell som representerar epitelial tumör cell fack med hög trohet, möjliggör translationell forskning i denna dödliga malignitet. Här ger vi detaljerade metoder för att etablera och propagera organoider samt för att utföra relevanta biologiska analyser med hjälp av dessa modeller.
Bukspottskörteln duktal adenocarcinom (PDAC) är bland de mest dödliga maligniteter. Nyligen, nästa generations Organoid kultur metoder som möjliggör 3-dimensionell (3D) modellering av denna sjukdom har beskrivits. Patient-härledda Organoid (sub) modeller kan isoleras från både kirurgiska prover samt små biopsier och bilda snabbt i kulturen. Viktigare, Organoid modeller bevara patogena genetiska förändringar upptäcks i patientens tumör och är prediktiva för patientens behandlingssvar, vilket möjliggör translationella studier. Här tillhandahåller vi omfattande protokoll för att anpassa arbetsflödet för vävnadskulturer för att studera 3D, Matrix Embedded, Organoid-modeller. Vi specificerar metoder och överväganden för att isolera och sprida primära PDAC-organoider. Dessutom beskriver vi hur skräddarsydda Organoid media är förberedd och kvalitetskontrollerad i laboratoriet. Slutligen beskriver vi analyser för nedströms karakterisering av Organoid modeller såsom isolering av nukleinsyror (DNA och RNA), och drogtester. Viktigt att vi ger kritiska överväganden för att implementera Organoid metodik i ett forskningslaboratorium.
Pankreas duktal adenocarcinom (PDAC) är en dödlig sjukdom som kännetecknas av sen diagnos hos de flesta patienter, en brist på effektiva terapier, och en resulterande låg 5-års total överlevnad som förblir mindre än 10%1. Endast 20% av patienterna diagnostiseras med en lokaliserad sjukdom som lämpar sig för botande kirurgiska ingrepp2,3. De kvarvarande patienterna behandlas vanligen med en kombination av kemoterapeutiska medel som är effektiva hos en minoritet av patienterna4,5. För att hantera dessa akuta kliniska behov arbetar forskarna aktivt med tidiga detektions strategier och utveckling av effektivare terapier. För att påskynda klinisk översättning av viktiga upptäckter, forskare anställer genetiskt modifierade musmodeller, patient härrör xenografts, enskiktslager celler linjer, och, senast, Organoid modeller6.
Tredimensionell epitelial Organoid kultur med hjälp av tillväxtfaktor och WNT-ligand rika förhållanden för att stimulera spridningen av otransformerade progenitorceller beskrevs först för mus tarmen7 och var snabbt anpassas till normala mänskliga bukspottskörteln vävnad8. Förutom normal duktal vävnad, Organoid metodik möjliggör isolering, expansion, och studier av mänskliga PDAC8. Viktigt, metoden stöder inrättandet av organoider från kirurgiska prover, samt böter och kärna nål biopsier, så att forskarna att studera alla stadier av sjukdomen9,10. Intressant, patient-härledda organoider recapitulate väl beskrivna tumör transcriptomic subtyper och kan möjliggöra utveckling av precisionsmedicin plattformar9,11.
Aktuella Organoid-protokoll för PDAC möjliggör en lyckad expansion av mer än 70% av patientproverna från kemonaiva patienter9. Här presenterar vi de standardmetoder som används av vårt laboratorium för att isolera, expandera och karakterisera patient härledda PDAC-organoider. Andra PDAC Organoid metoder har beskrivits12,13 men ingen jämförelse av denna metod har utförts grundligt. Eftersom denna teknik är relativt ny och framåt snabbt, förväntar vi oss att dessa protokoll kommer att fortsätta att utvecklas och förbättras; men principerna för vävnads hantering och Organoid kultur kommer att fortsätta att vara användbar.
Här presenterar vi aktuella protokoll för att isolera, utvidga och karakterisera patient härledda PDAC-organoider. Vår nuvarande framgång för att etablera Organoid kultur är över 70%; Därför har dessa metoder ännu inte fulländat och förväntas förbättra och utvecklas med tiden. Viktigt övervägande bör ges till provstorlek, som PDAC har en låg neoplastisk cellularitet. Följaktligen, små prover kommer att innehålla några tumörceller, och kommer bara att generera en handfull organoider. Dessutom, må…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för stöd av UC San Diego Moores Cancer Center Biorepository och vävnadsteknik delad resurs, medlemmar av Lowy Laboratory, och UC San Diego Department of kirurgi, avdelningen för kirurgisk onkologi. AML stöds generöst av NIH CA155620, en SU2C CRUK Lustgarten Foundation Pancreatic Cancer Dream Team Award (SU2C-AACR-DT-20-16), och givare till fonden för att bota pankreascancer.
12 channel pipette (p20, p100, or p200) with tips | |||
12 well plates | Olympus | 25-106 | |
15 ml LoBind conical tubes | Eppendorf | EP0030122208 | |
15 ml tube Rotator and/or nutator | |||
37 °C CO2 incubator | |||
37 °C water bath | |||
384 well plates | Corning | 4588 | Ultra low attachment, black and optically clear |
A 83-01 | TOCRIS | 2939 | |
ADV DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Automated cell counter | |||
B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Reagent that depolymerizes the Basement Membrane Extract at 4 °C |
CellTiterGlow | Promega | G7570 | Luminescence cell viability reagent |
Chloroform | Sigma | C2432 | |
Computer | |||
CryoStor CS10 | StemCELL Tech | 07930 | Cell Freezing Solution |
Cultrex R-spondin1 (Rspo1) Cells | Trevigen | 3710-001-K | |
DMEM | ATCC | 30-2002 | |
DNase I | Sigma | D5025 | |
Drug printer | Tecan | D300e | This is the drug printer we use in our laboratory |
Excel | For data analysis | ||
Extra Fine Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
FBS | ThermoFisher | 16000044 | |
G-418 | ThermoFisher | 10131035 | |
Gastrin I (human) | TOCRIS | 3006 | |
Gentle Collagenase/hyaluronidase | STEMCELL Tech | 7919 | |
GlutaMAX | ThermoFisher | 35050061 | Glutamine solution |
GraphPad Prism | For data analysis | ||
HEPES | ThermoFisher | 15140122 | |
Laminar flow tissue culture hood | |||
Luminometer | |||
L-Wnt-3A expressing cells | ATCC | CRL-2647 | |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi biotec | 130-100-008 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356230 | Basement Membrane Extract (BME), growth factor reduced |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
N-Acetylcysteine | Sigma | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
p1000 pipette with tips | |||
p200 pipette with tips | |||
PBS | ThermoFisher | 10010049 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher | 15630080 | |
primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
Rapid-Flow Filter Units (0.2 µm) | ThermoFisher | 121-0020 | |
Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
Sterile Disposable Scalpels, #10 Blade | VWR | 89176-380 | |
Tissue culture centrifuge | |||
Tissue Culture Dishes 10 cm | Olympus | 25-202 | |
TRIZol | ThermoFisher | 15596018 | Acid Phenol solution |
TrypLE Express | ThermoFisher | 12605010 | |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | |
Zeocin | ThermoFisher | R25001 |