Summary
Biz farelerde aşırı eğitim ve korku kuluçka üreten genişletilmiş bir korku klima protokolü açıklar. Bu protokol, 25 ton-şok eşleşmeleri (yani, aşırı eğitim) ve bağlam ve işaret testleri sırasında koşullu donma yanıtlarının eğitimden sonra 48 saat (kısa süreli) ve 6 hafta (uzun süreli) karşılaştırılması ile tek bir eğitim seansı gerektirir.
Abstract
Duygusal bellek öncelikle korku-klima paradigmaları ile çalışılmıştır. Korku koşullandırması, bireylerin aversive olaylar ve başka bir şekilde nötr uyaranlar arasındaki ilişkileri öğrendikleri bir öğrenme biçimidir. Duygusal anıları incelemek için en yaygın olarak kullanılan prosedürler farelerde korku klima gerektirir. Bu görevlerde, koşulsuz uyarıcı (ABD) tek veya birkaç seans boyunca bir veya birkaç kez sunulan bir ayak şokudur ve koşullu yanıt (CR) donuyor. Bu prosedürlerin bir sürümünde, cued korku klima denilen, bir sesi (şartlı uyarıcı, CS) eğitim aşamasında ayak şokları (ABD) ile eşlenir. İlk test sırasında hayvanlar eğitimin gerçekleştiği bağlamın aynısına maruz kalır lar ve ayak şoku ve tonları (yani bağlam testi) yokluğunda donma yanıtları test edilir. İkinci test sırasında, bağlam değiştirildiğinde (örneğin, deney odasının kokusu ve duvarları manipüle edilerek) donma ölçülür ve ayak şoku (yani bir işaret testi) yokluğunda tonu sunulur. En cued korku klima prosedürleri birkaç ton-şok eşleşmeleri (örneğin, tek bir oturumda 1-3 deneme) gerektirir. Korku kuluçka (yani, korku tepkileri daha fazla maruz kalmadan zaman içinde artış) denilen uzun süreli etkisi ile ilgili eşleştirmeler (yani, aşırı eğitim) geniş bir sayı içeren daha az yaygın sürümleri artan bir ilgi vardır. Korku-koşullandırma görevleri, korku kuluçkasının diğer psikolojik fenomenlerle (örneğin travma sonrası stres bozukluğu) ilişkisi de dahil olmak üzere davranışsal ve nörobiyolojik yönlerini anlamanın anahtarı olmuştur. Burada, farelerde aşırı eğitim ve korku kuluçka üreten uzun bir korku koşullandırma protokolünü tanımlıyoruz. Bu protokol, 25 ton-şok eşleşmeleri (yani, aşırı eğitim) ve bağlam ve işaret testleri sırasında koşullu donma yanıtlarının eğitimden sonra 48 saat (kısa süreli) ve 6 hafta (uzun süreli) karşılaştırılması ile tek bir eğitim seansı gerektirir.
Introduction
Bellek farklı aşamaları kapsayan psikolojik bir süreçtir: bilgi edinimi, konsolidasyon (elde edilen bilgilerin istikrarı için izin verir) ve alma (konsolidasyon süreci için kanıt)1. Konsolidasyon aşamasında, yeni sinaptik bağlantıların kurulması ve önceden varolan bağlantıların değiştirilmesi gerçekleşir. Bu, bu değişikliklerden sorumlu moleküler ve fizyolojik olayların meydana geldiği bir süre için gerekliliği göstermektedir1,2. Bu fizyolojik veya moleküler değişiklikler, alınan olayların duygusal olarak yüklü olup olmadığını (yani duygusal hafıza) değiştirir. Örneğin, araştırma lateral çekirdek ve bazolateral amigdala kompleksi özellikle duygusalbellek3,4,5ilgili olduğunu göstermiştir .
Duygusal bellek fenomenleri öncelikle korku koşullandırma paradigmaları ile incelenmiştir5,6. Korku koşullandırma, bireylerin aversive olaylar ve aksi takdirde nötr uyaranlar arasındaki ilişkileri öğrenmek hangi öğrenme şeklidir7. Korku koşullandırma paradigmaları amigdalamoleküler, hücresel ve yapısal değişiklikler üretir. Buna ek olarak, korku klima duygusal bellek konsolidasyon ve alma süreçleri sırasında hipokampus bağlantısını değiştirir.
Korku anılarını incelemek için en sık kullanılan yöntemlerden biri sıçanlarda klasik (Pavlovian) klima. Bu prosedür genellikle bir veya birkaç seans boyunca bir veya birkaç kez teslim edilir aversive uyarıcı olarak footshock (ABD) kullanır. Bu prosedüre maruz kalan sıçanların koşullu tepkisi (CR) donma (yani, "hayvanların iskelet kaslarının solunumda kullanılan kaslar dışında genelleştirilmiş bir tonik tepkisinden kaynaklanan yaygın hareketsizlik"7). Bu yanıt iki tür testte değerlendirilebilir: bağlam ve işaret testleri. Bağlam testi için, konu eğitim oturumu sırasında belirli sayıda ayak şokundan geçer ve daha sonra belirli bir süre için deneysel odadan çıkarılır. Test sırasında, konu eğitimin gerçekleştiği bağlamına geri döndürülür ve ayak şoku (örneğin, donma ataklarının süresi, yüzdesi veya sıklığı) yokluğunda ve eğitim aşamasında belirlenen temel düzeylerle karşılaştırıldığında farklı donma önlemleri toplanır. Test, işaret testi, bir uyarıcı (genellikle bir ton) ikinci tip için eğitim aşamasında ayak şokları ile eşleştirilmiş (yani, koşullu uyarıcı, CS). Eğitim tamamlandıktan sonra, hayvan belirli bir süre için eğitim bağlamından çıkarılır ve daha sonra değiştirilmiş bir bağlamda yerleştirilir (örneğin, farklı şekillerde duvarlar ait ve farklı kokuya sahip farklı bir deneysel oda). Daha sonra işaret belirli bir sayıda sunulur ve işarete verilen donma yanıtları ölçülür ve eğitim sırasında toplanan temel düzeylere göre karşılaştırılır. Bu paradigmanın en yaygın sürümü, tek bir eğitim oturumu sırasında 1 ila 3 ton-şok eşleşmeleri kullanır, ardından bağlam ve işaret testleri birkaç saat veya birkaç gün sonra yapılır.
Diğer daha az sıklıkta uygulanan korku klima prosedürleri şok-isteka eşleşmeleri geniş bir sayı içerir (örneğin, denemeler), genellikle aşırı eğitimprosedürleri8 çağrıldı . Bu görevlerde artan bir ilgi korku kuluçka denilen uzun ömürlü ve artan bellek etkileri ile ilgilidir (yani, önsezif olaylar veya koşullu uyaranlara daha fazla maruz kalma yokluğunda zaman içinde şartlı korku tepkileri artış)9,10,11. Bu tür aşırı eğitim prosedürleri bir örnek 10 oturumlar arasında dağıtılan 100 ton-şok eşleştirmeleri bir eğitim aşaması gerektirir, bağlam ve işaret testleri 48 h ve 30 gün sonra11,12yapılan izledi . Birkaç gün boyunca yaygın eğitim önlemek için, Maren (1998) aşırı eğitim kurulmuş ve 25 eşleşmeleri8ile tek bir oturumda optimize olabileceğini bildirdi. Kuluçka etkisi, eğitimden 31 gün sonra test edilen sıçanlarda önemli ölçüde daha yüksek oranda şartlı korku yla kanıtlanmıştır, çünkü 48 saat sonra test edilen sıçanlara kıyasla. Genişletilmiş korku-klima görevleri diğer psikolojik olaylar (örneğin, gecikmiş başlangıçlı travma sonrası stres bozukluğu)11,12,13ile ilişkisi de dahil olmak üzere, korku kuluçka altında yatan davranışsal ve nörobiyolojik yönlerini anlamak için anahtar olmuştur.
Burada, farelerde aşırı eğitim ve korku kuluçka neden uzun bir korku klima protokolü açıklar. Eğitim birkaç gün gerektiren diğer paradigmalar farklı11,mevcut protokol tek bir eğitim oturumu8odaklanmıştır. Biz bağlam ve işaret testleri sırasında daha yüksek koşullu dondurma yanıtları üretmek için 25 ton-şok eşleşmeleri kullanılan eğitimden sonra 6 hafta yapılan, testler 48 saat sonra yapılan karşılaştırıldığında.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol Fundación Universitaria Konrad Lorenz (IACUC-KL) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. İsviçre'nin Cenevre kentinde ki Uluslararası Hayvan Hakları Birliği (1989) tarafından yayınlanan evrensel hayvan hakları bildirgesi ve ICLAS tarafından çıkarılan hayvanlarla yapılan deneylerin etik ilkelerine saygı gösterilmiştir.
1. Konu hazırlığı
- Erkek yetişkin Wistar sıçanları seçin (n = 12). Eğitim ve test protokolü başlamadan önce, üç günlük iklimlendirme için kafes başına dört kişilik gruplar halinde barındırın. Deney boyunca farelere suya ücretsiz erişim sağlayın. Oda sıcaklığını 20 °C ile 25 °C arasında, 12 saat açık-koyu bir döngü altında kontrol edin (07:00'de ışıklar açık).
NOT: Fare suşları korku koşullandırma sırasında diferansiyel performans göstermişti. Örneğin, Schaap et al. (2013) Wistar ve Lewis suşları Fawn Hooded ve Brown Norveç sıçanlar12ile karşılaştırıldığında donma davranış daha uzun süre gösterdi bildirdi . Bu nedenle, şokların yoğunluğunu ve süresini ayarlamak için ağrı ve termal eşik farklılıkları değerlendirilmelidir. - Her gün aynı saatte sınırlı gıda erişimi sağlayarak fareleri serbest beslenme ağırlıklarının %85'inde (350-400 g arasında normal ağırlıkta) koruyun. Işık döngüsü sırasında her gün aynı saatte fareleri tartın. Uzun süreli korku-koşullandırma eğitimi başlamadan önce üç gün boyunca reklam lib ağırlığını (%100 ağırlık) hesaplayın.
NOT: Bu deneyde kullanılan hayvanlar burada rapor edilmeyen ek enstrümental testler üzerinde test edilmiştir. Gıda yoksunluğu bu ek testler için gerekli oldu. Bu yordamsal varyasyon, enstrümantal korku kombine testler için potansiyel göstermektedir gibi, mevcut prosedürün kapsamını genişletmek olası olduğu varsayılır. Ancak, sadece korku klima testleri kullanarak çalışmalar gıda yoksunluğu gerektirmez. - Aşağıdaki gruplardan birine rastgele ders atamak: eğitimden 6 hafta sonra duygusal test (n = 6); eğitimden sonra 48 saat duygusal test (n = 6).
- Karanlık ışık döngüsünün ışık aşamasında, benzer saatlerde eğitim ve testler gerçekleştirin. Hayvanları aynı deney odasına atayın ve eğitim ve test sırasında aynı hayvan düzenini koruyun.
NOT: Uygulanabilecek ek bir kontrol, eğitim ve test aşamalarında hayvanların sırasını dengelemektir. Görev sırasının davranış üzerindeki olası etkisini azaltmak için, birden fazla grup değerlendirilirken veya denemeler arasında farklı görevler uygulandığında bu tekniği kullanmanızı öneririz.
2. Cihaz ayarı ve şok kalibrasyonu
- Deneysel haznenin ve paslanmaz çelik ızgara zeminin tüm iç yüzeylerini %10 etanol ile temizleyin. Her hayvanı test etmeden önce tekrarlayın.
- Donanımı USB kablosu kullanarak bilgisayara bağlayın ve donma algılama sistemi ekipmanını çalıştırın: CPU, kontrol kabini, kızılötesi ışık, öncü uyarıcı/ayarlayıcı ve şok yoğunluğu kalibratörü.
NOT: Bu protokol ticari olarak kullanılabilen araçlar(Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilmesine rağmen, farklı markaların ekipman ve yazılımları kullanılabilir. Cihaz plastik formik kaplı ahşap bir kutu içine gömülü bir iç akrilik kare oda (29,53 cm x 23,5 cm x 20,96 cm, deneysel oda denir) oluşur. Dış kapılar ses, gürültü veya ışık izolasyonuna izin verir (kutu kapılarını zayıflatır). Kamera yanal dış kapının iç kısmında yer almaktadır. Zemin metal ızgaraları ile iç akrilik kutu (36 paslanmaz çelik çubuklar, her biri 3 mm çapında ve aralıklı 8 mm, merkezden merkeze) ayak şoku teslim sağlar. İç-lateral duvarlardan birinde, bir hoparlör işitsel bir işaret sunmak için yerden 6 cm yer almaktadır. - Şok yoğunluğu kalibratörünün kırmızı ve siyah kliplerini (pozitif ve negatif konektörler) ızgara zeminindeki iki farklı çubuka bağlayın. USB kablosunu bilgisayarın ilgili bağlantı noktasına bağlayın. Kırmızı ve siyah klipleri başka bir çubukla ayrılmış çubuklara bağladıktan emin olun.
NOT: Bu bölümde, Malzeme Tablosu'ndabelirtilen belirli bir ekipman markasını kullanarak şok yoğunluğu kalibrasyon süreci açıklanmaktadır. Ancak, kalibrasyon işlemi ekipman farklı markalar kullanılarak yapılabilir. Tutarlı olduğunu doğrulamak için şebeke tabanının üç sektöründeki şokun yoğunluğunu ayarlaması önerilir. Buna ek olarak, her zaman şok teslimsırasında girişim önlemek için ızgara zemin den dışkı ve idrar artıkları kaldırın. - Şok yoğunluklu kalibratör yazılımını başlatın (Malzeme Tablosu). Aralık ok'una tıklayarak uygulamada 1,0 mA'lık bir yoğunluk seçin. Ardından Çalıştır/Durdur düğmesini Çalıştır olarak değiştirin.
NOT: Laboratuvar ve literatürümüzde kemirgen modelleri ile yaptığımız çalışmalara dayanarak 0,75 mA ile 1,5 mA arasında değişen bir yelpazeyi korku koşullandırma çalışmaları için yeterli olarak raporladığımız 1.0 mA'yı öneriyoruz33,34,35. - Şok edici uyarıcıyı veya ayak şoklarını teslim etmek için kullanılan ekipmanı açın ve uygulama panelinde görüntülenen şok yoğunluğuna bakın. Gerekirse, aversive uyarıcı üzerindeki düğümü kullanarak yoğunluğu 1,0 mA olarak ayarlayın.
NOT: Aversive uyarıcı uygun test etmek, kalibre etmek ve deneme çalıştırmak için "OUT" olarak ayarlanmalıdır.
3. Donma algılama sistemi kalibrasyonu
- Deney odasını ve ses zayıflatıcı kutu kapılarını kapatın. Dondurma algılama sistemi kalibrasyonu tamamlandıktan sonra odaya yerleştirilecektir gibi, bu noktada hayvan tanıtmayın. Kutunun içindeki ışık yoğunluğunun 20 ile 30 lux arasında olup olmadığını kontrol edin.
- Dondurma algılama sistemi yazılımını başlatın ve Deneme kurulum diyalog penceresini açın. Her konunun ayrıntılarını girin (konu kimlik numarası, tarih ve grup gibi) ve "Eğitim protokolü VFC.pro" (http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQadresinden kullanılabilir) başlıklı dosyayı yükleyin.
NOT: Bağlam ve işaret testleri farklı bir program yapılandırması kullanır; böylece, her testte doğru dosyayı kullandığınızdan emin olun. Bu noktada doğru dosya "Eğitim protokolü VFC.pro" karşılık gelir. Test aşamalarında ilgili dosyanın eğitim oturumundan farklı olacağını unutmayın. - İlgili kamera(lar)ı seçin ve Video Kaydet seçeneğini (gerekirse) işaretleyin. Hareket Eşiğini 100'e, Min Freeze Duration'ı 30 kareye ayarlayın.
NOT: Bu Hareket Eşik değeri kullanılan türün boyutuna bağlıdır (piksel sayısına göre). Minimum Donma Süresi değeri üretici tarafından önerilir. Bu değerler, odadaki hayvanın doğru şekilde tanınmasını sağlamak için kullanılır. - Seçilen kameradan(lar) canlı yayının, hareket eşik grafiği ve eğitim sırasında sunulan farklı uyaranların zaman çizelgesi (örn. ses ve şok) ile birlikte ekranda göründüğünü doğrulayın.
NOT: Farklı bir marka kullanarak, ekipman kurulumu hayvan hareket veya donma miktarı üzerinde karşılaştırmalar sağlayacak hareket bir "indeks" tespit etmek için hayvanın hareketlerini ölçmek için imkanı sunmalıdır. Başka bir olasılık sadece video kaynağı ile bir yazılım kullanıyor (sırasında veya deneme den sonra) hayvan hareket veya donma, özgür yazılım ImageFZ13gibi zaman miktarını algılayabilir, Matlab açık kaynak araç kutusu14, ya da JAABA15olarak hayvan davranışı ücretsiz bir sınıflandırıcı . - Hareket Endeksinin 100'ün (eşik) altında kalıp kalabileceğini kontrol ederken Üç kez Kalibrasyon seçeneğini tıklatın. Ardından, ekrandaki lock ilgili düğmeye tıklayarak ekipmanı kilitlenebün.
NOT: Bu bölümde, Malzeme Tablosu'ndalistelenen belirli bir ekipman markasını kullanarak bir dondurma algılama sistemi kalibrasyon işlemi açıklanmaktadır. Daha önce de belirtildiği gibi, kalibrasyon süreci ekipman farklı markalar kullanılarak yapılabilir (ekipman ve yazılım farklı seçeneklerin gözden geçirilmesi için Anagnostaras ve ark. 2010 bakın)16.
4. Genişletilmiş korku klima eğitimi
- Fareleri ev kafeslerinde, bezle kaplı hayvan bakım evinden laboratuvardaki davranış eğitim odasına taşıyın. Hayvanların davranışeğitim odasına taşınması sırasında gürültüye veya stres üreten koşullara maruz kalmaktan kaçının. Birkaç hayvan aynı anda taşınırsa, sadece test edilecek hayvanları getirmek ve deneysel kontrolü artırmak için bir bekleme odasında diğer fareler korumak. Yavaşça eğitimbaşlamadan önce 2 dakika boyunca hayvanları ele.
NOT: Protokolde hayvanlar davranış eğitiminden önce 2 dakika boyunca her gün ele alındı. Elleçlemenin ardından hayvanlar deneysel odaya alındı. Fareleri araştırmacıya alışmak için hayvanları manipüle etmeyi önerdik. - Fareyi deney odasına tanıtın. Kuyruğunun tabanından yavaşça tutve odanın ortasına yerleştirin. Deney odasını ve ses zayıflatıcı kutu kapılarını kapatın.
- Kaydet düğmesini tıklatarak oturumu başlatın. Fare 3 dakika boyunca odaya alışsın. Bu 3 dk süre ekipman üreticisi tarafından önerilen standarttır ve oda için bir temel ve alışma süresi olarak hizmet vermektedir.
- Oturumun 3. dakikasından itibaren 60'lı Denemeler Arası Aralıklı (ITI) ile yirmi beş ton-şok eşleşmesi (deneme) sunun. Her ITI'nin son 10 s'inde tonu (şartlı uyaran – CS; 90 dB SPL, 2000 Hz, 50 ms Rise Time) ve her ITI'nin son 2 s'i sırasında şoku (koşulsuz uyarıcı – ABD) sunun.
NOT: Kayıt düğmesinin etkinleştirmesi, kameraların düzgün bir şekilde kalibre edilmesi ve kilitlenmeleri koşuluna bağlıdır. - 28 dk oturumu bittiğinde sıçanı deney odasından çıkarın. Hayvanları ilgili ev kafesine geri döndürün. Davranış eğitim odasından bezle kaplı ev kafeslerindeki fareleri hayvan bakım merkezine taşıyın.
- Tüm denekleri eğitmek için donma algılama sistemi kalibrasyon (adım 3.1-3.5) ve korku koşullandırmasını (4.1 ve 4.3 adımları) tekrarlayın.
NOT: Yazılımın, dondurma algılaması için bilgileri işlerken aynı parametreleri koruduğundan emin olmak için her hayvan için algılama sisteminin yeniden ayarlanmasını şiddetle öneririz. - Dinlenme süresi: Bu dönemde hayvanların ev kafeslerinde ayrı ayrı dinlenmeleri gerekir. Kuluçka döneminin 6 haftası boyunca hayvanların ağırlığını haftada iki kez izleyin. Ağırlıkları iki dakika boyunca her hayvanı hafifçe manipüle edin.
5. Bağlam testi – tek 10 dk oturum
- Eğitim aşamasından sonra, bağlam testiolarak adlandırılan ilk bellek testi hayvanları maruz. Bu 10 dk aşamasında, fareleri eğitimin gerçekleştiği bağlamla teşrinedin ama ipuçları veya şoklar sunmayın. Fareleri kapalı ev kafeslerindeki (örn. bir bezle) hayvan bakım tesisinden davranış eğitim odasına taşıyın. Hayvanların gruplara ayrıldığını, böylece bir grubun eğitim aşamasından sonra 48 saat test edildiğini ve diğer grubun eğitimden 6 hafta sonra test edildiğini unutmayın (Bkz. Şekil 1).
Şekil 1: Deneyin zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Deneysel haznenin ve paslanmaz çelik ızgara zeminin tüm iç yüzeylerini %10 etanol ile temizleyin. Her hayvanı test etmeden önce tekrarlayın.
- Donma algılama sistemi kalibrasyonuna tekrarlayın (3.1-3.5. adım). Deneme kurulum iletişim penceresini açın ve http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ'den edinilebilen "Bağlam testi protocol.pro" adlı dosyayı yükleyin.
NOT: Bu dosya, hiçbir şok veya tonları oluşan bu deneysel aşama için kurulum içerir. - Hayvanı deney odasına tanıtın. Kuyruğunun tabanından yavaşça tutve odanın ortasına yerleştirin. Deney odasını ve ses zayıflatıcı kutu kapılarını kapatın.
- Kaydet düğmesini tıklatarak oturumu başlatın. Bu tek 10 dk bağlam-test oturumu sırasında, hiçbir uyaran (şok ne ses) sunulmaktadır.
- 10 dk oturumu bittiğinde konuyu deney odasından çıkarın. Hayvanları kendi kafeslerine götürün ve örtülü ev kafeslerindeki fareleri davranış eğitim odasından hayvan bakım merkezine taşıyın. Tüm konuları test etmek için 5.2-5.5 adımlarını tekrarlayın.
6. Cue testi – tek 13 dk oturum
- Bağlam testinden bir gün sonra, hayvanlar alamı testiolarak adlandırılan ikinci bellek testinden geçerler. Bu aşamada, sıçanlar 13 dakika boyunca eğitim farklı bir bağlamda olacak.; ipuçları (tonlar) sunulur, ancak hiçbir şok teslim edilir. Hayvan bakım tesisinden koruma yla kaplı ev kafeslerindeki fareleri davranış eğitim odasına götürün. Korku koşullandırma eğitiminden sonra bir grubu 72 saat test edin ve başka bir grubu 6 hafta ve eğitimden bir gün sonra testedin( Şekil 1 ).
NOT: Bağlam ve işaret testlerini daha fazla ayırt etmek için farklı bir ulaşım sistemi (hayvan bakım tesisinden deney odasına) uygulanabilir. Hayvanlar ev kafeslerinde eğitim oturumuna ve bağlam test oturumuna nakledildiklerinden, isteka testi oturumuna taşıma sırasında farklı bir taşıma kafesi, yatak takımları ve/veya kapak kullanılabilir. - Deneysel haznenin ve paslanmaz çelik ızgara zeminin tüm iç yüzeylerini %10 etanol ile temizleyin. Her hayvanı test etmeden önce tekrarlayın.
- Görsel bağlamı değiştirmek için, plastik çevreleyen duvarı deney odasına takın.
- Koku bağlamını değiştirmek için, pamuk uçlu bir bez için% 1 asetik asit uygulayın ve ızgara zemin17,18,,19altında metal tepsiye yerleştirin.
- Dondurma algılama sistemi kalibrasyonuna (3.1-3.5. adım) tekrarlayın. http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ'dantemin edilebilen "Cue test protocol.pro" dosyasını yükleyin.
NOT: Bu dosya, eğitim aşamasında (CS) sunulan aynı tonları teslim oluşan bu deneysel aşama için kurulum içerir, ancak şoklar (ABD) yokluğunda. - Hayvanı deney odasına tanıtın. Kuyruğunun tabanından yavaşça tutve odanın ortasına yerleştirin. Deney odasını ve ses zayıflatıcı kutu kapılarını kapatın.
- Kaydet düğmesini tıklatarak oturumu başlatın. Tek 13 dk işaret testi oturumu sırasında, CS uyarıcı (sesi) 10 kez sunulur, oturumun 3.
NOT: İlk 3 dakika bu oturumun temeline karşılık gelir ve ardından şok lar olmadığı nda 50 s ITI ile teslim edilen 10 işaret testi denemesi (yani her biri 10'ar s) gelir. Tonları teslim otomatik, daha önce yüklenen dosya kullanılarak. - 13 dk oturumu bittiğinde deney odasından hayvanı çıkarın. Hayvanları ilgili kafese geri götürün ve hayvan bakım merkezine götürün. Tüm konuları test etmek için 6.2 ile 6.5 adımlarını tekrarlayın.
7. Veri analizi
- Dondurma algılama sistemi yazılımını kullanarak video akışından türetilen genel etkinlik dizini (yani hareket dizini) edinin. Bu yazılım, oturum başına donma süresi ve donma bölüm sayısını sağlamak için hareket dizini otomatik olarak dönüştürür. Donma eşiğini sistemin varsayılan Minimum Donma Süresi ayarı (1 s = 30 kare) olarak ayarlayın.
- Elde etmek için ek özel leştirilmiş programı (http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ'dantemin edilebilen dosya) kullanın:
- Eğitim oturumunun ilk üç dakikasında (örneğin, temel donma, bu 3 dakika dan önce veya bu 3 dakika boyunca herhangi bir şok veya ton sunulmadığından) ve işaret testi oturumunun ilk üç dakikasında donma yüzdesini belirlemek için programı kullanın.
- Eğitim oturumunun sekiz 3 dakika lık kutularının her biri için dondurma yüzdesini belirlemek için programı kullanın.
- İşaret sunumları sırasında (örneğin, tonları sırasında donma) ve işaretsiz dönemleri (duruşmalar arası aralıklar) sırasında donma yüzdesini belirlemek için programı kullanın; ITIs), hem eğitim hem de işaret-test oturumları için.
- Bu verileri elde etmek için dondurma algılama sistemi yazılımını açın.
- Dosya Yı Seçin | Raporlar | Toplu Bileşen özeti.
- Uzantılı dosyayı seçin. CMP http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ'dan edinilebilir.
- Çıktı dosyasını adlandırın ve Hareket Eşiğini 100 olarak değiştirin. Ardından Tamam'ıtıklatın.
- Çözümlenecek dosyaları seçin (uzantı. HAM). Bu dosyalar, oturum bittiğinde ve her oturumun ham verilerine karşılık geldiğinde, donma algılama sistemi yazılımından otomatik olarak oluşturulur. Başlangıçta, dosyalar bilgisayarın masaüstüne kaydedilir, ancak analiz edilmeleri gerektiğinde sonraki kimliklerini ve açılışlarını kolaylaştırmak için özel bir klasörde (örneğin, Belgeler-Korku koşullandırması) depolanabilir.
- Çıktı dosyalarını açın (uzantı . CSV). Daha fazla analiz için bir elektronik tablo yazılımı düzenlenebilir. Bu dosya, deneme oturumu sırasında dondurma sonuçlarını içerir.
NOT: Toplam donma yüzdesini elde etmek için, öznenin toplam oturum süresi boyunca hareketsiz geçirdiği zamanı bölün. Donma bölümlerinin sayısı, oturum boyunca donma olaylarının sayısı na göre hesaplanabilir. Her iki durumda da, minimum donma süresine dayalı bir hareket eşiği tanımlamak gerekir. Bu, Bir Donma Bölümünün kaydedilip kaydedilemeyeceğini tanımlayan zamansal ölçütdür. Otomatik kayıt sistemleri, minimum donma süresinin bir ölçüsü olarak saniyede belirli miktarda kare (fps) kullanabilir. Örneğin, 30 fps bir örnek oranı ile, 15 kare minimum donma süresi 30 s için son hareketsizlik bir örnek dondurma olarak kaydeder.
- Her bir donma bölümünün ortalama süresini (eğitim ve her iki test, bağlam ve ipucu) toplam donma bölüm sayısına (saniye cinsinden) bölerek hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eğitim oturumunun farklı aşamalarında donma süresi yüzdesi ndeki değişimler bağımlı t testi kullanılarak tüm denekler için analiz edildi (n = 12)(Tablo 1). Hayvanlar aktifti ve eğitim oturumunun ilk üç dakikası (protokolün ilk günü), hiçbir tonu veya şokun (yani baseline-BL) teslim edildiği zaman boyunca deneysel odayı araştırdılar. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, sonraki 25 ton-şok eşleşmeleri sırasında donma süresi yüzdesi (M = 48,88; SE = 4.37) BL sırasından anlamlı olarak daha yüksekti (M = 14.65; SE = 4.05), hangi korku edinimi bir göstergesi olarak kabul edilir.
| İstatistik Testi | Şekil | Aşama | ||
| Bağımlı t Testi | 2a | t (11) = -6.21, p < .001, d = 2,34 | ||
| 3 dk kutular | ||||
| Tekrarlanan Önlemler ANOVA | 2B | F (3,75, 41,32) = 11,19, p < .001, ηp2 = .50. | ||
| Aşama | Grup | Aşama x grubu | ||
| Karışık ANOVA | 2C | F(3, 30) = 14,21, p < .001, ηp2 =.58 | F(3, 30) = 4,63, p < 0,05, ηp2 =.31 | F(1, 10) = 2,06, p >.05, ηp2 =.17 |
| Tek Yönlü ANOVA | 3a | F(1, 10) = 6.91, p < 0,05, ηp2 =.40 | ||
| Tek Yönlü ANOVA | 3B | F(1, 10) = 10,30, p < 0,05, ηp2 =.50 | ||
| Tek Yönlü ANOVA | 3C | F(1, 10) = 5.83, p <. 05, ηp2 =.36 | ||
| Karışık ANOVA | 4a | F(2, 20) = 29,28, p < .001, ηp2 =.74 | F(2, 20) = 2,33, p >.05, ηp2 =.18 | F(1, 10) = 2,14, p >.05, ηp2 =.17 |
| Karışık ANOVA | 4b | F(1, 10) = 1,53, p >.05, ηp2 =.13 | F(1, 10) = 3,98, p < 0,05, ηp2 =.28 | F(1, 10) = 0,23, p >.05, ηp2 =.02 |
| Karışık ANOVA | 4C | F(1, 10) = 25,43, p < .001, ηp2 =.71 | F(1, 10) = 6.17, p < 0,05, ηp2 =.38 | F(1, 10) = 0,22, p >.05, ηp2 =.02 |
Tablo 1: Veri analizinde kullanılan istatistikler. Şekil 2Aiçin, eğitim oturumunun ilk 3 dakikasında tüm deneklerin (n = 12) donma oranının ortalama yüzdesi (taban çizgisine karşılık gelen, BL) oturumun kalan 25 dakikasında (25 ton-şok denemesi) önemli bir fark ve büyük bir etki boyutu gösteren donma yüzdesi ile karşılaştırıldı(Cohen'in d = 2.34). Şekil 2Biçin, Tekrarlanan Önlemler ANOVA testinde (BL ve sekiz 3 dk kutu) önemli bir fark gösteren 3 dakikalık kutular arasında bir karşılaştırma yapılmıştır. Şekil 2Ciçin, temel (BL, eğitim oturumunun ilk 3 dakikası), eğitim dönemi (25 ton-şok eşleşmeleri), bağlam testi oturumu ve işaret testi oturumu sırasında her sıçan grubunun donma ortalama yüzdesi arasındaki karşılaştırmalar, denekler arası faktör grubu (48 saat veya 6 hafta) ve denekler in-subjects faktör aşamaları (BL, Eğitim, Test Bağlamı ve Cue Testi) ile Karma ANOVA üzerinden gerçekleştirilmiştir. Aşamalar ve grup farklılıkları, ancak etkileşim Aşamaları*Grup'ta bulunmadı. Şekil 3A – 3B etkinlik (panel 3A, hareket indeksi), donma (panel 3B, saniyecinsinden donma anlamına gelir) ve bölümlerin süresi (panel 3C, saniye cinsinden donma anlamına gelir) verileri gösterir. Bu veriler, tüm ölçümlerde gruplar arasındaki farklılıkları gösteren tek yönlü bir ANOVA kullanılarak analiz edilmiştir. Son olarak, Şekil 4A - 4C için her panel için karma ANOVA (A, B ve C), denekler arası faktör grubu (48 saat veya 6 hafta) ve özneler arası faktör aşamaları (BL, Eğitim, Bağlam Testi ve İşaret Testi) olan bir Karma ANOVA yapılmıştır.
Şekil 2: Genişletilmiş bir cued korku klima protokolü eğitim aşaması. Veriler, donma yanıtının ortalaması (çubuklar) ve SEM (hata çubukları) olarak gösterilir. (A) eğitim oturumunun ilk 3 dakikasında tüm deneklerin donma yüzdesini (n = 12) gösterir, bu süre zarfında şok veya tonları (temel, BL) ve seansın kalan 25 dakikası (25 ton-şok denemesi, denemeler arası aralıklı ITI, ITI, 60 s); = BL 'den farklıdır (p < .001). (B) 3 dk temel periyodu (BL, hiçbir şok veya tonları teslim) ve sonraki 3 dakika eğitim oturumu nun 3 dakika kutuları sırasında tüm hayvanların (n = 12) ortalama donma süresini gösterir; = kalan tüm kutulardan farklıdır (p < .001). (C)her sıçan grubunun donma yüzdesini (eğitimden sonra 48 saat test etme; eğitimden 6 hafta sonra test etme), temel (BL, eğitim oturumunun ilk 3 dakikası), eğitim süresi (25 ton-şok eşleşmeleri), bağlam test oturumu ve işaret testi oturumu; * = 48 h sonra test farklı (ortalama diffContext = -34,95, SE = 14,99, p < .05, Cohen's d = 1,34); a = eğitim döneminden farklı (ortalama diffTraining48h = 42,51; SE = 7.28; p < .05; Cohen'in d = 3.03); b = eğitim döneminden farklı (ortalama diffTraining6Weeks = 25,94; SE = 7.28; p < .05; Cohen's d = 1.77), bağlam testi(ortalama diffContext6Weeks = 50.36; SE = 10,58; p < .01; Cohen'in d = 3.13) ve işaret testi(ortalama diffCue6Weeks = 55.86; SE = 10,25; p < .01; Cohen'in d = 2.47). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Satın alma boyunca donma tepkisinin analizi, eğitim oturumunun sekiz 3 dk'lık kutularhalinde bölümlere ayırılmasıyla yapılmıştır(Şekil 2B). Bu veriler, bu yanıta ayrılan ortalama sürenin ilk üç ton şok denemesinde (yani Bin 1) asimptot'a yakın veya 180 s'ye ulaştığını göstermektedir. Bu bulgu önceki araştırmalarda aşırı eğitim bir göstergesi olarak kabul edilmiştir11. Tekrarlanan önlemler ANOVA, büyük etki boyutlarıyla taban çizgisi ve sonraki tüm kutular arasında tutarlı anlamlı farklar ortaya koymuştur(Tablo 1 ve Tablo 2).
| Karşılaştırma | Ortalama fark | Standart hata | p değeri | Cohen'in d |
| Bin taban çizgisi vs bin 1 | -60.075* | 12,243 | > 0,05 | 1.95 |
| Bin taban çizgisi vs bin 2 | -69.053* | 16,220 | > 0,05 | 1.89 |
| Bin taban çizgisi vs bin 3 | -66.197* | 13,706 | > 0,05 | 1.91 |
| Bin taban çizgisi vs bin 4 | -68.595* | 11,969 | > 0,05 | 2.08 |
| Bin taban çizgisi vs bin 5 | -65.475* | 10,991 | > 0,05 | 2.15 |
| Bin taban çizgisi vs bin 6 | -65.795* | 13,509 | > 0,05 | 2.06 |
| Bin taban çizgisi vs bin 7 | -72.900* | 12,231 | > 0,05 | 2.53 |
| Bin taban çizgisi vs bin 8 | -78.633* | 8,692 | > .001 | 3.37 |
Tablo 2: Şekil 2B'de3 dk'lık kutular için ortalama fark, standart hata ve efekt boyutu. Bu tablo, taban çizgisi kutusu ile sonraki kutuların her biri arasındaki karşılaştırmaları gösterir(Şekil 2B). Ortalama fark, standart hata ve p-değeri ve Cohen's d bu farkların (etki boyutu) boyutunun bir dizin olarak bildirilir.
Görev sırasında donma yüzdesi farklılıklarını test etmek için karma bir ANOVA, özneler arası faktör olarak aşamalara (BL, eğitim, bağlam testi ve işaret testi) sahip olmak için, özneler arası faktör olarak (48 saat ve 6 hafta) konular arasında faktör olarak yapılmıştır(Tablo 1). Eğitim döneminde tüm hayvanların donma yüzdesi temel periyoda göre anlamlı olarak yüksekti (Bkz. Şekil 2C). Bellek testleri sırasında donma yüzdesi ile eğitim süresi arasında anlamlı fark gözlenmedi(ps > 0,05).
Bl, eğitim ve isteka testi sırasında donma oranında iki grup (48 saat ve 6 hafta) arasında anlamlı fark gözlenmedi(ps > .115; bkz. Şekil 2C). Buna karşılık, eğitimden 6 hafta sonra test edilen hayvanlar, bağlam testi sırasında büyük bir etki boyutuna sahip, 48 saat test edilen hayvanlara göre önemli ölçüde daha yüksek donma yüzdeleri göstermiştir (Bkz. Şekil 2C). Genel olarak, Şekil 2C, uzun süreli gecikmeli bağlam ve işaret testlerinde (yani eğitimden 6 hafta sonra) donma noktasının eğitim seansı sırasındakinden genel olarak önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermektedir. Eğitimden sonra 48 saat test edilen hayvan grubunda ise tam tersi bir düşüş eğilimi gözlendi. Ancak, 48 h'lik gruptaki bu farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı değildi(ps > .05). Son olarak, donma düzeyi farklı aşamalar arasında farklılıklar gösterse de, diğer protokollere göre düşük olarak kabul edilebilir. Bir açıklama laboratuvarlar arasındaki metodolojik farklılıklar veya kalibrasyon işlemi sırasında kurulan hareket indeksi eşiği olabilir, bu da laboratuvarlar arasındaki verilerin karşılaştırılmasını zorlaştırabilir.
Bağlam testi sırasında iki grup deneğin koşullu donma tepkisi, diğer önlemlerin analizi ile daha da araştırıldı, yani ortalama aktivite (yani,hareket indeksi), toplam donma süresi ve bölüm başına donma süresi. Bu değişkenler arasındaki farklılıkları test etmek için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır(Tablo 1). Eğitimden 6 hafta sonra test edilen deneklerin aktivitesi, eğitim seansından sonra test edilen hayvanların kinden anlamlı olarak daha düşüktü(Şekil 3A). Buna göre, eğitimden kısa bir süre sonra test edilen hayvanların toplam donma süresi, 6 hafta sonra test edilen hayvanlarınkinden önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 3B). Son olarak, her donma bölümünün ortalama süresinin analizi, hayvanların eğitimden 6 hafta sonra test edilen hayvanların eğitimden sonra 48 saat test edilen hayvanlardan daha uzun donma atakları gösterdiğini göstermiştir(Şekil 3C). Bu bulgular korku kuluçka etkisi ne olduğunu gösteriyor.
Şekil 3: Farelerin donma tepkisi üzerinde genişletilmiş bir cued korku klima protokolü etkileri.
Veriler, donma yanıtının ortalaması (çubuklar) ve SEM (hata çubukları) olarak gösterilir. (A) bağlam testi sırasında her bir denek grubunun etkinliğini (örn. hareket indeksi) gösterir (eğitimden sonra 48 saat test; eğitimden 6 hafta sonra test); * = 6 haftadan farklı . (B) bağlam testi sırasında her bir denek grubunun ortalama toplam donma süresini (saniye cinsinden) gösterir; * = 6 haftadan farklı . (C) bağlam testi sırasında her bir denek grubu için her bir donma bölümünün ortalama süresini (saniye cinsinden) gösterir; * = sadece 6 haftafarklı . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İşaret testi oturumu sırasında performansın daha ileri bir incelemesi, (a) temel dönemlerde (BL Eğitimi ve BL Cue Testi) ve 10 dk'lık işaret testinin tamamında (on 10 s ton sunumları ve 50 s'lik on ITI - Şekil 4)donma yüzdelerinin analizleri yoluyla yapılmıştır. A ), (b) ortalama donma süresi özellikle 10 s sunumları sırasında (ton), hem Eğitim hem de Cue Test oturumları için(Şekil 4B),ve (c) ortalama donma süresi (saniye cinsinden) 50'lerin duruşma lar arası aralıkları sırasında (ITI; yalnızca tonsuz dönemler – Şekil 4C). Bu bağımlı önlemlerin her birini analiz etmek için karma bir ANOVA kullanıldı, aşamalar (BL Eğitimi, BL Cue Testi ve Cue Testi) özneler arası faktör ve gruplar (48 saat ve 6 hafta) olarak konular arasında faktör olarak kabul edildi(Tablo 1). Şekil 4A'dagösterildiği gibi, eğitimden 6 hafta sonra test edilen fare grubu, Cue Testi oturumunun temeli sırasında (BL Cue Testi; oturumun ilk 3 dakikası) ve 10 dakika Cue Testi sırasında, BL eğitimine (yani, tonlara ve şoklara maruz kalmadan önce) göre donma yüzdesini önemli ölçüde artırmıştır. 48 saat sonra test edilen sıçan grubu için BL eğitimi ile BL Cue arasında benzer bir fark gözlenmedi (p > 0,05). Her iki sıçan grubu için, 10 dk Cue Testi sırasında donma yüzdesi aynı oturumun (BL Cue Testi) ilgili temel döneminden daha yüksekti, bu da alma efektini göstermektedir. Farklı dönemlerde(ps > 0,05) donma yüzdesi ile sıçan grupları arasında herhangi bir fark gözlenmemiştir.
Şekil 4B, özellikle Eğitim (ton-şok eşleşmeleri) ve Cue Testi (yalnızca ton sunuları) genelinde 10'lu ton sunumları sırasında ortalama donma süresinin (saniye cinsinden) karşılaştırılmasını gösterir. Sadece fareler eğitimden 6 hafta sonra test edildi ler ve işaret sırasında donma süresini önemli ölçüde artırdılar.
Son olarak, Şekil 4C'degösterildiği gibi, eğitimden sonra test edilen sadece sıçan grubu 48 saat eğitim oturumundan Cue Testi'ne kadar ITI'ler sırasındaki donma süresini önemli ölçüde azalttı. ItIs sırasında donma süresi nde iki sıçan grubu arasında herhangi bir fark gözlenmedi(ps >.05).
Şekil 4: İşaret testi sırasında donma yanıtı üzerinde genişletilmiş bir cued korku klima protokolü etkileri.
Veriler, donma yanıtının ortalaması (çubuklar) ve SEM (hata çubukları) olarak gösterilir. (A) eğitim oturumunun ilk 3 dakikasında (BL, baseline), işaret testi oturumunun ilk 3 dakikasında (BL Cue) ve işaret testinin 10 dakikasında (Cue Testi) her bir deneğin donma yüzdesini (eğitimden sonra 48 saat test etme; eğitimden 6 hafta sonra test etme) gösterir; a = 48 h sonra Cue testinden farklı (ortalama diffBLTraining-Cue48h = 32,84; SE = 10,25; p < .05; Cohen'in d = 1.52); b = BL Cue Testi'nden farklı (ortalama diffBLCue-BL6Weeks = 33,98; SE = 8.36; p < .05; Cohen's d = 1.59) ve Cue Testi(ortalama diffCue-BL6Weeks = 55.86; SE = 10,25; p < .05; Cohen'in d = 2.47); c = 48 h sonra Cue Testi farklı (ortalama diffBLCue-Cue48h = 18,99; SE = 5.17; p < .05; Cohen'in d = .67); d = 6 hafta sonra Cue Testi'nden farklı (ortalama diffBLCue-Cue6Weeks = 21,87; SE = 5.17; p < .05; Cohen'in d = 0,88). (B) Eğitim ve İşaret Testi sırasında her bir denek grubunun istekası (sesi) sırasında ortalama donma süresini (saniye cinsinden) gösterir; * = Cue Testi'nin test döneminde 6 haftadan farklı (ortalama diffEğitim-Cue6Weeks = -3,14; SE = 1.37; p < .05; Cohen'in d = 1.64). (C)eğitim oturumunun (10 ton-şok eşleşmeleri) ve Cue Testi'nin (yalnızca 10 tonlu sunum) iki sıçan grubu (48 saat ve 6 hafta) arasında, duruşmalar arası aralıklar (ITI) sırasında ortalama donma süresini (saniye cinsinden) gösterir; = eğitimden sonra 48 saat test edilen sıçan grubu için Eğitimden farklı (ortalama diffTraining-Cue48h = 506.16; SE = 95,08; p < .001; Cohen'in d = 2.48). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut genişletilmiş korku-koşullandırma protokolü kısa (48 saat) ve uzun süreli (6 hafta) duygusal belleği değerlendirmek için etkili ve geçerli bir yaklaşımdır. Böylece protokol, farelerde aşırı eğitim ve korku kuluçka fenomenlerinin incelenmesine olanak sağlar. Bu protokolün farklı avantajları arasında şunlar yer alıyor. Bağlam ve işaret manipülasyonları arasında iki gecikmenin (48 saat ve 6 hafta) diferansiyel etkisini belirlemeye olanak tanıyan iki tür bellek testi, yani bağlam ve işaret sunar. İkinci olarak, görev de birkaç hafta uzatır uzun vadeli etkiler üreten tek bir 28 dakika eğitim oturumu gerektirir. Bu avantaj, uzun korku klima bazı sürümleri eğitim1110 oturumları arasında en az 100 şoklar ihtiyaç göz önüne alındığında, dikkat çekicidir. Üçüncü olarak, protokol otomatik olarak hesaplanan çeşitli ölçüm alternatifleri sunar. Buna ek olarak, duygusal hafıza olayları15,16değerlendirmek için bu paradigmanın geçerliliğini destekleyen farmakolojik, fizyolojik ve anatomik kanıtlar montaj vardır.
Kısa eğitim seansları (yani, birkaç deneme) ile diğer korku-klima paradigmaları ile karşılaştırıldığında, aşırı eğitim etkileri ile sonuçlanan genişletilmiş protokoller daha az dikkat almış. Ancak, genişletilmiş korku-klima görevleri diğer psikolojik olaylar (örneğin, gecikmiş başlangıçlı travma sonrası stres bozukluğu)11,12,13ile ilişkisi de dahil olmak üzere, korku kuluçka altta yatan davranışsal ve nörobiyolojik süreçlerin anlaşılması için anahtar olmuştur. Mevcut korku-klima protokolü güvenilir korku kuluçka üretir. Bu, eğitimden 6 hafta sonra değerlendirilen hayvanlarda daha yüksek donma süreleri ve daha düşük hareket indeksleri ile gösterilmiştir, eğitimden sonra test edilen hayvanlara kıyasla 48 saat. Buna ek olarak, bu etki test türlerinin her birinde farklı olarak görülebilir; özellikle, bağlam testi sırasında daha uzun donma bölümleri 6 hafta eğitim den sonra ve işaret sunumları sırasında donma artışlar 6 hafta eğitimden sonra. Bu ikinci etkiyle ilgili olarak (yani, eğitimden 6 hafta sonra işaret sunumları sırasında donma daki artışlar), aynı oturumdaki temel donma düzeyleri sonraki işaret sunumlarına göre önemli ölçüde daha düşük olduğundan, deneysel durumun (yani yeni bağlam) yeniliği atılabilir gibi görünmaktadır.
Her iki grupta da korku öğrenme eğilimi belirgin olsa da (örneğin, 3 dk taban çizgisi ve eğitim arasındaki farklar), 48 saat (bağlam) ve 72 saat (işaret) sonrasında test edilen hayvanlar her iki testsırasında da donma düzeyinde önemli farklılıklar sergilemedi. Bu, 48 h grubundaki yüksek davranışsal değişkenliğin sonucu gibi görünen protokolün bir sınırlaması olarak kabul edilebilir (Bkz. Şekil 2C). Değişkenliği azaltmak ve prosedürü iyileştirmek için uygulanabilecek metodolojik bir değişiklik, bazı korku koşullandırma prosedürlerinde yaygın olan eğitimden sonra bağlam ve işaret testini 24 saat yürütmektir.
Mevcut protokol klinik araştırmalarda uygulanabilir23. Uygulanması sonucu güçlü bellek izleme ve kuluçka etkisi düzenli psikolojik ve psikiyatrik patolojilerin tedavisi için kullanılan ilaçların etkilerini test etmek için izin verebilir (örneğin, anksiyolitik veya duygudurum düzenleyicilertedavileri 24) duygusal hafıza olayları (örneğin, korku yok olma)25,26,27. Protokol böylece farklı zaman dilimleri arasında bellek izi üzerinde ilaçların etkisini ölçmek için izin verebilir, nörotransmitter ve moleküller bellek bakımı ile ilgili gibi biyolojik ilişkili de dahil olmak üzere28,29. Protokol aynı zamanda korku paradigmaları davranışsal tedavilerin preklinik modelleri test etmek için yararlı olabileceğini önermiştir bir çeviri perspektifi ile araştırma için alaka olabilir30 ve türler arasında korku karşılaştırmalı çalışmalar21,22. Son olarak, bir nörobiyolojik görünümünden, mevcut protokol beyin mekanizmaları çalışmak için sağlam bir modeldir, yapılar arasındaki iletişim, ağlar veya uzun vadeli edinimi dahil nöronal topluluklar, konsolidasyon ve duygusal bellek depolama, ya da geliştirme sırasında kuluçka etkileri32.
Protokolün diğer bazı yönleri tartışmaya değer. Deney boyunca gıda yoksunluğu kullanıldı. Bu karar, gıda ödüllerine dayalı diğer davranıştestleri (örn. operant veya enstrümantal teknikler)33,,34,35 minimum değişikliklerle entegre edilebildiği için kabul edilmiştir, bu da mevcut protokolü daha çok yönlü bir teknik haline getirmiştir. Örneğin, bu protokolü tekerlek tabanlı egzersiz protokolleri ve T-labirent bellek görevleri ile başarıyla entegre ettik. Başka bir yönü grup boyutu (n=6) bu protokolde uygulanan ilgilidir. Nispeten küçük bir örnek olmasına ve daha büyük örnekler kesinlikle tavsiye edilmesine rağmen, kuluçka etkisinin boyutu bu sınırlamayı telafi eder (bkz. Tablo 1). Bu durum, özellikle hayvan komitelerinin azaltma ilkesine dayalı tavsiyeleri açısından bu protokolün bir avantajı olarak kabul edilebilir. Protokolün bir sınırlaması, ayak şoklarına en az maruz kalmanın ve korku kuluçka süresinin değerlendirilmesinin olmamasıydı. Daha önceki koşullara sahip ek bir kontrol grubu deneysel tasarımın sertliğini artırabilir.
Bu protokolün en iyi uygulanması ve sonuçları için son öneriler arasında deneysel odanın, özellikle ızgara tabanının doğru temizlenmesi, her bir konunun eğitiminden önce şok yoğunluklarının kalibrasyonu (örneğin, dışkı ve idrar genellikle odanın farklı alanlarındaki şok yoğunluğunun güvenilirliğini azaltır) ve donma algılama sisteminin kalibrasyonu (dondurma önlemlerinin güvenilirliği hareket eşiğinin doğru ayarlanmasına ve minimum donma süresine bağlıdır).
Bu protokol, diğer fare suşları veya diğer kemirgenlerle (örneğin, fareler veya Moğol gerbilleri) test edilebilebilir ve uygulamaların kapsamını genişletebilir. Bu gibi durumlarda, şok yoğunluğunu, hareket ve süre eşiklerini ayarlamak önemlidir. Fareler ile korku klima protokollerinde kullanılan şok yoğunluğu genellikle 0,4 mA ile 1,5 mA arasında değişmektedir, 0,75 mA genellikle bildirilen etkili yoğunluk16,36,37,38 ve 1,5 mA en yüksek bildirilen yoğunluk39. Moğol gerbil daha az sıklıkta korku klima araştırma için seçilen bir kemirgen modelidir; ancak, Moğol gerbils başarıyla memelilerde sirkadiyen ritimleri modellemek için kullanılmıştır40. Buna göre, mevcut protokol sirkadiyen ritimleri ve duygusal bellek arasındaki potansiyel ilişkileri incelemek için uygulanabilir, her ikisi de depresyon gibi patolojiler ilgili, anksiyete veya ruh hali nin değiştirilmesi41,42. Gerbils durumunda, bu ve benzer önkoşullandırma protokolleri için etkili bir şok yoğunluğu aralığı 1.0 ve 4.0 mA43,44,45,46arasındadır. Son olarak, hareket ve süre eşiklerinin seçilen türe bağlı olarak ayarlanması gerektiğini belirtmek önemlidir47. Bu eşikler, hayvan davranışının hareket olarak kayıtlı olduğu ve yazılımın donma kaydettiği hareket izleme yazılımında belirlenen sınırlardır. Fareler ve gerbiller ile önlenebilir klima çalışmalarında, etkili hareket ve süre eşikleri rapor 25 ve 30 fps (yani, en az 1 s hareketsizlik), sırasıyla30,35.
Aversif stimülasyon (footshocks) yeterli kontrol sağlamak için, ızgara zemin tüm sektörlerde aynı yoğunluğu teslim etmelidir. Tutarlı olduğunu doğrulamak için şebeke tabanının üç sektöründeki şokun yoğunluğunu ayarlaması önerilir. Bu, hayvanların daha düşük yoğunlukta yayan kutudaki bir yere taşınarak şoklara maruz kalmamayı öğrenmesini önler. Kalibrasyon metal ızgaranın tüm sektörlerde aynı yoğunluğu sağlamadığını gösteriyorsa, ızgarayı zeminden çıkarın, çubukları temizleyin ve haznedeki ızgarayı değiştirin. Izgara zemini, engeledici stimülasyon cihazından ızgara zeminine en iyi elektrik iletimini sağlamak için hazneye düzgün bir şekilde yerleştirilmelidir.
Dondurma algılama sistemi kameranın odak ve diyafram açıklığı üretici tarafından kalibre edilmiştir. Ancak, ek kalibrasyon gerekiyorsa, odak halkası üzerinde setscrew gevşetin, net bir görüntü elde edilene kadar ayarlayın ve daha sonra odak halkası üzerinde setscrew sıkın. Üretici, lensin maksimum açık pozisyonda açılmasını önerir. Bu ayarı elde etmek için, açılış halkasının beyaz noktasının lens namlusu üzerindeki 1,4 rakamıyla hizalandığından emin olun. Üretici kılavuzuna danışmak tavsiye edilir. Kameranın odağı ayarlanmışsa, ilgili yazılımı kullanarak kameranın kalibrasyonunun da gerçekleşmesi gerektiğini unutmayın. Kamera kalibrasyonu parlaklık, kazanç ve deklanşör ayarlaması gerektirir. Kamera kalibrasyon işleminde kesin talimatlar için üreticinin el kitabına başvurman önerilir.
Sonuç olarak, protokol kısa ve uzun vadeli dönemlerde duygusal hafızayı test etmek için izin verir ve uzun vadeli korku kuluçka üretir. Bu korku-kuluçka etkisi, 6 hafta sonra bağlam ve işaret testlerinde etkileri gösteren tek seanslı aşırı eğitim yoluyla oluşturulur. Bu güçlü bir duygusal hafıza izi olduğunu gösteriyor. Mevcut protokol farelerde duygusal bellek bileşenleri keşfetmek için etkili ve geçerli bir yaklaşımdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma için mali destek Fundación Universitaria Konrad Lorenz tarafından sağlanmıştır - hibe numarası 9IN15151. Yazarlar, özellikle Natalia Rivera ve Andrés Serrano (Yapımcılar) olmak üzere videonun kaydedilmesi ve düzenlenmesindeki yardımları için Konrad Lorenz Üniversitesi İletişim Bölümü'ne teşekkür etmek isterler. Ayrıca, Nicole Pfaller-Sadovsky ve Lucia Medina el yazması kendi yorumları için, ve Johanna Barrero, Corporacion Universitaria Iberoamericana dekan, kurumsal işbirliği için. Yazarların çıkar çatışması yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid (ethanoic acid) | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid | ||
| Aversive Stimulation Current Package | MED Associates Inc | ENV-420 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Contextual test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Cue test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Curved Wall Insert | MED Associates Inc | VFC-008-CWI | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Data processing.zip | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| NIR/White Light Control Box | MED Associates Inc | NIR-100 | |
| Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse | MED Associates Inc | ENV-005FPU-M | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Small Tabletop Cabinet and Power Supply | MED Associates Inc | SG-6080D | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) | MED Associates Inc | ENV-414S | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standard Fear Conditioning Chamber | MED Associates Inc | VFC-008 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Training protocol VFC.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Video Fear Conditioning Package for Rat | MED Associates Inc | MED-VFC-SCT-R | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
References
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nature Reviews Neuroscience. 6 (2), 119-130 (2005).
- Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P. W., Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learning & Memory. 15 (6), 426-433 (2008).
- Hermans, E. J., et al. How the amygdala affects emotional memory by altering brain network properties. Neurobiology of Learning and Memory. 112, 2-16 (2014).
- Moryś, J., Berdel, B., Jagalska-Majewska, H., ŁUczyńSka, A. The basolateral amygdaloid complex -its development, morphology and functions. Folia Morphologica. 58 (3), 29-46 (1998).
- LeDoux, J. E.
- Labar, K. S. Beyond fear: Emotional memory mechanisms in the human brain. Current Directions in Psychological Science. 16 (4), 173-177 (2007).
- Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C.
- Maren, S. Overtraining Does Not Mitigate Contextual Fear Conditioning Deficits Produced by Neurotoxic Lesions of the Basolateral Amygdala. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 3097-3097 (1998).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G.
- Morrow, J. D., Saunders, B. T., Maren, S., Robinson, T. E. Sign-tracking to an appetitive cue predicts incubation of conditioned fear in rats. Behavioural Brain Research. 276, 59-66 (2015).
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Adams-Deutsch, T., Nair, S. G., Shaham, Y. Long-lasting incubation of conditioned fear in rats. Biological Psychiatry. 65 (10), 881-886 (2009).
- Schaap, M. W. H., et al. Nociception and Conditioned Fear in Rats: Strains Matter. PLoS ONE. 8 (12), 83339 (2013).
- Shoji, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice. Journal of Visualized Experiments. (85), e50871 (2014).
- Patel, T. P., et al. An open-source toolbox for automated phenotyping of mice in behavioral tasks. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 349 (2014).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: Interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
- Anagnostaras, S. G. Automated assessment of Pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the VideoFreeze system. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 4 (58), (2010).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Impaired Trace and Contextual Fear Conditioning in Aged Rats. Behavioral Neuroscience. 120 (3), 612-624 (2006).
- Schuette, S. R., Hobson, S. Conditioned contextual fear memory to assess natural forgetting and cognitive enhancement in rats. Journal of Biological Methods. 5 (3), 99 (2018).
- Chang, C. H., et al.
- Pickens, C. L., Golden, S. A., Nair, S. G.
- Izquierdo, I., Furini, C. R. G., Myskiw, J. C.
- Vetere, G., et al. Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice Article Chemogenetic Interrogation of a Brain-wide Fear Memory Network in Mice. Neuron. 94 (2), 363-374 (2017).
- Koob, G. F., Zimmer, A. Chapter 9 - Animal models of psychiatric disorders. Neurobiology of Psychiatric Disorders. 106, 137-166 (2012).
- Bourin, M. Animal models for screening anxiolytic-like drugs: a perspective. Dialogues in clinical neuroscience. 17 (3), 295-303 (2015).
- Murray, S. B., et al. Fear as a translational mechanism in the psychopathology of anorexia nervosa. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 95, 383-395 (2018).
- Pamplona, F. A., et al. Prolonged fear incubation leads to generalized avoidance behavior in mice. Journal of Psychiatric Research. 45 (3), 354-360 (2011).
- Török, B., Sipos, E., Pivac, N., Zelena, D. Modelling posttraumatic stress disorders in animals. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 90, 117-133 (2019).
- Bhakta, A., Gavini, K., Yang, E., Lyman-Henley, L., Parameshwaran, K. Chronic traumatic stress impairs memory in mice: Potential roles of acetylcholine, neuroinflammation and corticotropin releasing factor expression in the hippocampus. Behavioural Brain Research. 335, 32-40 (2017).
- Uniyal, A., et al. Pharmacological rewriting of fear memories: A beacon for post-traumatic stress disorder. European Journal of Pharmacology. , 172824 (2019).
- Barad, M. Fear extinction in rodents: basic insight to clinical promise. Current Opinion in Neurobiology. 15 (6), 710-715 (2005).
- Haaker, J., et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 107, 329-345 (2019).
- Heroux, N. A., Horgan, C. J., Pinizzotto, C. C., Rosen, J. B., Stanton, M. E. Medial prefrontal and ventral hippocampal contributions to incidental context learning and memory in adolescent rats. Neurobiology of Learning and Memory. 166, 107091 (2019).
- Rossi, M. A., Yin, H. H. Methods for Studying Habitual Behavior in Mice. Current Protocols in Neuroscience. 60 (1), 8-29 (2012).
- Brady, A. M., Floresco, S. B. Operant Procedures for Assessing Behavioral Flexibility in Rats. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Zoccolan, D., Di Filippo, A. Methodological Approaches to the Behavioural Investigation of Visual Perception in Rodents. Handbook of Behavioral Neuroscience. , Elsevier B.V. (2018).
- Lguensat, A., Bentefour, Y., Bennis, M., Ba-M'hamed, S., Garcia, R. Susceptibility and Resilience to PTSD-Like Symptoms in Mice Are Associated with Opposite Dendritic Changes in the Prelimbic and Infralimbic Cortices Following Trauma. Neuroscience. 418, 166-176 (2019).
- Li, Q., et al. N-Acetyl Serotonin Protects Neural Progenitor Cells Against Oxidative Stress-Induced Apoptosis and Improves Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus Following Traumatic Brain Injury. Journal of Molecular Neuroscience. 67 (4), 574-588 (2019).
- Pantoni, M. M., Carmack, S. A., Hammam, L., Anagnostaras, S. G. Dopamine and norepinephrine transporter inhibition for long-term fear memory enhancement. Behavioural Brain Research. 378 (112266), 112266 (2020).
- Smith, K. L., et al. Microglial cell hyper-ramification and neuronal dendritic spine loss in the hippocampus and medial prefrontal cortex in a mouse model of PTSD. Brain, Behavior, and Immunity. 80, 889-899 (2019).
- Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Models and Experimental. 2 (2), 127-131 (2019).
- Landgraf, D., McCarthy, M. J., Welsh, D. K. The role of the circadian clock in animal models of mood disorders. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 344-359 (2014).
- Refinetti, R., Kenagy, G. J. Diurnally active rodents for laboratory research. Laboratory annimals. 52 (6), 577-587 (2018).
- Hurtado-Parrado, C., et al. Assessing Mongolian gerbil emotional behavior: effects of two shock intensities and response-independent shocks during an extended inhibitory-avoidance task. PeerJ. 5, (2017).
- Frey, P., Eng, S., Gavinf, W.
- Woolley, M. L., Haman, M., Higgins, G. A., Ballard, T. M. Investigating the effect of bilateral amygdala lesions on fear conditioning and social interaction in the male Mongolian gerbil. Brain Research. 1078 (1), 151-158 (2006).
- Ballard, T. M., Sänger, S., Higgins, G. a Inhibition of shock-induced foot tapping behaviour in the gerbil by a tachykinin NK1 receptor antagonist. European Journal of Pharmacology. 412 (3), 255-264 (2001).
- Luyten, L., Schroyens, N., Hermans, D., Beckers, T. Parameter optimization for automated behavior assessment: plug-and-play or trial-and-error. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8 (28), (2014).
