Articolo metodologico

Analisi spaziale temporale del flusso Fieldwise nella microvascolatura

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DOI:

10.3791/60493

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18 novembre 2019

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1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

In questo articolo

Sommario

Per quantificare il flusso microvascolare dalle sequenze di immagini capillari ad alta velocità, abbiamo sviluppato il software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Nell'intero campo dell'immagine e nel tempo, STAFF valuta le velocità di flusso e genera una sequenza di mappe spaziali codificate a colori per la visualizzazione e l'output tabulare per le analisi quantitative.

Abstract

I cambiamenti nella velocità e nella distribuzione del flusso sanguigno sono fondamentali per mantenere la perfusione di tessuti e organi in risposta a diverse esigenze cellulari. Inoltre, la comparsa di difetti nella microcircolazione può essere un indicatore primario nello sviluppo di più patologie. I progressi nell'imaging ottico hanno reso la microscopia intravitale (IVM) un approccio pratico, permettendo l'imaging a livello cellulare e subcellulare negli animali vivi ad alta velocità nel tempo. Tuttavia, nonostante l'importanza di mantenere un'adeguata perfusione dei tessuti, la variabilità spaziale e temporale nel flusso capillare è raramente documentata. Nell'approccio standard, un piccolo numero di segmenti capillari viene scelto per l'imaging in un periodo di tempo limitato. Per quantificare in modo completo il flusso capillare in modo imparziale, abbiamo sviluppato Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), una macro per il software di analisi delle immagini open source FIJI. Utilizzando sequenze di immagini ad alta velocità di campi completi del flusso sanguigno all'interno dei capillari, STAFF produce immagini che rappresentano il movimento nel tempo chiamate kymographs per ogni intervallo di tempo per ogni segmento vascolare. Dai kymographs STAFF calcola le velocità dalla distanza di spostamento dei globuli rossi nel tempo e restituisce i dati sulla velocità come una sequenza di mappe spaziali codificate a colori per la visualizzazione e l'output tabulare per le analisi quantitative. Nei normali fegati di topo, STAFF analizza profonde differenze di velocità di flusso tra le regioni pericentrali e periportali all'interno dei lobuli. Ancora più inaspettate sono le differenze di velocità di flusso osservate tra i sinusoidi che sono affiancati e le fluttuazioni osservate all'interno di singoli segmenti vascolari nel corso dei secondi. STAFF è un nuovo potente strumento in grado di fornire nuove intuizioni consentendo la misurazione delle complesse dinamiche spatiotemporali del flusso capillare.

Introduzione

La microvascolatura svolge un ruolo fondamentale nella fisiologia, garantendo una perfusione efficace dei tessuti in condizioni mutevoli. Disfunzione microvascolare è associata a una miriade di condizioni tra cui morbilità cardiovascolare a lungo termine e mortalità, sviluppo di demenza, e malattia di fegato e rene e quindi è un fattore chiave di interesse in una vasta gamma di indagini biomediche1,2,3,4,5. Mentre sono state utilizzate più tecniche per valutare la perfusione tissutale, solo la microscopia intravitale consente la raccolta dei dati alla risoluzione temporale e spaziale necessaria per caratterizzare il flusso sanguigno a livello dei singoli capillari.

Il flusso microvascolare può essere visualizzato in microscopia a fluorescenza sia dal movimento delle microsfere fluorescenti che dal movimento dei globuli rossi sullo sfondo di marcatori fluorescenti impersi della membrana (ad esempio, dextran fluorescente o albumin)6,7. Il flusso microvascolare può essere fotografato in strati cellulari superficiali utilizzando la microscopia widefield, o in profondità utilizzando la microscopia confocale o multifotona. Tuttavia, i flussi capillari sono tali che il passaggio dei globuli rossi non può generalmente essere catturato a velocità inferiori a 60 fotogrammi/s. Poiché la maggior parte dei microscopi a scansione laser confocale e multifotona richiedono da 1 a 5 s per eseguire la scansione di un campo immagine completo, questa velocità può generalmente essere raggiunta solo limitando il campo visivo, a volte a una singola linea di scansione8. Il processo di limitazione delle misurazioni a segmenti capillari selezionati (1) ha il potenziale per introdurre una distorsione di selezione e (2) rende impossibile catturare l'eterogeneità spaziale e temporale nei tassi di flusso sanguigno capillare. Al contrario, le immagini delle reti capillari possono essere raccolte a velocità superiori a 100 fps utilizzando microscopi digitali widefield dotati di telecamere scientifiche a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS)9,10. Questi sistemi poco costosi, comuni nei tipici laboratori biomedici, consentono di immaginare il flusso microvascolare attraverso intere reti bidimensionali, essenzialmente continuamente. Il problema diventa quindi quello di trovare un approccio di analisi in grado di estrarre dati quantitativi significativi dai set di dati di immagini massicci e complessi generati dalla microscopia video ad alta velocità.

Per consentire l'analisi dei dati di flusso a campo completo abbiamo sviluppato STAFF, un nuovo software di analisi delle immagini in grado di misurare continuamente il flusso microvascolare in interi campi al microscopio delle serie di immagini raccolte ad alta velocità11. L'approccio è compatibile con una varietà di diversi sistemi sperimentali e modalità di imaging e il software di analisi delle immagini STAFF è implementato come un set di strumenti macro per l'implementazione FIJI di ImageJ12. Il principio di base usato qui per visualizzare il flusso microvascolare è che in primo luogo, qualche contrasto deve essere fornito per essere in grado di immaginare i globuli rossi all'interno dei capillari. Nei nostri studi, il contrasto è fornito da una sonda fluorescente sfusa che è esclusa dai globuli rossi. La velocità di flusso può quindi essere quantificata dallo spostamento dei globuli rossi che appaiono come una macchia negativa all'interno del plasma fluorescente in immagini raccolte ad alta velocità da un animale vivente8. Usiamo quindi STAFF per fare tracciati di distanza lungo ogni segmento capillare su più intervalli di tempo chiamati kymographs, quindi rileviamo le pendenze presenti nei kymografi13,e da quelle pendenze calcoliamo i tassi di flusso microvascolare. L'approccio può essere applicato alle immagini raccolte da qualsiasi letto capillare accessibile per l'imaging. Qui descriviamo l'applicazione di IVM e STAFF agli studi del flusso sanguigno nel fegato.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti secondo le linee guida del Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università dell'Indiana, e hanno aderito alla guida NRC per la cura e l'uso degli animali.

1. Preparazione chirurgica per la microscopia intravitale

NOT: Questo non è un intervento di sopravvivenza. Una volta iniziata la sezione 1 "Preparazione chirurgica per la microscopia intravitale", i lavori non possono essere sospesi fino al completamento della sezione 2 "Microscopia intravitale".

  1. Acclimatare 9-10 settimana-vecchio maschio C57BL/6 topi, per almeno 4 giorni e veloce per 16 h prima degli studi.
  2. Pesare l'animale, sedare con 5% isoflurane e posto su un pad di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea. Utilizzare una portata di ossigeno di 1–2 L/min e mantenere la sedazione con 1-2% isoflurane. Controllare i riflessi con il pizzico dei dii dati. Monitorare la temperatura utilizzando un termometro rettale. Monitorare visivamente la frequenza cardiaca e la respirazione.
  3. Quando l'anestesia è stabile, radere l'area per il posizionamento della canululation giugulare e l'area sotto la gabbia toracica per l'esposizione del fegato.
  4. Per la canonazione giugulare, fare un 1 cm di incisione ventrale sinistra 1–2 cm sotto la mascella del topo. Cancellare tutto il grasso e la fascia che circonda la vena giugulare. Legare l'estremità anteriore della giugulare utilizzando una corda di sutura 06 per evitare sanguinamento.
    1. Fare un piccolo nick nella vena giugulare e far scorrere la cannula (30 G x 1/2 in, ago), portaago e tubo di polietilene (0.011 x 0.024 pollici2 attaccato a un adattatore Luer stub e riempito con 0.9% saline) in circa 1 cm, e fissare all'estremità posteriore della lunghezza giugulare utilizzando 0-6 sutura.
  5. Utilizzando la cannula giugulare fornire 70 kDa fluorescein adextran (a una dose di 30 mg/kg tramite iniezione di 0,1 mL di una soluzione 9 mg/mL in salina).
  6. Esporre il fegato per l'imaging facendo un'incisione di 4-6 cm sul busto, 1–2 cm sotto il centro della gabbia toracica.
  7. Mettere una spugna bagnata (imbevuta di 0,9% salina) 2 x 2 pollici2 spugna di garza sotto il lobo del fegato laterale sinistro. Posizionare il nastro alla periferia della vetrata di una teglia con fondo coprinte da 40 mm e applicare l'adesivo cianoacrilato sul nastro. Premere la lastra di vetro sul fegato e utilizzando applicatori con punta di cotone premere la garza nella colla sul nastro per ridurre al minimo il movimento del tessuto per la microscopia.
  8. Spostare l'animale allo stadio del microscopio. Aggiungere sterile 0,9% saline nella parabola dal fondo del coperchio per mantenere il fegato umido per tutta la sessione di imaging. Mantenere la temperatura a 36-37 gradi centigradi tramite cuscinetti di riscaldamento montati sul palco, un supporto riscaldante posto sopra l'animale e un riscaldatore obiettivo.

2. Microscopia intravitale

  1. Esegui la microscopia intravitale su un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di una videocamera in grado di catturare immagini ad alta velocità.
    NOT: Qui, una lampada ad arco Xenon, un'eccitazione specifica per la fluoresceina (480-500 nm) e filtri di emissione (507-543 nm), Plan Fluor 20x, N.A. 0.75, e una telecamera sCMOS ad alta velocità sono stati utilizzati.
  2. Selezionare l'area di interesse per l'analisi del flusso sanguigno capillare utilizzando un'illuminazione minima.
  3. Impostare il tempo di esposizione sufficientemente breve per la fotocamera per essere in grado di acquisire 100 fps. Impostare il livello di illuminazione per visualizzare chiaramente le ombre dei globuli rossi e la topologia della vascolatura, evitando al contempo la fototossicità e il fotosbiancamento della sonda fluorescente.
  4. Raccogli immagini a una velocità di 100 fps. Impostare la risoluzione dei pixel della fotocamera tra 0,65 e 1,3 m/pixel. Impostare le dimensioni del fotogramma tra 512 x 512 e 1024 x 1024 pixel. Impostare la profondità di bit tra 8 e 16 bit. Usa la risoluzione più alta, le dimensioni del fotogramma e la profondità di bit che consentono comunque la raccolta di immagini a 100 fps nel sistema.
  5. Salva i file della serie temporale come sequenza di file TIF o come formato nativo di fotocamera/microscopio se Bio-Formats14 in FIJI può aprire i file in formato nativo.
  6. Immagine di più aree nel tempo. Mantenere il mouse sullo stadio del microscopio fino a 2 h. Eutanasia il mouse alla fine dell'imaging.
    NOT: La durata della serie temporale sarà basata sul bilanciamento della necessità di immagine per un intervallo di tempo che abbraccia la variabilità, senza influenzare la vitalità del tessuto. La durata della serie temporale può anche essere dettata da considerazioni sulle dimensioni dei file; una serie temporale di 1 min di 1024 x 1024 immagini a 16 bit di pixel raccolte a 100 fps genererà un file di 12 GB di dimensioni. Le considerazioni sulle dimensioni dei file possono anche determinare le dimensioni dei fotogrammi e la profondità di bit utilizzate. Non esistono limiti di dimensione espliciti all'interno di STAFF.

3. Definire la rete vascolare utilizzando TrakEM2 in FIJI

NOT: Il protocollo può essere sospeso dopo aver salvato il lavoro in qualsiasi punto della sezione 3.

  1. Scaricare e installare FIJI da https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    NOT: La versione 1.51n delle Figi è stata utilizzata per questo progetto e può essere scaricata da https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Si noti che in Windows, FIJI deve essere installato nello spazio utente e non in Programmi.
  2. Aprite il file filmato in FIJI utilizzando File > Apri o File > Importa > Sequenzaimmagini. Selezionare una singola immagine dalle immagini stabili tra le respirazioni in cui la topologia della rete vascolare è facile da vedere. Selezionate Immagine > Duplica e duplica la singola immagine selezionata (non la pila) e salvate l'immagine in una nuova cartella. Non includere spazi nei nomi di file o cartelle.
  3. Impostare un nuovo progetto TrakEM2 vuoto selezionando File > Nuovo > TrakEM2 (vuoto). Selezionare la nuova cartella contenente la singola immagine del filmato come cartella del progetto. Si apriranno le finestre TrakEM2.
  4. Fare clic con il pulsante destro del mouse nell'area di lavoro principale e selezionare Importa > Importa immagine. Passare alla singola immagine salvata nel passaggio 3.3 e selezionarla.
  5. Fare nuovamente clic con il pulsante destro del mouse nell'area di lavoro principale e selezionare Visualizza > Adatta a livello canvas/insieme di livelli . Fare clic con il pulsante sinistro del mouse nella finestra di lavoro principale. L'immagine riempirà l'area di lavoro.
  6. Per selezionare le aree dell'immagine che contengono la rete vascolare, la selezione dell'area di configurazione in TrakEM2. Nella finestra TrakEM2 più piccola (Modello, Oggetti progetto, Layer) fare clic con il pulsante destro del mouse su "- qualsiasi cosa". Selezionare Aggiungi nuovo figlio > elenco aree.
  7. Nella finestra TrakEM2 più piccola, trascinare "Modello > qualsiasi cosa" su "Oggetti progetto > progetto". Quindi trascinare "Modello > qualsiasi cosa > elenco area" su "Oggetti progetto > progetto > qualsiasi cosa". In "Oggetti di progetto > progetto > qualsiasi cosa", sarà ora presente l'elenco delle aree.
  8. Nella finestra principale di TrakEM2, sotto la scheda spazio ,è stata creata una barra con etichetta elenco area. Fare clic per selezionarlo. Nella finestra principale di TrakEM2 selezionare anche lo strumento pennello. Premete Maiusc e ruotate la rotellina del mouse per selezionare una dimensione appropriata per il pennello, ad esempio inferiore al diametro della vascolatura. Per salvare l'installazione di TrakEM2, premere i tasti Ctrl e S.
  9. Dipingere la rete vascolare con lo strumento pennello. Per cancellare tenere premuto Alt mentre si utilizza lo strumento pennello. Non includere aree sfocate. Salvare spesso utilizzando ctrl .
  10. Al termine dell'etichettatura della rete vascolare, fare clic con il pulsante destro del mouse nella finestra principale di TrakEM2 e selezionare Esporta > Elenchi area come etichette (tif). Nella finestra popup selezionare Scala 100% ed Esporta tutto area elenco . Chiudere le finestre di TrakEM2 e scegliere Sì per Salva progetto.
  11. L'immagine di AreaLists si aprirà e potrebbe apparire come un'immagine nera vuota. Nel menu FIJI principale, selezionare Immagine > Regola > Luminosità/Contrasto. Nella finestra B&C premere il pulsante automatico e Il ListArea diventerà visibile. Nel menu FIJI principale selezionare Immagine > Tabelle di ricerca > Inverti LUT. Salvare questa immagine delle etichette nere su sfondo bianco e chiudere l'immagine.
  12. Aprire il file di etichette in FIJI. Selezionare Plugin > Scheletro > Scheletro. Salvare l'immagine scheletrata come tif. Utilizzare il file skeleton.tif come uno dei file di input necessari per eseguire l'analisi del flusso STAFF. Quando si salva il file, non utilizzare spazi nel nome del file.
  13. Modificare manualmente il file di ossatura in base alle esigenze, inserendo uno spazio (utilizzando lo strumento di disegno) nel disegno a linee, ad esempio nelle posizioni in cui i rami nella vascolatura non sono stati catturati perché escono dal piano dell'immagine.

4. Preparare la sequenza di filmati per l'analisi STAFF

  1. Aprite il file filmato in FIJI utilizzando File > Apri o File > Importa > Sequenza immagini. Selezionare un periodo di tempo della sequenza di immagini per l'analisi del flusso (può essere da secondi a minuti, da centinaia a decine di migliaia di fotogrammi) in cui la posizione del tessuto è rimasta stabile nel tempo, ad eccezione della respirazione.
  2. Selezionate Immagine > Duplica e duplicate la parte selezionata della sequenza digitando i numeri dei fotogrammi iniziale e finale. Controllare la calibrazione spaziale e temporale dell'immagine in Immagine > Proprietà e correggere se necessario. Salvare il file di immagine come TIF (o come AVI non compresso). Questo movie.tif è necessario come file di input per eseguire l'analisi STAFF. Non includere spazi nel nome del file.

5. Installare le macro STAFF in FIJI

NOTA: (Importante) Più cartelle all'interno delle sottodirectory della cartella FIJI hanno nomi di file simili, alcuni in maiuscolo, alcuni no. Assicurarsi che durante l'installazione di STAFF siano selezionate le cartelle corrette.

  1. Scaricare le macro STAFF da https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. Per eseguire l'installazione, aprire innanzitutto la cartella FIJI.
    1. In Windows trovare la cartella in cui è installato FIJI nello spazio utente, più comunemente sul desktop. Su MacOS trovare l'icona FIJI nella cartella Applicazioni, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Apri.
  3. Nella cartella FIJI, apri la cartella plugins. All'interno della cartella plugin, aprire la cartella Macro. Copiare STAFF.ijm in questa cartella Macros: Fiji-plugins'Macros'STAFF.ijm.
  4. Nella cartella FIJI, apri la cartella plugins. Copiare STAFF_Dir.jar in questa cartella plugins: Fiji plugins STAFF_Dir.jar.
  5. Nella cartella FIJI, aprire la cartella delle macro. All'interno di questa cartella delle macro, aprire la cartella AutoRun. Copiare STAFF_Loader.ijm in questa cartella autoRun: Fiji, macros, AutoRun, STAFF_Loader.ijm.
  6. Avviare FIJI e verificare l'installazione delle macro. Per verificare l'installazione, selezionare Plugin > Macro. Se installato correttamente, il menu a discesa includerà: Apri-Crea progetto, Analizza scheletro, Modifica intervalli di tempo, Analizza flusso e Produci mappa spaziale.
  7. Se questi comandi non sono presenti nel menu Macro, selezionare Plugin > Macro > Installa, aprire la cartella Fiji-plugins-Macros, selezionare il file STAFF.ijm, quindi fare clic sul pulsante OK. I comandi dovrebbero ora essere visualizzati nel menu Plugin > Macro.

6. Quantificare il flusso vascolare utilizzando STAFF

  1. Creare un nuovo progetto.
    1. Selezionare Plugin > Macro > Apri-Crea progetto e seguire le istruzioni per creare o aggiornare un file di configurazione.
    2. Dal menu Apri-Crea progetto, individuare e selezionare la directory del progetto, la cartella dei file di input e i file di input Movie.tif e Skeleton.tif. Se necessario, modificare i nomi dei file di output compilati automaticamente.
    3. Valori di input per la lunghezza del segmento più breve (20 m), la velocità massima misurata (2.000 m/s) e la velocità massima mappata (1.000 m/s).
      NOT: Il prodotto della lunghezza del segmento più breve e dei fotogrammi al secondo fornisce la velocità massima di flusso che può teoricamente essere misurata. Le velocità di flusso capillari più elevate riportate in letteratura sono di circa 2.000 m/s15. Nel fegato, abbiamo osservato che la velocità di flusso capillare generalmente era di circa 300 m/s e raramente superava i 1.000 m/s.
    4. Digitate i valori per le dimensioni in pixel e la frequenza fotogrammi per la sequenza di immagini (dai metadati dell'immagine o dalle note sperimentali). Questi valori richiedono l'input dell'utente. Selezionare la casella Correzione sfarfallio se le immagini presentano uno sfarfallio periodico dell'intensità dello sfondo.
    5. Selezionare i parametri per la migliore visualizzazione dei dati. Selezionare la velocità massima mappata per includere circa il 95% dei dati in modo che i dati vengano mappati nell'intera gamma della scala dei colori. STAFF associa gli outlier ad alta velocità all'estremità ad alta velocità della scala dei colori.
  2. Analizza lo scheletro.
    1. Selezionare Plugin > Macro > Analizza scheletro. Si aprirà il file skeleton.tif e il gestore della Regione di interesse (ROI) si aprirà ed eseguirà.
      NOT: Analizza scheletro classifica ogni pixel in base al numero di vicini come punto finale, in corrispondenza di una giunzione o all'interno di un segmento. Per ogni segmento vengono registrati un numero identificativa (numero ID), una lunghezza di diramazione calibrata e le coordinate spaziali delle estremità del ramo.
    2. Attendete che gli ID segmento vengano visualizzati sull'ossatura, che l'elenco dei segmenti venga visualizzato nel gestore del ROI e che venga salvato un popup che indica che viene salvato il file di Gestione ROI per la scheletro. Fare clic su OK.
    3. Verificare che tra i movimenti respiratori, lo scheletro rimane sopra dove i globuli rossi passano attraverso il capillare (ad esempio, non il bordo e non al di fuori del capillare). Visualizzare i segmenti etichettati come sovrapposizione sul filmato, aprendo il file del filmato, quindi trascinando il file zip ROI sul filmato aperto. Riprodurre il filmato con i segmenti sovrapposti.
  3. Selezionare gli intervalli di tempo.
    1. Selezionare Plugin > Macro > Seleziona intervallidi tempo . Attendere mentre la macro genera un kymografo da un singolo segmento nel tempo totale per il filmato. Da questo kymograph, l'utente seleziona gli intervalli di tempo per l'analisi. Usa i tasti Ctrl e s per aumentare le dimensioni del kymograph, se necessario.
    2. Lo strumento di selezione rettangolo viene attivato automaticamente. Disegnare un rettangolo intorno a ogni intervallo di tempo. Un buon punto di partenza per la lunghezza dell'intervallo di tempo è l'intervallo di 1–2 s tra le respirazioni, che sono evidenti come regioni sfocate orizzontali nel kymograph.
    3. Fare clic sul tasto T o sul pulsante Aggiungi nel gestore ROI per registrare le selezioni dell'intervallo di tempo. Ripetere l'operazione per tutti gli intervalli di tempo desiderati. Effettuare le selezioni in sequenza dall'alto (o a sinistra) al basso (o a destra) del kymograph.
    4. Valutare le scelte dei parametri (da Apri-Crea progetto) selezionando un numero ridotto di intervalli di tempo (da 3 a 4) e completando l'analisi solo per tali intervalli, poiché L'analisi del flusso (il passaggio successivo) può richiedere ore per set di dati di grandi dimensioni.
    5. Al termine, fare clic su OK nella finestra Crea un ROI per ogni intervallo di tempo. Quando gli intervalli selezionati sono stati salvati nella cartella del progetto,viene visualizzata una finestra popup. Fare clic su OK.
  4. Analizzare il flusso.
    1. Selezionare Plugin > Macro > Analizza flusso e la finestra di dialogo Analizza parametri di flusso e visualizza i valori immessi nel passaggio Apri-Crea progetto. Modificare se necessario, quindi fare clic su OK.
    2. Viene visualizzata la finestra di dialogo Nomi file di output con i nomi immessi nel passaggio Apri-Crea progetto. Modificare se necessario, quindi fare clic su OK.
    3. Viene visualizzata una finestra di dialogo in cui viene chiesto se l'utente è pronto per iniziare l'analisi. Fare clic su OK e l'analisi inizierà. Attendere che venga visualizzata una finestra di dialogo che indica quando l'analisi del flusso è stata completata.
      NOT: Il tempo necessario dipende dalla velocità del processore e dalle dimensioni del set di dati.
    4. Verificare che i file dei risultati siano stati memorizzati come file di foglio di calcolo in formato CSV nella cartella progetto.
      NOT: I file di output includono: segment_velocities.csv contiene valori di velocità con valori positivi e negativi che indicano la direzione del flusso. Le celle che rappresentano segmenti inferiori alla lunghezza minima contengono il testo SHORT. Le celle con valori di velocità maggiori della velocità massima misurata contengono il testo OUT (per outlier). kym_ang.csv contiene angoli kymografici misurati dal plug-in Direzionalità in FIJI. good_fit.csv contiene bontà di adattamento di una curva alla distribuzione degli angoli misurati da ogni kymograph. La scarsa bontà di adattamento (< 0.8) può indicare punti di diramazione nascosti in un segmento, variazione di velocità durante l'intervallo di tempo, la lampada o lo sfarfallio della luce della stanza.
    5. Verificare che segment_velocities.csv contenga alcuni valori OUT. Se è presente un numero elevato di valori OUT, verificare che la lunghezza minima del segmento da analizzare non sia inferiore a 15-20 m, quindi eseguire nuovamente Analizza flusso. Se il nuovo segment_velocities.csv contiene ancora una grande percentuale di valori OUT, selezionare la casella di correzione dello sfarfallio, quindi eseguire nuovamente Analizza flusso.
  5. Produrre mappe spaziali.
    1. Selezionare Plugin > Macro > Produci mappa spaziale e si aprirà la finestra Parametri mappa spaziale, con i valori immessi nel passaggio Apri progetto. Modificare se necessario, o per continuare selezionare OK.
    2. Osservate come viene generata una sequenza temporale di mappe spaziali delle velocità di flusso con il colore che indica la velocità di flusso. L'output è sotto forma di una pila di immagini .tif con un'immagine per ogni intervallo di tempo. Scorrere lo stack .tif per visualizzare la variazione spaziale e temporale nel flusso. Salvare lo stack come file AVI (non compresso per la massima portabilità) da condividere come filmato.

7. Analisi quantitativa mediante output STAFF

  1. Aprire il file segment_velocities.csv in un foglio di calcolo o in un programma di analisi statistica. Questi valori hanno un segno positivo o negativo che indica la direzione del flusso rispetto ai punti di inizio/arresto di tale segmento (registrati nel file ROI del segmento).
  2. Creare una nuova pagina del foglio di calcolo contenente i valori assoluti di tutti i valori di velocità. Utilizzare questi valori per calcolare la velocità media complessiva del flusso, la velocità media del flusso per tutti i segmenti vascolari nel tempo, la velocità di flusso per ogni segmento vascolare nel tempo e creare istogrammi delle distribuzioni di velocità.
  3. Calcolare i valori relativi a regioni morfologiche specifiche o ad altre regioni di interesse individuando prima i segmenti rilevanti specifici nell'ossatura etichettata e quindi eseguendo analisi su questi segmenti selezionati.

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Risultati

L'analisi STAFF genera un censimento completo delle velocità microvascolari su interi campi del microscopio per periodi di tempo che si estendono da secondi a minuti. I risultati rappresentativi sono presentati in Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4. La figura 1 mostra un esempio di una serie temporale della rete microvascolare nel fegato di un topo, la generazione dell'...

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Discussione

In questo protocollo sono previsti più passaggi critici. In primo luogo, la minimizzazione del movimento durante l'imaging intravitale del fegato è essenziale per generare filmati che sono utilizzabili per l'analisi del flusso capillare utilizzando STAFF. A causa della vicinanza del diaframma, si verificano brevi periodi di movimento indotta dalla respirazione, con il fegato assicurato che ritorna alla sua posizione iniziale dopo ogni respiro. Fissare il fegato a comparsa chirurgica contro la parabola dal fondo del coper...

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Dichiarazioni

Gli autori non riferiscono interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Gli studi qui presentati sono stati sostenuti dai finanziamenti dei National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 e NIH NIDDK P30 DK079312). Gli studi di microscopia intravitale sono stati condotti presso l'Indiana Center for Biological Microscopy. Ringraziamo il Dr. Malgorzata Kamocka per assistenza tecnica con microscopia.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#5 pinzeFine Science Tools11251-20Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 topiJackson Labsmaschio 9-12 settimane
CannulaInstechBTPE-10Tubo in polietilene 0,011 x 0,024 pollici
Fotocamera CMOSHamamatsuC11440-42U304.0LT Scientific CMOS
Piatto con fondo coprioggettoMicroscopia elettronica SciencesWillCo Dish fondo in vetro GWST5040
Forbici da dissezioneFine Science Tools
Fiji ImageJ Softwaredi analisi delle immagini https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Destrano di fluoresceinaThermo Fisher, InvitrogenD1822Dextran, Fluoresceina, 70.000 MW, Anionico, Lisina Fissabile
Spugna di garzaFisher22-415-5042x2 pollici Dukal spugne di garza sterili
Pad riscaldanteReptithermRH-4tra mouse e palco
Pad riscaldanteSunbeam000732-500-000Usopra il mouse
Microscopio a epifluorescenza invertitoNikonNikon TiE microscopio invertito
Isis Rasoio elettrico per roditoriBraun AesculapGT420
IsofluoraneAbbott GmbHPZN4831850
Luer adattatore per tronchettoFisher14-826-19EAdattatore per catetere
Micro forbiciCastro Viejo
Obiettivo per microscopioNikonPlan Fluor 20x, NA 0,75 ago ad immersione in acqua
Fisher30 G x1/2"
Ago supportoOlsen-Hegar
Riscaldatore dell'obiettivoBioScience ToolsMTC-HLS-025Regolatore di temperatura con riscaldatore dell'obiettivo
Termometro rettaleBraintree Scientific, INCTH-5AMonitoraggio della temperatura corporea del topo
Macrohttps://github.com/icbm-iupui/STAFF
Stringa di suturaHarvard Bioscience723288sutura nera in seta, 6-0, bobina
del personale

Riferimenti

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156(2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369(1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052(2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106(2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

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