Qui descriviamo un metodo affidabile per misurare la massa mitocondriale e il potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche coltivate nell'ex vivo e nelle cellule T.
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Articolo metodologico
Misurazione della massa mitocondriale e del potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche e t-cellule da parte della citometria di flusso
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un raffinato equilibrio di quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione è fondamentale per preservare il pool di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e mantenere la produzione permanente di tutte le cellule del sangue mature. Negli ultimi anni il metabolismo cellulare è emerso come un regolatore cruciale della funzione ESC e del destino. Abbiamo dimostrato in precedenza che la modulazione del metabolismo mitocondriale influenza il destino HSC. In particolare, sganciando chimicamente la catena di trasporto degli elettroni siamo stati in grado di mantenere la funzione HSC in condizioni di coltura che normalmente inducono una rapida differenziazione. Tuttavia, limitare i numeri HSC spesso preclude l'uso di saggi standard per misurare il metabolismo hSC e quindi prevedere la loro funzione. Qui, segnaliamo un semplice saggio di citometria di flusso che consente la misurazione affidabile del potenziale della membrana mitocondriale e della massa mitocondriale in cellule scarse come gli HSC. Discutiamo l'isolamento degli HSC dal midollo osseo del topo e la misurazione della massa mitocondriale e della membrana potenziale cultura post ex vivo. Ad esempio, mostriamo la modulazione di questi parametri in HSC tramite il trattamento con un modulatore metabolico. Inoltre, estendiamo l'applicazione di questa metodologia sulle cellule T derivate dal sangue periferico umano e sui linfociti infiltranti del tumore umano (TIL), mostrando differenze drammatiche nei loro profili mitocondriali, probabilmente riflettendo diverse cellule T Funzionalità. Crediamo che questo saggio possa essere impiegato negli screening per identificare i modulatori del metabolismo mitocondriale in vari tipi di cellule in contesti diversi.
Introduzione
Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono una piccola popolazione di cellule che risiedono nel midollo osseo che assicurano la produzione di sangue e l'omeostasi per tutta la vita di un organismo. Gli HSC mediano questo processo dando origine a progenitori che a loro volta producono lignaggi di cellule del sangue mature differenziate terminalmente tramite diversi cicli di divisione cellulare e passaggi di differenziazione ben orchestrati1. È importante sottolineare che gli HSC producono la loro energia attraverso la glicolisi anaerobica. Al contrario, i progenitori ematopoietici più impegnati e attivi cambiano il loro metabolismo verso il ....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti descritti nel manoscritto seguono le linee guida della nostra istituzione e sono stati effettuati in conformità con la legge svizzera per la sperimentazione animale (Autorizzazione: VD3194) e per la ricerca su campioni umani (Protocollo: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Estrazione di cellule staminali ematopoietiche
- Acquistare topi di tipo selvatico C57BL6/J e tenerli nella casa degli animali per almeno una settimana per ridurre lo stress associato al trasporto.
- Il giorno dell'esperimento, eutanasia il topo usando l'asfissia di CO2.
- Spruzzare il mouse con il 70% di etanolo per ster....
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Risultati
Nella Figura 1 mostriamo la strategia di gating per l'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo del topo e il layout della piastra per la loro cultura ex vivo. La figura 1A mostra l'identificazione della frazione dei linfociti nel grafico SSC-A/FSC-A. I doppietti sono stati rimossi nel cancello singolo seguito dall'identificazione delle cellule vive dall'assenza di segnale DAPI. È stata identificata la popolazione LKS, .......
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Discussione
Una stretta regolazione della funzione HSC è importante per mantenere l'ematopoiesi stabile durante la vita di un organismo. Come vari altri tipi di cellule nel corpo, un componente chiave che contribuisce alla regolazione della funzione HSC è il metabolismo cellulare. Studi precedenti dal nostro laboratorio9 e altri2,3 hanno implicato l'importanza dei mitocondri nel mantenere uno stato metabolico distinto negli HSC. A causa del numero est.......
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Dichiarazioni
Alcuni elementi di questo lavoro sono stati presentati come domanda P1828EP00 all'Ufficio europeo dei brevetti.
Ringraziamenti
Ringraziamo l'UNIL Flow Cytometry Core Facility per il loro sostegno, in particolare il Dr. Romain Bedel. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Kristian Gerhard Jebsen a N.V e O.N.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette FACS da 5 mL | Falcon | 352235 | Preparazione del campione Piastra |
| inferiore 96-U | Corning | 3799 | Separatore |
| AutoMACS pro | Miltenyi Biotec | Separazione cellulare | |
| automatica BD FACS AriaIII | Becton e Dickinson | Selezione cellulare | |
| BD Kit per l'arricchimento cellulare del progenitore ematopoietico di topo | BD | 558451 | Esaurimento del lignaggio |
| BD LSRII | Becton e Dickinson | Macchina di acquisizione FCS | |
| BD-DIVA | Becton e Dickinson | Software di acquisizione | |
| CD150 PE | Biolegend | 115904 | Miscela di colorazione per anticorpi |
| CD150 PE-Cy5 | Biolegend | 115912 | Miscela per la colorazione di anticorpi |
| CD48 PB | Biolegend | 103418 | Miscela colorante anticorpale |
| Centrifuga- 5810R | Eppendorf | Centrifugation | |
| Ckit PeCy7 | Biolegend | 105814 | Miscela di colorazione anticorpale |
| Flow jo | FlowJo LLC | FACS Software di analisi | |
| GraphPad-Prism | GraphPad | Rappresentazione grafica dei dati in grafici | |
| Mitotracker Green | Invitrogen | M7514 | Colorazione mitocondriale fluorescente verde per misurare la massa mitocondriale; concentrazione di lavoro = 100 nM; concentrazione madre = 1 mM |
| Nicotinamide Riboside (NR) | sintetizzato su misura in house | ; concentrazione di lavoro = 500 µ M; Concentrazione madre = 50 mM | |
| PBS | CHUV | Preparazione del tampone; concentrazione di lavoro = 1x; concentrazione madre = 1x | |
| Pen-Strep (P/S) | Life technologies | 15140122 | Coltura ex vivo; concentrazione di lavoro = 1x; concentrazione madre = 1x |
| tampone di lisi RBC | Biolegend | 420301 | Lysing Globuli rossi; concentrazione di lavoro = 1x; concentrazione madre = 10x |
| Ligando ricombinante di topo Flt-3 (FLT3) | RnD | 427-FL-005/CF | Coltura ex vivo; concentrazione di lavoro = 2 ng/mL; concentrazione madre = 10 µ g/mL |
| Fattore di cellule staminali di topo ricombinante (SCF) | RnD | 455-MC-010/CF | Coltura ex vivo; concentrazione di lavoro = 100 ng/mL; concentrazione madre = 50 µ g/mL |
| Sca1 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5981-82 | Miscela di colorazione per anticorpi |
| StemlineII Terreno di espansione per cellule staminali ematopoietiche | SIGMA | S0192 | Coltura ex vivo |
| Streptavidina Pac arancione | Life Technologies | S32365 | Miscela di colorazione per anticorpi |
| Streptavidina Tx rossa | Life Technologies | S872 | Miscela |
| di colorazione per anticorpiTMRM | Invitrogen | T668 | Colorazione del potenziale della membrana mitocondriale; concentrazione di lavoro = 200 nM; concentrazione madre = 10 mM |
| EDTA ultra puro | Invitrogen | 15575-038 | Preparazione del tampone; concentrazione di lavoro = 0,5 M; concentrazione madre = 1 mM |
Riferimenti
- Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
- Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their l....
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Ristampe e permessi
